Yenidoğan Pial Yüzey Elektroporasyon

Bu prosedürün genel amacı, soyulmuş yüzey nöral progenitörlerini genetik olarak etiketlemek ve manipüle etmektir. Bu, önce plazma DNA çözeltisi ile doldurulmuş bir cam pipetin kabuk yüzey bölgesine sokulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, DNA'yı kabuk yüzeyinin üzerinde yer alan meningeal boşluğa enjekte etmektir.

Daha sonra, elektrotlar, soyma yüzeyine uygun şekilde akım verecek şekilde yönlendirilir. Son adım, DNA'nın akım uygulanarak soyulmuş yüzey progenitörlerine elektropore edilmesidir. Sonuç olarak, bu yöntem, soyma yüzeyinin, nöral progenitör proliferasyonunun, göçün ve/veya farklılaşmanın doğal tarihini ve moleküler belirleyicilerini göstermek için diğer tekniklerle birleştirilebilir.

Bu tekniğin viral transdüksiyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları, elektroporasyonun daha güvenli, daha esnek olması ve virüs parçacıklarının veya paketlemenin oluşturulmasını gerektirmemesidir. Bu yöntem, nöral kök ve progenitör hücreler alanında, bu soyulma yüzeyi progenitörlerinin dokuya, histo oluşumuna ve nöral devre fonksiyonuna katkısı gibi temel soruları cevaplayabilir. Başlamak için, cam kılcal borulardan pipetler oluşturmak için bir pipet çektirmesi kullanın, bir kez çekildikten sonra ucu keskin bir makasla kesin.

Ardından, filtrelenmiş nükleaz içermeyen su kullanarak %1 hızlı bir yeşil stok çözeltisi hazırlayın. Endotoksin içermeyen plazma DNA faizi EDTA tamponunu seyrelttikten sonra, uygun oranlarda% 1 hızlı yeşil çözelti ile birleştirin. Standart bir pipet kullanarak, referans olması için bir parça parafin balmumu filmine enjekte edilecek istenen miktarda plazmit karışımını yerleştirin.

Daha sonra, bir mikro enjektör kullanarak, monte edilmiş cam pipeti plazmit karışımını içeren tüpe dikkatlice yerleştirin. Kırılmayı önlemek için ucu tüpün kenarlarına dokunmaktan kaçının. Aktarma kadranını yavaşça geri çevirerek çözeltiyi pipete aspire edin.

Yeterli bir hacim yüklendikten sonra, basınç nötr konum olan sıfıra dönene kadar ileri çevirin. Hektor Pascal. Ardından, ucu referans enjeksiyonun yanına yerleştirin ve bir hacmi çıkarmak için mikro enjektörden ayak pedalını kullanın.

Miktar önceden pipetlenmiş referans hacmine eşit olana kadar basıncı ayarlayın. Enjeksiyon hacmini kalibre ettikten sonra, hayvanları plazmit enjeksiyonu için alın. Anestezi derinliği onaylandıktan sonra, daha az baskın olan elin başparmağını ve işaret parmağını kullanarak yavruyu tutun.

İstenilen bölgeyi hedeflemek için baskın eli kullanın, kortikal hemisferler ve superior colliculi gibi diğer yüzeysel yapılar kolayca görülebilmelidir. Doğru konum belirlendikten sonra, pipeti cildi ve kafatasını geçecek şekilde yerleştirin. Serebral arterlerden kaçınmaya özen göstermek.

Soyma yüzeyini hedeflemek için pipeti ilerletmeyi hemen durdurun Pipet ucu doğru konumdayken kafatasına nüfuz eder etmez, mikro enjektörün ayak pedalını kullanarak plazmit solüsyonunu enjekte edin Enjeksiyondan sonra pipeti dikkatlice çıkarın. Ucun parafin film üzerinde bulunan test damlacıklarına yerleştirerek enjeksiyonlar arasında kurumasını ve tıkanmasını önleyin. İletkenliği artırmak ve cildin yanmasını önlemek için tüm yavrulara enjekte edilene kadar bu adımları tekrarlayın.

Üç milimetre platin cımbız TRO'sunu elektroporasyon jeli ile örtün. Ardından, kortekse enjeksiyonlar için elektro ayarları yapın. Negatif yüklü probu enjekte edilen alanın üzerine ve pozitif yüklü probu gözün altındaki karşı bölgenin etrafına yerleştirin.

Elektrot oryantasyonu, orta hatta göre 45 ila 60 derecelik bir açıda olmalıdır. Akımı tetiklemek için ayak pedalını kullanın ve cımbız TRO'larını üç ila beş darbe için yerinde tutun. Yavrunun yaşına ve kilosuna bağlı olarak, bakliyatlar DNA'yı alttaki kabuk yüzey hücrelerine hedeflemelidir.

Negatif kutup enjeksiyon alanı üzerine süpürülebilir. Elektroporasyondan hemen sonra elektro alanı artırmak için darbeler arasında veya daha büyük bir elektrot kullanılabilir, jeli yavrulardan dikkatlice temizleyin ve yaklaşık beş dakika boyunca bir ısı lambasının altına yerleştirin. Yavrular, siyanoz nedeniyle elektroporasyondan sonraki dakikalarda doğal kırmızımsı serçe parmaklıklarını akut bir şekilde kaybedeceklerdir.

Yavruları kafeslerine geri döndürmeden veya superior kolusa enjekte etmeden önce doğal rengin geri kazanılması ve normal hareketin başlaması için gözlemleyin. Hedef bölgeyi Lambda'nın hemen arkasında ve yanlarında ve kabaca orta hatta yerleştirin, az önce gösterilen adımların aynısını izleyin. Başarılı enjeksiyonlarla, plazmit karışımı doğal olarak superior kolusun kıvrımlarını doldurur.

Superior kolus enjeksiyonlarından sonra elektro çalışırken, elektrotun negatif yüklü probunu enjekte edilen alanın üzerine ve pozitif yüklü probu göz, burun veya çene çevresine yerleştirin. Bu durumda, elektrot oryantasyonu orta hatta göre 25 ila 40 derecelik bir açıdadır. Bu görüntü, floresan raportör plazmitlerin elektroporasyonundan sonra dorsal lateral korteksi göstermektedir ve zarı yeşil renkte etiketli yonca ve bfp etiketini ifade etmektedir.

Burada kırmızı sahte renkli olarak gösterilen iki nükleer protein. Bu kortikal inter nöronda, elektroporasyondan yaklaşık iki ay sonra geniş dendritler bulunur. EGFP pozitif hücreler BRDU pozitiftir, bu da elektroporasyon prosedürü sırasında çoğaldıklarını gösterir.

Bu tekniği denerken, altta yatan korteks ve/veya damar sisteminin bozulmasını önlemek için kabuk yüzeyinin uygun şekilde hedeflenmesine odaklanmak önemlidir.