3-Boyutlu Histoloji hacmi ve Fare meme bezlerinin Eğitim için onun Uygulama İmar

Aşağıdaki videonun genel amacı, meme hücresel makro yapısındaki değişiklikleri incelemek için üç boyutlu histolojiye yönelik bir görüntü kayıt yaklaşımı ve hacim rekonstrüksiyonu sunmaktır. Bunu gerçekleştirmek için, vahşi tip ve insülin benzeri büyüme faktörü bağlayıcı protein yedi, IGF BP seven null farelerden, laktasyon başlangıcından üç gün sonra meme bezleri eksize edilir. Bezler daha sonra işlenir ve kesit almak üzere parafin bloklara gömülür.

Ardından, doku bloklarının optik blok yüzü görüntüleri yakalanır ve doku bloğu kesitlere ayrılır. Kesitlerin görüntüleri alınır ve özel bir yazılım kullanılarak, meme bezinin histoloji hacmini yeniden oluşturmak için her kesit karşılık gelen blok yüzü görüntüsüyle hizalanır. Elde edilen veriler, mutant ve yabani tip bezlerdeki boyut farklarını vurgulamaktadır.

Bu tekniğin, üç boyutlu konfokal iki katlı mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok daha geniş bir mekansal kapsamda bilgi sağlamasıdır. Bu yöntem, farklı organların 3B yüksek çözünürlüklü analizlerini oluşturmanın yanı sıra, volumetrik tıbbi görüntüleme ve tedavilerdeki yeni tekniklerin ve algoritmaların araştırılması ve doğrulanması için de kullanılabilir. Rekonstrükte edilen bu histoloji hacmi, yayılmış bir kayıt hatası olmaksızın, işlem gören örneğin güvenilir bir temsilini sunar.

Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, IGF P seven null farelerin daha küçük batın boyutlarına sahip olduğunu ve birden fazla büyük batını besleyemediklerini fark ettiğimizde ortaya çıktı, bu nedenle meme bezlerinin yapısını incelemeye karar verdik. Doku parafine gömüldükten sonra, fazla parafin temizlenene kadar bloğu düzeltmek için döner bir mikrotom kullanın. Ardından, dikey bir frezeleme makinesi kullanarak, parafin bloğunun en az iki köşesine, kaset montajına dik olacak şekilde bir milimetrelik delikler açın ve doku bloğunu döner mikrotoma yerleştirin.

Ardından, mikrotomun önünde blok yüzey görüntüleme sistemini kurmak için, doku bloğunun yüzeyine hafif bir açıyla konumlandırılmış tele lensli bir kamera yerleştirin. Kamera, mikrotomun önündeki bir bilgisayara bağlı olmalıdır. Daha sonra, kameranın bloktan gelen ışık yansımasını yakalayacağı şekilde bloğun önüne bir ışık kaynağı yerleştirin.

Blok yüzeyindeki doku, çevredeki parafinden kolayca ayırt edilene kadar kamera açısını ayarlayın. Bir adet optik blok yüzü görüntüsü alın. Ardından, mikrotom kullanarak beş mikron kalınlığında, dört kesitten oluşan şeritler kesin.

Şeritleri soğuk su banyosuna aktarın, şeridin kesitlerini birbirinden ayırın, ardından ikinci ve dördüncü kesitleri soğuk sudan alarak bir lama yerleştirin. Kırışıklıkları gidermek için bunları sıcak su banyosuna aktarın. İkinci ve dördüncü kesitlerin seçilmesi, kesitler arasında beş mikronluk bir boşluk sağlar.

Kırışıklıklar giderildikten sonra, kesitleri kepçeleme yöntemiyle mikroskop lamlarına yeniden monte edin. Daha önce belirtildiği gibi; kesme, montaj ve kırışıklık giderme işlemlerinin yırtılma, katlanma, büzülme ve genişleme gibi bazı distorsiyonlara neden olabileceğini unutmayın. Bu artefaktlar, histoloji kesitlerinin kaydedilmesini zorlaştırır.

Kesitleri otomatik bir boyama cihazı kullanarak h ve d ile boyayın. Ardından, lamları otomatik bir lam kapatma cihazı ile kapatın ve dijital bir histoloji lam tarayıcısı kullanarak lamları istenen çözünürlükte dijitalleştirin. Bu protokol için büyütme 20 x ve çözünürlük 0.47 mikron'dur.

Videonun bu bölümü, laboratuvarımızda geliştirilen özel yazılımın MATLAB c plus plus ile birlikte kullanılarak gerçekleştirilen görüntü kayıt sürecine genel bir bakış sunmaktadır. ITK kullanarak, histoloji görüntülerinin alt örneklemesini blok yüzü görüntülerinin çözünürlüğüne getirerek başlayın. Bu işlem, histoloji görüntülerini 0,026 faktöründe küçültecektir.

Ardından, görüntü segmentasyonu ve nokta seçimi için MATLAB'da birkaç blok yüzü görüntüsü açın ve kayıt deliklerinin piksel değerlerini ölçmek için veri imleci (data cursor) aracını kullanın. Kayıt deliklerini segmente etmek için ortalama piksel değerini sabit bir eşik değer olarak kullanın. Fazladan oluşan segmentleri temizlemek için, delikleri korumak ve ek segmentleri çıkarmak amacıyla segmente edilen nesnelerin daireselliği ve alan değerlerini kullanın.

Ardından, her bir meme bezi için bir blok yüzü görüntüsünü referans olarak seçin. Bloğun geri kalan yüzü görüntülerindeki kayıt deliklerinin merkezlerini, referans görüntünün kayıt deliklerinin merkezleriyle hizalayın. Daha sonra, kayıt delikleri için elde edilen dönüşümleri kullanarak blok yüzü görüntülerini hizalayın; hizalanmış blok yüzü görüntüleri için h ve d kesitlerindeki dokuyu arka plandan manuel olarak bölütleyin veya çıkarın.

Histoloji görüntülerini arka plandan ayırmak ve ikili maskeler oluşturmak için OSU eşiği tekniğini kullanın. Ardından, etiketlenmiş nesnelerin histogramını kullanarak her maskedeki en büyük nesneyi belirleyin ve seçin. Hem histoloji hem de blok yüzü maskelerinden bir piksel genişliğindeki sınır noktalarını çıkarın.

Ardından, histoloji sınır noktaları ile bunlara karşılık gelen blok yüzü görüntüleri arasındaki başlangıç rijit dönüşümünü bulmak için bir Fourier tanımlayıcılar algoritması kullanın. Bu başlangıç dönüşümü; öteleme, döndürme ve ölçekleme faktörlerini içerir. Her bir histoloji görüntüsünü, önceki adımda elde edilen başlangıç dönüşümü ile dönüştürün.

Rijit kaydırmayı hassaslaştırmak için, yuvarlanan top (rolling ball) filtresi kullanarak histoloji konturundaki yüksek eğrilikli kenar bölümlerini kaldırın. Ardından, tekdüze dağılım kullanarak kalan histoloji sınır noktaları arasından rastgele 500 nokta seçin. Histoloji sınır noktalarını, Fourier tanımlayıcılarından elde edilen ilk dönüşümle dönüştürün.

Blok yüzey sınır noktalarını kullanın ve blok yüzey sınır noktaları ile histoloji arasındaki rijit dönüşümü bulmak için yinelemeli en yakın noktalar (iterative closest points) algoritmasını uygulayın. Rastgele sınır noktaları. Ardından, 3D görselleştirme yazılımında histoloji hacminin görsel bir görüntüsünü oluşturmak için önceki adımda elde edilen histoloji görüntülerini dönüştürün.

Me vis lab'da, modüller arasından "file miscellaneous" seçeneğine gidin ve "composed 3D from 2D files" modülünü ekleyin. Ardından menüden "image" seçeneğini seçin ve "image property convert" modülünü ekleyin. Son olarak, "modules visualization 3D viewers" kısmından bir "view 3D" modülü ekleyin.

Görüntüleri yüklemek için 2D dosyalardan 3D oluştur seçeneğine çift tıklayın ve 3D oluştur'a tıklayın. Görüntü özelliği dönüştür seçeneğine çift tıklayarak voksel boyutunu ayarlayın ve voksel boyutunu 0.018 0.018 0.01 olarak belirleyin. 3D görüntüle seçeneğine çift tıklayarak hacmi görüntüleyin.

Son olarak, ekteki belgedeki adımları izleyerek görüntü yığınını beş x büyütmede görüntüleyin. I-G-F-B-P seven null farelerdeki eksikliği daha iyi karakterize etmek için, meme bezlerinin 3D rekonstrüksiyonu burada açıklanan şekilde gerçekleştirilmiştir. Bu şekiller, vahşi tip ve null meme bezlerinin rekonstrükte edilmiş histoloji hacimlerini göstermektedir.

Sağdaki mutant bezin, soldaki yabanıl tipe göre daha kısa ve dar olduğuna, ancak derinliğinin yabanıl tip bezde 1,06 milimetre ve null bezde 1,02 milimetre ile yaklaşık olarak aynı olduğuna dikkat edin. Ayrıca, soldaki yabanıl tip bezlerde pembe eozin boyamasının gösterdiği stromal dokunun az olduğunu, sağdaki null bezlerin ise ağırlıklı olarak stromal dokudan oluştuğunu fark edin. Burada, çekirdekli hücreleri belirleyen hematoksilen boyaması, yabanıl tip bezin öncelikle bez yapıları içerdiğini, null bezin ise yoğunluğunu koruduğunu göstermektedir.

Bunu daha detaylı incelemek için, lenf düğümünün bu bölgesine ait daha yüksek çözünürlüklü görüntüler burada hizalanmıştır. Sütle dolmuş olması beklenen büyük yapılar görülmektedir. Buna karşılık, I-G-F-B-P seven null bezinde ise gelişmiş yapıların sayısı azdır.

Dahası, bu yapılar fibroblast benzeri hücrelerle doludur. Bu videoyu izledikten sonra, tarama seri kesitlerinin yeniden oluşturulması yoluyla bir organın 3D rekonstrüksiyonunun nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Güzel. Şimdi, bu prosedürü denerken, hem slaytların hem de taramaların sayısı çok fazla olacağı için bunları tutarlı bir şekilde adlandırmayı hatırlamanız önemlidir; çünkü bu prosedürü takip ederken başarının anahtarı ardışık organizasyondur.

Damarlanmanın bir tümöre nasıl nüfuz ettiği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, spesifik hücre ve hastalık belirteçleri için immünohistokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir.