Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bozulmamış tütün yapraklarında ifade edilen iki proteinin etkileşimini izlemektir. Bu, uygun yapılar tasarlayarak, floresan proteinleri ayırmak için ilgilenilen iki geni kaynaştırarak ve bu yapıları tarımsal bakterilere dönüştürerek elde edilir. İkinci adım olarak, agro bakteri kültürleri karıştırılır ve tütün yapraklarına enjekte edilir, bu da proteinlerin ekspresyonuna ve sulandırılmış bir floresan sinyaline yol açar.

Proteinler birbirine yaklaşırsa, daha sonra ya tüm yapraklar ya da izole edilmiş protoplastlar mikroskop altında analiz edilir. Floresan mikroskobu ile tespit edilen yayılan floresan sinyaline dayalı olarak protein protein etkileşimlerini gösteren sonuçlar elde edilir. Kor immünopresipitasyon veya maya gibi mevcut yöntemlerin bu tekniğinin hibrite temel avantajı, protein protein etkileşiminin canlı bitki hücresinde doğrudan izlenebilmesidir.

Bu yöntem, çeşitli hücresel bölmelerde protein komplekslerinin oluşumu gibi bitki biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu işleme başlamak için, tütün yapraklarının dönüşümü için kullanılacak agro bakterileri büyütün. Uygun antibiyotikleri içeren 10 mililitre LB besiyerini, 50 mililitrelik steril bir tüpte ilgilenilen plazmidi içeren 50 mikrolitre AG L bir gliserol stok kültürü ile aşılayın.

En az 24 saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin, ertesi gün kültür 1.0 ile 2.0 arasında bir OD 600'e ulaşana kadar 190 RPM'de çalkalayın. Bakterileri 15 dakika boyunca 3000 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatan resüsü attıktan sonra, peleti yeni yapılmış infiltrasyon ortamında askıya alın ve süspansiyonu OD 600 / 1.0'a ayarlayın.

Tütün yapraklarının sızması için agro bakteri hücrelerini karanlıkta oda sıcaklığında iki saat boyunca bir baş üstü çalkalayıcıda inkübe edin. Üç haftalık bir tütün bitkisinden birkaç eski yaprak seçin. Eşit hacimleri karıştırın.

İlgilenilen yapıları taşıyan tarımsal bakterilerin her biri üç mililitredir. Hücre süspansiyonunu tütün yapraklarına sızmak için beş mililitrelik bir şırıngayı iğnesiz hücre süspansiyon karışımıyla doldurun. Yaprakların alt tarafındaki şırıngayı birkaç yerde dikkatlice bastırın, bitkileri sulayın ve iki gün boyunca kapalı ve ışıktan koruyun.

Protoplastları sızmış bir yapraktan izole etmek için, önce yaprağı bir Petri kabına koyun ve taze hazırlanmış bir enzim çözeltisi ekleyin. Yeni bir tıraş bıçağı kullanarak yaprağı yaklaşık 0,5 santimetre kare büyüklüğünde parçalar halinde kesin. Daha sonra, enzim çözeltisi ile yaprak parçalarını bir vakuma aktarın.

Sızma şişesi. Yapraklardan hava kabarcıkları çıkana kadar yaklaşık 20 saniye vakumla sızın. Vakumu çok dikkatli bir şekilde serbest bırakın.

Şişeyi 90 dakika sonra karanlıkta oda sıcaklığında 40 RPM'de 90 dakika çalkalayın. 90 RPM'de bir dakika çalkalayarak protoplastları serbest bırakın. Çözeltiyi gazlı bezden 15 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir santrifüj tüpüne süzün.

Protolast çözeltisini iki mililitre FPCN tamponu ile kaplayın ve oda sıcaklığında yavaş hızlanma ve yavaşlama ile 70 kez G'de 10 dakika santrifüjleyin. Sağlam Protoplastlar, enzim çözeltisi ile FPCN arasındaki arayüzde birikecek, geniş bir delik kullanarak, bir mililitrelik pipet ucu, sağlam protoplastları yeni bir santrifüj tüpüne aktaracaktır. Bu prosedürün başarısı için, sağlam protoplastların yırtılmasını önlemek için her zaman beyaz orifis uçları kullanın.

Tüpü, yavaş hızlanma ve yavaşlama ile 100 kez G'de iki dakika boyunca W beş tampon santrifüjü ile doldurun. Protoplastları peletlemek için, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti yeniden süspanse edin. Protoplast miktarına bağlı olarak yaklaşık 200 mikrolitre W beş tampon içinde.

Lazer tarama mikroskobu için bir protoplast numunesi hazırlamak için, ilk adımda, bir mikroskop lamı üzerinde yaklaşık iki santimetre aralıklarla iki küçük dolgu macunu şeridi. Şeritler arasına 20 mikrolitre protoplast çözeltisi yerleştirin ve üstüne dikkatlice bir kapak camı yerleştirin. Sızdırmazlık şeritleri, protoplastların kapak camı tarafından ezilmesini önleyecektir.

Lazer tarama mikroskobu için toplam bir yaprak örneği hazırlamak için, yapraktan bir santimetrelik bir parça kesin ve yaprağın alt tarafı yukarı bakacak şekilde bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Yaklaşık 30 mikrolitre su ekleyin. Üstüne bir kapak camı yerleştirin ve her iki taraftan yapışkan bantla sıkıca sabitleyin.

Büyütme için MICCA tip TCS SP beşten konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntüleme yapılır. Görüntüleme ortamı olarak gliserol ile 63 x büyüklüğünde bir objektif lens kullanın, değerlendirme için Leica uygulama paketi gelişmiş floresan yazılımını kullanın. Argonne lazerini %30'a ve 488 nanometredeki lazer gücünü %18 yoğunluğa ayarlayın515 nanometrede sinyali izlemek için ilk PMT dedektörü emisyon bant genişliğini 495 ila 550 nanometre arasında ayarlayın.

Klorofil otofloresansını izlemek için. 650 ila 705 nanometre arasında ikinci bir PMT dedektörü emisyon bant genişliği ayarlayın. M kiraz sinyalini izlemek için HENI 5 61 lazeri kullanın.

Lazerin yoğunluğunu %18'e ve üçüncü bir PMT dedektörü emisyon bant genişliğini 587 ila 610 nanometre arasında ayarlayın. Tüm PMT dedektör kanallarından gelen resimlerin aynı kazanç ayarlarıyla çekildiğinden emin olun. Arka plan sinyallerini hariç tutmak için kazanç 800 ile 900 arasında olmalıdır.

100 hertz tarama hızıyla bu formatta, 1024 x 1024 piksel genişlik ve yükseklikte görüntüler elde edin. Z yığınlamaları için, her yığın arasında maksimum 0,5 mikron mesafe kullanın. Bu çalışmada, sitozolik moleküler şaperon HSP 90'ın membran yerleştirme proteinleri TPR yedi ve ila 64 ile etkileşimini izlemek için BFC yöntemi kullanıldı.

Bu şemada gösterildiği gibi, Venüs, endoplazmik retikulumda bulunan TPR yedi'nin sitozolik kısmına veya kloroplast dış zarfında bulunan 64'e bağlanır. Hs.P 90, konuşma 64 ve TPR yedi'nin TPR alanlarının etkileşimini sağlayan SCFP'ye terminal olarak kaynaşmıştır HSP 90 C, Terminus ile SCFP, tek başına sitozolde TPR yedi HS P 90 protein kompleksinin lokalizasyonunu doğrulamak için negatif bir kontrol olarak ifade edilir. TPR yedi ve HS P 90, bir ER markörü ile birlikte dönüştürüldü.

Floresan, bozulmamış yapraklarda kontrol olarak izlendi. Tek başına SCFP, TPR yedi ve ER markörü ile birlikte eksprese edildi. Gösterilen tüm resimlerde ölçek çubuğu 10 mikronu temsil eder.

Soldaki paneller, 515 nanometrede izlenen yeşil renkte yeniden yapılandırılmış floresanı göstermektedir. ER işaretçisi kırmızı renkte görünür. Orta panellerde, her iki sinyalin yer paylaşımı sağ panellerde gösterilir.

HS P 90 ile birlikte TPR yedi için yeniden oluşturulmuş bir sinyal, sarı renkte görünen ER işaretçisi ile örtüşerek izlendi. Buna karşılık, TPR yedi için sinyal yok ve CFP olarak negatif kontrol izlendi. Bir sonraki örnekte, kloroplast proteini toksini 64, kontrol olarak HS P 90 ile birlikte eksprese edildi.

Tox 64, yalnızca SCFP ile birlikte ifade edildi. Daha önce olduğu gibi, yeşil renkte sulandırılmış floresan 515 nanometrede izlendi. Orta paneller, 480 nanometrede izlenen klorofil otofloresansını gösterir.

Sağ panellerde her iki sinyalin yer paylaşımı kırmızı renkte gösterilir. Sulandırılmış floresan, tox 64 ve HSP 90 eksprese eden koeks hücrelerinde gözlendi, ancak hücrelerde gözlenmedi. Coex tek başına toks 64 ve SCFP eksprese eder.

Toks 64 ve HSP 90'ın tam lokalizasyonunu, tüm yaprakların mikroskobik resimlerinde belirlemek zor olduğundan. Protoplastlar, floresan mikroskobu için sızmış tütün yapraklarından izole edildi. Daha önce olduğu gibi, sulandırılmış floresan 515 nanometrede izlendi, klorofil otofloresan 480 nanometrede izlendi ve bu kaplama görüntüsünde gösterildiği gibi bindirme görüntüleri oluşturuldu, 64 ve HSP 90, kloroplastı çevreleyen halka şeklindeki yapılar olarak tespit edilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, yapılarınızı nasıl tasarlayacağınızı, tütün yapraklarını nasıl dönüştüreceğinizi ve ilgilendiğiniz iki proteinin etkileşimini gösteren floresan sinyalini en iyi şekilde nasıl görselleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.