Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Aşağıdaki deneyin genel amacı, sağlam tütün yapraklarında eksprese edilen iki proteinin etkileşimini izlemektir. Bu, uygun konstrüktların tasarlanması, ilgilenilen iki genin parçalı floresan proteinlerle birleştirilmesi ve bu konstrüktların agro bakterilere transforme edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, agro bakteri kültürleri karıştırılır ve tütün yapraklarına enjekte edilir; bu işlem, proteinlerin ekspresyonuna ve yeniden oluşturulmuş bir floresan sinyaline yol açar.

Proteinler birbirine yeterince yaklaştığında, ardından ya yaprakların tamamı ya da izole edilmiş protoplastlar mikroskop altında analiz edilir. Floresan mikroskobu ile saptanan yayılan floresan sinyaline dayalı olarak protein-protein etkileşimlerini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, ko-immünopresipitasyon veya maya çift hibrit sistemi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, protein-protein etkileşiminin doğrudan canlı bitki hücresi içinde izlenebilmesidir.

Bu yöntem, çeşitli hücresel bölmelerde protein komplekslerinin oluşumu gibi bitki biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre başlamak için, tütün yapraklarının transformasyonunda kullanılacak agro bakterileri büyütün. Steril bir 50 mililitrelik tüp içerisinde, uygun antibiyotikleri içeren 10 mililitre LB besiyerini, ilgilenilen plazmidi içeren 50 mikrolitre AG L one gliserol stok kültürü ile inoküle edin.

Kültür, ertesi gün OD 600 değeri 1,0 ile 2,0 arasına ulaşana kadar 190 RPM'de çalkalanarak 28 °C'de en az 24 saat inkübe edin. Bakterileri 3000 ×g'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı attıktan sonra, peleti yeni hazırlanmış infiltrasyon ortamında süspande edin ve süspansiyonu 1,0 OD 600 değerine ayarlayın.

Tütün yapraklarının infiltrasyonu için agrobakteri hücrelerini, oda sıcaklığında, karanlıkta ve bir orbital sallayıcıda iki saat boyunca inkübe edin. Üç haftalık bir tütün bitkisinden birkaç yaşlı yaprak seçin. Eşit hacimlerde karıştırın.

İlgili konstrüktleri taşıyan agrobakterilerin her birinden üç mililitre alın. Hücre süspansiyonunu tütün yapraklarına infiltre etmek için iğnesiz beş mililitrelik bir şırıngayı hücre süspansiyonu karışımıyla doldurun. Şırıngayı yaprakların alt kısmında birkaç noktaya dikkatlice bastırın, bitkileri sulayın ve iki gün boyunca üzeri örtülü şekilde, ışıktan korunmuş olarak bırakın.

Sızdırılmış bir yapraktan protoplastları izole etmek için, önce yaprağı bir Petri kabına yerleştirin ve üzerine taze hazırlanmış enzim çözeltisi ekleyin. Yeni bir jilet kullanarak yaprağı yaklaşık 0,5 santimetrekare boyutunda parçalara bölün. Ardından, enzim çözeltisi içindeki yaprak parçalarını vakuma aktarın.

İnfiltrasyon şişesi. Yapraklardan hava kabarcıkları çıkana kadar yaklaşık 20 saniye boyunca vakumla infiltrasyon yapın. Vakumu çok dikkatli bir şekilde bırakın.

90 dakika sonra, erleni oda sıcaklığında, karanlıkta, 40 RPM hızda 90 dakika boyunca çalkalayın. Protoplastları, 90 RPM hızda bir dakika boyunca çalkalayarak serbest bırakın. Çözeltiyi gazlı bez aracılığıyla 15 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir santrifüj tüpüne süzün.

Protoplast çözeltisinin üzerine iki mililitre FPCN tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında, yavaş hızlanma ve yavaşlama ayarlarıyla 70 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Sağlam protoplastlar, enzim çözeltisi ile FPCN arasındaki ara yüzeyde birikecektir; geniş ağızlı bir mililitrelik pipet ucu kullanarak sağlam protoplastları yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Bu prosedürün başarısı için, sağlam protoplastların yırtılmasını önlemek amacıyla her zaman geniş ağızlı uçlar kullanın.

Tüpü W five tampon çözeltisi ile doldurun ve yavaş hızlanma ve yavaşlama ayarında, 100 ×g'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. Protoplastları çöktürmek için süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve pelletle, protoplast miktarına bağlı olarak yaklaşık 200 µL W five tampon çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.

Lazer tarama mikroskobisi için bir protoplast örneği hazırlamak amacıyla, önce bir mikroskop lamı üzerine yaklaşık iki santimetre arayla iki küçük sızdırmazlık şeridi yerleştirin. Şeritlerin arasına 20 µL protoplast çözeltisi ekleyin ve üzerine dikkatlice bir kapatma camı yerleştirin. Sızdırmazlık şeritleri, protoplastların kapatma camı tarafından ezilmesini önleyecektir.

Lazer tarama mikroskobisi için toplam yaprak örneği hazırlamak için, yapraktan bir santimetrelik bir parça kesin ve yaprağın alt tarafı yukarı bakacak şekilde bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Yaklaşık 30 µL su ekleyin. Üzerine bir lam örtüsü yerleştirin ve her iki yanını yapışkan bantla sıkıca sabitleyin.

Görüntüleme, büyütme için MICCA tipi TCS SP five konfokal lazer tarama mikroskobu ile gerçekleştirilir. Görüntüleme ortamı olarak gliserol ile 63 x büyütmeli bir objektif lens kullanın; değerlendirme için Leica application suite advanced floresan yazılımını kullanın. Argonne lazerini %30'a ve 488 nanometredeki lazer gücünü %18 yoğunluğa ayarlayın. 515 nanometredeki sinyali izlemek için, ilk PMT dedektör emisyon bant genişliğini 495 ile 550 nanometre arasına ayarlayın.

Klorofil otofloresansını izlemek için, ikinci bir PMT dedektör emisyon bant genişliğini 650 ila 705 nanometre arasına ayarlayın. M cherry sinyalini izlemek için HENI 5 61 lazerini kullanın.

Lazer yoğunluğunu %18'e ve üçüncü PMT detektör emisyon bant genişliğini 587 ile 610 nanometre arasına ayarlayın. Tüm PMT detektör kanallarından alınan görüntülerin aynı kazanç (gain) ayarlarıyla çekildiğinden emin olun. Arka plan sinyallerini dışlamak için kazanç 800 ile 900 arasında olmalıdır.

Görüntüleri 1024 x 1024 piksel genişlik ve yükseklikte, 100 hertz tarama hızıyla bu formatta edinin. Z istifleri (Z stackings) için her istif arasında maksimum 0,5 mikron mesafe kullanın. Bu çalışmada,le sitozolik moleküler şaperon HSP 90 ile membran kenetlenme proteinleri TPR seven ve to 64 arasındaki etkileşimi izlemek için BFC yöntemi kullanılmıştır.

Bu şemada gösterildiği üzere, Venus ya endoplazmik retikulumda yer alan TPR seven'inle ya da kloroplast dış zarında yer alan 64'ün sitozolik kısmına bağlanmıştır. Hs.P 90, talk 64 ve TPR seven'in TPR domenlerinin HSP 90 C-terminusu ile etkileşime girmesini sağlamak için N-terminalden SCFP ile füzyonlanmıştır. TPR seven HS P 90 protein kompleksinin lokalizasyonunu doğrulamak için negatif kontrol olarak sitozolde yalnızca SCFP eksprese edilmiştir. TPR seven ve HS P 90, bir ER markörü ile birlikte ko-transforme edilmiştir.

Kontrol olarak, floresans sağlam yapraklarda izlendi. SCFP, TPR seven ve ER belirteci ile birlikte tek başına eksprese edildi. Gösterilen tüm görüntülerde, ölçek çubuğu 10 microns değerini temsil etmektedir.

Soldaki paneller, 515 nanometrede izlenen ve yeşil renkte görünen yeniden oluşturulmuş floresansı göstermektedir. ER markörü kırmızı renkte görünmektedir. Orta panellerde her iki sinyalin üst üste bindirilmiş hali, sağ panellerde ise gösterilmiştir.

TPR seven için yeniden oluşturulmuş bir sinyal, HS P 90 ile birlikte, sarı renkte görünen ER belirteci ile çakışacak şekilde izlendi. Buna karşılık, TPR seven ve negatif kontrol olarak CFP için herhangi bir sinyal izlenmedi. Bir sonraki örnekte, kontrol olarak kloroplast proteini tox 64, HS P 90 ile birlikte ko-eksprese edildi.

Tox 64, tek başına SCFP ile birlikte ko-eksprese edildi. Daha önce olduğu gibi, yeşil renkte yeniden oluşan floresan 515 nanometrede izlendi. Orta paneller, 480 nanometrede izlenen klorofil otofloresansını göstermektedir.

Her iki sinyalin kırmızı üst üste bindirmesi sağ panellerde gösterilmiştir. Tok 64 ve HSP 90'ı birlikte eksprese eden hücrelerde yeniden oluşturulmuş floresans gözlemlenmiş, ancak sadece tok 64 ve SCFP'yi birlikte eksprese eden hücrelerde gözlemlenmemiştir.

tox 64 ve HSP 90'ın kesin lokalizasyonunun tüm yaprakların mikroskobik görüntülerinde belirlenmesi zor olduğundan, floresans mikroskopisi için infiltre edilmiş tütün yapraklarından protoplastlar izole edilmiştir. Daha önce olduğu gibi, yeniden oluşturulan floresans 515 nanometrede, klorofil otofloresansı ise 480 nanometrede izlenmiş ve bu bindirme görüntüsünde gösterildiği gibi bindirme görüntüleri oluşturulmuştur; burada tox 64 ve HSP 90, kloroplastı çevreleyen halka şeklinde yapılar olarak tespit edilebilmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra; konstrüktlerinizi nasıl tasarlayacağınız, tütün yapraklarını nasıl transforme edeceğiniz ve ilgilendiğiniz iki proteinin etkileşimini gösteren floresan sinyalini en iyi nasıl görselleştireceğiniz konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.