Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, canlı zebra balığı embriyolarında oksidatif stresi kalitatif ve kantitatif olarak ölçmektir. Bu, oksidatif stres indüksiyonu için hazırlanan embriyolara oksidatif bir çözelti eklenerek veya embriyonun kuyruk yüzgecinde bir yara marjı oluşturularak elde edilir. Embriyolar daha sonra oksidatif stres tespiti için tek hücre yöntemi veya tam montaj yöntemi ile işlenir.

Daha sonra, preparatlar bir Ross tespit probu ile inkübe edilir. Sonuçlar, delik montajlarının konfokal mikroskobuna veya tek hücrelerin sito florometrik analizine dayalı olarak oksidatif stres miktarını ve Ross seviyesini gösterebilir. Bu tekniğin, oksi stres belirteçleri için immüno-flor gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, canlı bir organizma bağlamında ham tespitine ve tek dokular düzeyinde miktar tayinine izin vermesidir.

Bu yöntem, patolojik bir durum bağlamında oksidatif stres koşullarını keşfetmek gibi temel araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Kabul edilen yeni kişiler, kazara doku hasarı nedeniyle mücadele edebilir, çünkü ham hassas moleküler problar planlanmamış asitlik kaynağı olabilir. Ve yüksek seviyelerde okside stresin hücre ölümüyle sonuçlanması gerektiğinden, uygulama ve deneylerle çok azını tespit etmek zor olsa da, bu sorunlar yalnızca kendi kendine sonuçlanacaktır DMSO'da bilinen çürüklükten oluşan mitokondriye oksidatif stresi indüklemek için çözelti hazırlanırken, beş ila 50 mikromolar arasında bir konsantrasyonda çürük bilinen stokla yapılmalıdır ve asla 100 mikromolar çürüğün bilindiği bilinen toksik ve tehlikelidir.

Etiketlenmiş önlemlere dikkat edin. Delik Dağı Ross tespiti için prob çözeltisi, hazırlanması sırasında herhangi bir ışığa veya oksijene maruz bırakılmamalı ve tek hücreli Ross algılama yöntemi için taze olarak hazırlanmalıdır. PBS'de FBS'nin bir durdurma çözeltisi hazırlanmalı ve dört santigrat derecede tutulmalıdır.

Diğer hazırlıklar arasında zebra balığı hava inkübatörünün 28 santigrat dereceye ayarlanması ve tek hücreli yöntem için santrifüjün dört santigrat dereceye soğutulması yer alıyor. Zebra balığı çaprazlamaları, embriyo toplama ve anestezi işlemlerinin tümü yapılır. Standart metodolojiyi kullanarak, döllenmeden 48 ila 72 saat sonra ilgilenilen embriyoları toplayın.

Anestezi uygulandıktan sonra embriyolar anestezikleri iki kez yıkayın, ardından embriyoları tek hücreli ham tespiti için tabak başına en fazla 30 olacak şekilde üç tabağa yükleyin. Birden fazla tabakta koşul başına en az 35 embriyo toplayın. Daha sonra, 10 mililitre oksidan çözelti uygulayın veya negatif kontrol olarak uygulayın.

10 mililitre su uygulayın, ardından embriyolar 28 santigrat derecede kuluçkaya yatarken 10 ila 60 dakika bekleyin. Ayrıca yıkama için HBSS'yi 28 santigrat dereceye ısıtın. Kuluçka işleminden sonra, embriyoları yeni bir ılık HBSS tabağına aktarın ve döndürün.

Ardından, tam montaj veya tek hücreli Ross algılama ile devam edin. Daha fizyolojik bir seçenek, NI Tomer ve şirketi tarafından tarif edilen kuyruk yüzgeci yaralama tekniğini kullanarak doku hasarından sonra stres oluşturmaktır. Oksidan tedaviden sonra, 10 embriyoya kadar olan grupları küçük tüplere aktarın.

HBSS ile yoğun bir şekilde durulayın ve folyo ile ışıktan koruyun. Daha sonra, her tüpe bir mililitre ham tespit çözeltisi ekleyin ve tüpleri inkübe edilirken 28 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Hem kontrol hem de deney koşulunu içerecek şekilde bir cam slayt hazırlayın.

Bir çöküntü slaytını 300 mikrolitre metilselüloz ile örtün. Metilselülozu çıkarırken kabarcık yapmayın. Embriyo inkübasyonundan sonra, tüplerdeki çözeltiyi hızlı bir şekilde iki mililitre HBSS ile değiştirin ve embriyoları yıkamak için tüpleri birkaç kez ters çevirin.

Daha sonra embriyoları bir mikro pipetin ucuna aspire edin ve nazikçe tedavi edilen slayta çıkarın. Embriyoları ince bir naylon çizgi kullanarak yönlendirin ve analiz için bir floresan veya konfokal tarama mikroskobu kullanarak devam edin. Tüm embriyoları aynı ayarlar altında analiz ettiğinizden emin olun.

Embriyoları HBSS yıkamasından yeni bir tabağa aktarın ve mümkün olduğunca fazla çözeltiyi çıkarın. Şimdi embriyoları manuel olarak kaplayın. Bu, embriyoları tek hücrelere ayırmak için gerçekten gereklidir.

Daha sonra, embriyoları 24 oyuklu bir plakaya taşıyın, her birine 15 embriyo yükleyin. Her koşul için en uygun şekilde üç kuyu doldurun. Daha sonra, tüm çözeltiyi çıkarın ve 300 mikrolitre HBSS, 30 mikrolitre kollajenaz p ve 50 mikrolitre tripsin EDTA ile değiştirin.

Bir mililitrelik pipet ucu kullanarak embriyoları trier ile homojenize edin. Tüm kuyucuklar hazırlandıktan sonra, plakayı her beş dakikada bir en az 20 dakika boyunca 28 santigrat dereceye aktarın, iyi bir homojenizasyon sağlamak için numuneleri tritrate edin. Ayrıca, hazır olduklarında dokuları toplamak için buzun üzerine bazı mikro fuge tüpleri koyun.

20 dakika sonra bir örnek alın ve dokunun mikroskop altında tek hücreli bir süspansiyona bozulup bozulmadığını kontrol edin. Değilse, inkübasyona toplamda 30 dakikaya kadar devam edin. Doku hazır olduğunda, ilave 200 mikrolitre durdurma çözeltisi ile reaksiyonu durdurun.

Bunu bir mililitrelik pipet ucu kullanarak TRI ile karıştırın. Daha sonra, her bir kuyucuğun içeriğini önceden soğutulmuş bir mikro füj tüpüne aktarın ve bu tüpleri buz üzerinde ışıktan uzak tutun. Daha sonra numuneleri 250 GS'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin.

Ve sonra süpernatanı aspirasyon ile çıkarın. Hücre peletini buz gibi HBSS'de nazik tri ile yeniden süspanse edin ve süspansiyonun en az 2 milyon hücreye sahip olduğunu kontrol edin. Daha sonra, hücreleri ham hassas prob çözeltisinin bir mililitresinde yeniden süspanse edin.

Onları oda sıcaklığında ve karanlıkta yaklaşık üç dakika inkübe edin. Bu inkübasyon süresini ampirik olarak ayarlayın. Ardından, hücreleri ışıktan korunan faks tüplerine aktarın.

Transgenik işaretleyiciyi tespit etmek için faks analizlerine devam edin. Floresan ve Ross probu floresan Analiziniz sırasında. Arka plan floresansını normalleştirmek için her zaman kontrol numunelerine kıyasla kat arttıkça kayıp seviyelerini hesaplayın.

Tüm Mount Ross tespiti, bir yara bölgesinde hidrojen peroksit birikimini incelemek için kullanıldı. Sağlam ve yaralı kuyruklar 20 dakikalık oksidan tedavisinden sonra karşılaştırıldı. Her iki durumda da spesifik olmayan sinyal tespit edildi.

Hidrojen peroksit seviyelerini düşürmek için embriyoların ön tedavisi ile aynı deney. OX inhibitörü VA'lar 28, 70 kullanılarak, tespit edilen sinyallerin gerçekten de Ross birikim çürümesine bağlı olduğunu ortaya koydu. Tedavi edildiği bilinen embriyolar da tüm montaj tarafından incelendi.

Yüksek büyütme altında anatomik bölgeler tanımlanabilir. Ross pozitif hücrelerin faksla floresan sayımı ile gösterildiği gibi Ross'u üreten, tek hücreli Ross tespiti için gerçekleştirildi. Bu analiz, ölü hücreler dahil edilmeden gerçekleştirildi. Kontrol.

Tedavi edilmeyen hücreler de analiz edildi. Bu sonuçların karşılaştırılması, Ross birikiminin ölçülmesini çok kolaylaştırdı. Tahlil, herhangi bir sayıda deneysel manipülasyonu test etmek için mükemmel olduğunu kanıtlıyor.

Buna hakim olduktan sonra, uygun şekilde uygulanırsa 90 dakika içinde bir teknik yapılabilir. Moleküler problarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bunun öncüsü olabileceğini unutmayın. Bu prosedür uygulanırken her zaman bu tür eldiven kullanımı yapılmalıdır.