Name: Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Öğrenin, canlı zebra balığı embriyolarında oksidatif stresi nicel ve nitel olarak ölçme yöntemini. Bu teknik, konfokal mikroskopi ve sitofluorometrik analiz ile ROS seviyelerini değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Massimo Santoro laboratuvarındaki destek HFSP, Marie Curie Action, Telethon ve AIRC'den geliyor. Dafne Gays ve Emiliano Panieri'ye makaleyi eleştirel bir şekilde okudukları için teşekkür ederiz.

Araçların ve Çalışma Çözümleri 1. Hazırlanması <ol><li> Balık su çözeltisi hazırlayın. Damıtılmış su, 50 ml deniz tuzları &quot;Instant Ocean&quot; 2 g eriterek bir stok çözeltisi yapın. Balık suyu (60 ug / ml nihai konsantrasyon deniz tuzu) kullanıma hazır hazırlamak için 1 L damıtılmış su stok balık su 1.5 ml ilave edilir. Kullanımdan önce balık suyu kullanmaya hazır otoklavlayın. Bu çözüm, zebra balığı, embriyo ortamı olarak kullanılır. </li><li> Embriyo montaj için metilselüloz hazırlayın. Balık steril 50 ml su içinde 1.5 g metilselüloz çözülür. Bir karıştırıcı plaka üzerinde bir mıknatıs kullanılarak erimesini kolaylaştırmak. Tozun tam çözünme birkaç saat gerekebilir. Küçük tüpler içine netlik ve kısım için çözüm kontrol edin. Ay boyunca -20 ° C&#39;de saklayın ve kullanımda alikotları çözülme. Kullanmadan önce, 5 dakika boyunca 950 x g&#39;de santrifüje metilselüloz. Alikotların donma-erime döngülerinden kaçınmak. </li><li> Tricaine / etil 3-aminobenzoat m, 50 ml hazırlamak100 ml su içinde, 200 mg tricaine eritilmesi ve Tris-HCl, 1 M (pH 9) ile pH 7.0 &#39;ye ayarlanması ile etansülfonat tuzu (stok çözelti). En fazla 30 gün boyunca 4 ° C&#39;de, bu stok saklayın. DİKKAT: tricaine toksiktir. Uygun kullanım talimatlarına uygun olarak kullanın. </li><li> Zebra balığı embriyolar oksidatif stres yaratmadan <ol><li> Genel oksidatif stres oluşumu için bir oksitleyici çözelti hazırlayın: H 2 O 2 stok çözeltisi (hidrojen peroksit, 100 mM) eklenmesi ile oksidan, çözelti 50 ml olun balık su. 2 mM ile 100 uM arasında bir nihai konsantrasyon 2 H O 2 kullanın. Kısa bir süre kullanımdan önce bu çözüm hazırlayın. Oksidan, çözelti, bütün montaj ROS-algılama ve tek hücreli ROS-algılama yöntemlerinin her ikisine de uygulanabilir. Bu çözüm saklamayın. DİKKAT: H 2 O 2, tehlikeli ve solunduğunda zararlıdır ve yutulduğunda. Yanıcı maddelerle temasında yangına neden olabilir. Davlumbaz altında işlemek ve uygun pers giymekÖnal koruyucu ekipman. </li><li> Mitokondri türevi oksidatif stres oluşumu için bir oksitleyici çözelti hazırlayın: dimetil sülfoksit (DMSO) içinde bir 2 ml rotenone 3.9 mg çözülmesiyle bir oksidan stok çözeltisi (5 mM) olun. Karanlıkta, oda sıcaklığında, bu çözüm tutun. <ol><li> Çözümü kullanmak için hazır hale getirmek için balık suda 10 ml rotenone stok solüsyonu çözülür. 5-50 uM arasında bir konsantrasyonda rotenon kullanın. 100 uM daha yüksek konsantrasyonlarda rotenon kullanmayın. Uygun konsantrasyonlarda, bu oksidan, çözelti, bütün montaj ROS-algılama ve tek hücreli ROS-algılama yöntemlerinin her ikisine de uygulanabilir. DİKKAT: Rotenone zehirli ve tehlikelidir. Uygun önlem ifadeleri göre tutun. </li></ol></li><li> Gen tarafından oksidatif strese neden knock-down: Knock-down nrf2a gen ifadesini Zebra balığı embriyolarının morfolinodur mikroenjeksiyon tarafından önceden Timme-Laragy A. ve diğerleri, 2012 38 tarafından bildirilen.. </li><li> Oxid Inducedoku hasarı sonrası stres Ative:. önceden Niethammer ve ark, 2009 39 tarafından açıklandığı gibi 72 hpf Zebra balığı embriyolarının kuyruk yüzgecinin bir yara marjı oluşturur. </li></ol></li><li> Tek hücre ROS-saptama yöntemi için ROS-algılama çözeltisi 5 ml hazırlanması: <ol><li> Bir çalışma çözeltisi (: 2.5-10 uM konsantrasyon aralığı) hazırlamak amacıyla, HBSS (Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi) &#39;de genel ROS-duyarlı molekül prob eritin: Genel ROS tespiti için çözümü. Bu çözüm, kısa bir süre kullanımdan önce hazırlanmış olmalıdır. </li><li> Mitokondri tarafından uyarılan özgü saptama ROS Çözüm: kullanımdan hemen önce, DMSO, 5 mM stok çözelti yapma ile bir mitokondriyal ROS duyarlı probu çözülür. Bir çalışma çözeltisi (: 2.5-10 uM konsantrasyon aralığı) hazırlamak amacıyla HBSS içinde stok çözeltisi çözülür. NOT: ROS-algılama çalışma çözümleri ışık ve oksijen maruz kalma ve kendi stok çözümleri kaçının. Kullanılarak ışık tüpü korumakbir alüminyum folyo. Saklamak veya HBSS&#39;de çözülmüş yeniden kullanımı sondalar etmeyin. Bir ay boyunca -20 ° C &#39;de stok çözelti saklayın. DİKKAT: Uygun kurallarına uygun bir davlumbaz altında moleküler problar ve DMSO&#39;yu tutun. </li></ol></li><li> Bütün montaj ROS-saptama yöntemi için ROS-algılama çözeltisi 5 ml hazırlayın: bir çalışma çözeltisi (: 2,5-5 uM konsantrasyon aralığı) hazırlamak amacıyla, HBSS (DMSO içinde stabilize edilmiş) genel ROS duyarlı probu stok çözeltisi içinde çözündürülür. Işık ve oksijen maruz kalmaktan kaçınınız. Işıktan tüp koruyun. Kullanmadan önce bu çözüm hazırlayın. Bu çözümü saklamak veya yeniden kullanmayın. DİKKAT: Uygun kurallarına uygun bir davlumbaz altında moleküler problar taşıyınız. </li><li> PBS 1x 15 ml cenin sığır serumu 10 mi eklenerek Durdurma Solüsyonu 25 ml olun. Steril çözüm tutun. 4 ° C &#39;de, bu çözüm Mağaza ROS algılama yöntemi - Bu çözüm sadece tek bir hücre için gereklidir. </li><li> 28 ve at Zebrafish hava inkübatör ayarlayın# 176; C. </li><li> Tek hücre ROS-saptama yöntemi boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj ayarlayın. </li></ol> 2.. Yetişkin Balıkların Çiftleşme ve Zebra balığı Embriyolar Seçimi <ol><li> Set-up yetişkin zebrabalıkları çifti standart protokollere göre 40 haçlar. Spesifik deneysel ihtiyaçlarına uygun olarak, uygun transjenik çizgi seçin. </li><li> Yumurta toplamak ve balık su / embriyo orta ile 90 mm çanak içine koyun. Embriyolar geliştirmek ve istenilen gelişimsel aşamada büyüyecek kadar 28 ° C&#39;de yumurta tutmak (örneğin, 48 hpf, 72 hpf; hpf: saat sonra döllenme). </li><li> Embriyoların geliştirilmesi için ekran. Tüm döllenmemiş yumurta veya az gelişmiş embriyolar dışlamak. </li><li> 50 ml su içinde balık tricaine (stok çözelti) içinde 1 ml ilave etmek suretiyle embriyolar anestezisi. </li><li> Stereomicroscope altında Tg floresan embriyolar seçin. </li></ol> Oksidan Agent ile Embriyoların 3. Tedavisi <ol><li> 48 saat arasında en az 30 embriyolar kullanınpf ve 72 farklı durum başına HPF. Tricaine çıkarmak için taze balık iki kere su ile embriyolar yıkayın. </li><li> Üç yemeklerin içine floresan embriyolar Split. En fazla 30 embriyo / çanak koymak. </li><li> Yıkama çözeltisini çıkarın ve oksidan, çözelti 10 ml ya da kontrol çözeltisi gibi balık su 10 ml ekleyin. </li><li> 28 ° C&#39;de 1 saat 10 dakika boyunca inkübe embriyolar Kuluçka süresi, belirli dokularda indüklendiği oksidatif stres düzeyine göre değişir. Oksidatif stres etkilenen hücreleri ilerleyici hücre ölümünü geçmesi gibi kısa dönemler iyisidir. </li><li> Dönen tarafından HBSS ve yıkama embriyoları içeren yeni bir çanak içine embriyolar transfer. 28 ° C&#39;de önceden sıcak HBSS </li></ol> 4.. Tüm Dağı ROS Algılama Yöntemi <ol><li> Oksidan tedaviden sonra embriyolar toplayın ve küçük bir tüp içinde en fazla 10 embriyolar koydu. HBSS ile mümkün olduğu kadar yıkayın. Alüminyum folyo kullanarak ışık tüpü koruyun. </li><li> ROS için algılama çözeltisi 1 ml ilave edilirHer bir tüp. </li><li> Işık maruz kalmasını önlemek için 28 ° C&#39;de 15 dakika boyunca karanlıkta inkübe embriyolar. </li><li> Inkübasyon süresi boyunca bütün embriyo analizi için bir cam slayt hazırlar. Bir &quot;depresyon&quot; cam slayt metilselüloz 300 ul koyun ve bir pipet ile cam yüzeye yayılır. Metilselüloz bırakırken kabarcıkları kaçının. </li><li> İnkübasyon süresi sonunda, hemen ROS algılama çözüm kaldırmak ve 2 ml HBSS ile iki kez yıkayın. Tüpü birkaç kez baş aşağı çevirerek embriyolar yıkayın. Pipet veya vorteks etmeyin. </li><li> Kadar cam Pasteur pipet içine aspire embriyolar. Pipet açılışına yakın ve yavaşça pozisyon embriyolar metilselüloz içine bunları çıkarın. Ince naylon hattı ile uygun embriyolar yönlendirmek. </li><li> Tedavi edilen embriyolar ile embriyo kontrol floresan karşılaştırın. Tüm embriyolar aynı kullanarak görüntülü böylece Alternatif olarak, flöresanlı bir stereomikroskop veya konfokal mikroskop parametrelerini saptamakgörüntüleme ayarları. </li></ol> 5.. Tek Hücre ROS-algılama Yöntemi <ol><li> 3.5: aşama başlatın. Her durum için en az 35 embriyo var emin olun. </li><li> Yeni bir çanak içine embriyolar aktarın. Balık suya mümkün olduğunca kaldırın. Buz soğukluğunda PBS 1x 10 ml ve Proteaz İnhibitörleri Kokteyl 400 ul ekleyin. Elle forseps ile embriyolar dechorionate ve ince bir iğne ile yumurta sarısı çuval çıkarın. Not: sarısı çuval Çıkarma aşağıdaki FACS analizi için temiz örnekleri sağlar. Bu adım, FACS alet uygun bir biçimde yok edilebilir. </li><li> Aktarım de-yolked, 24 oyuklu çoklu gözenekli plakanın içine embriyolar (15 embriyo / çukur) ve tüm balık suyu çıkarmak. </li><li> HBSS 300 ul, 30 ul kolajenaz P, her bir oyuğa 50 ul tripsin-EDTA ekleyin. </li><li> Sıkı bir pipet (1.000 ul) ile hafifçe yukarı pipetleme ve aşağı embriyolar homojenize. </li><li> 20 dakika boyunca 28 ° C&#39;de inkübe edilir ve her 5 dakikada pipetleme örnekleri homojenize edilmiştir. </li><li> Doku DISR edinbileşik mikroskobunda homojenat bir kısım gözlemleyerek uption. Pipetleme tek hücre süspansiyonu kolaylaştıracak. Fazla 30 dakika boyunca embriyolar inkübe etmeyin. </li><li> Durdurma Solüsyonu 200 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun. Hafifçe pipetleme karıştırın. </li><li> Dar bir tabana sahip önceden soğutulmuş bir tüp içine hücre süspansiyonu aktarın. Buz üzerinde tüp tutun ve ışık maruz kalmaktan kaçının. </li><li> 4 ° C&#39;de 250 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj </li><li> Hafifçe pipetleme buz HBSS ile üst faz ve yeniden askıya hücreleri çıkarmak. </li><li> Hücrelerin sayısı ve sizin tüm örneklerde hücrelerin aynı numara olduğundan emin olun. Az 2 x 10 6 hücre kullanmayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 250 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri </li><li> Süpernatantı ve ROS duyarlı probu içeren buz gibi soğutulmuş HBSS 1 ml pelet askıya. </li><li> Karanlıkta 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin tüpü. Oksidatif stres seviyesine göre inkübasyon süresi değişebilir ve tProbun o hassasiyeti. </li><li> Bir FACS tüpü hücreleri aktarın. Buz üzerinde tüpler tutmak ve FACS analizden önce ışık maruz kalmaktan kaçının. </li><li> Bir floresan-aktive edilmiş hücre ayırıcı (FACS) hücreleri sıralar. Tg doku floresan (örneğin, GFP) ve ROS tespiti (örneğin, belirli mitokondriyal ROS-duyarlı sondalar, genel ROS-duyarlı problar) için kullanılan moleküler prob uyarma / emisyon spektrumları uygun set dalga boyları. </li><li> Her bir durum için, aynı FACS ayarlarını uygulayarak, aynı deneysel oturumdaki tüm örneklerini ölçmek. Farklı biyolojik kez tekrarlanan deneyin ortalaması olarak floresan hücrelerin yüzdesini hesaplayın. Her bir durum için en az iki analiz çoğaltır. </li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Kritik Adımlar Burada tarif zebra balığı embriyolar oksidatif stres saptanması için prosedür, iki farklı yöntem ihtiva eder. Tek hücre ROS-saptama yöntemi (Şekil 1), daha özel niceliksel ölçümlerini sağlar iken bütün montaj ROS-saptama yöntemi, esas olarak ROS-nitel olarak saptanması için bir deneydir. Her iki yöntem de Zebra balığı embriyolarının üzerinde in vivo ROS-algılama değerlendirmek için hızlı ve kolay bir yol sunar. Ancak, her ikisi bazı kritik adımlar mevcu...

Oksidatif stres özellikle dengesiz hücresel redoks durumundan kaynaklanan bir durum olarak tanımlanır. Rutin hücrelerin içinde meydana kompleksinin redoks reaksiyonları hücresel redoks-durumunu belirlemek. Redoks reaksiyonları azaltma ve molekül (yani redoks reaksiyonları) oksidasyonunu üreten biyolojik moleküllerin atomları arasında elektron transferinde oluşan, kimyasal reaksiyonlar oluşur. Bu reaksiyonlar, bir uç yapı kararsızlık ve komşu biyomoleküllerle alışverişi dengesiz elektron kendiliğinden aktivasyonu ile karakterize edilir elektronik aktif bir tür (örneğin pro-oksidatif türleri) ile katalize edilir. Bu düzensiz reaksiyonlar DNA hasarı, protein karboksilasyon ve lipid oksidasyon haline neden ve sonuçta hücre ölümüne 1. yol açar. Oksidatif stres seviyelerinin artması yaşlanma ve farklı patolojik durumların 2&#39;nin ilerlemesi ile ilişkilendirilmiştir. Oksidatif stres vardiyabet, kalp-damar hastalıkları 3,4 vasküler değişikliklerden sorumlu olduğu bildirilmiştir. Ayrıca, Alzheimer hastalığı nöronal dejenerasyon önemli bir rol oynar ve Parkinson hastalığı 5. Ayrıca, oksidatif stres kanser ilerlemesini ve metastatik olayları 6,7 yöneten kritik bir faktör olarak kanıtlanmıştır. Buna ek olarak, enflamasyon ve immün yanıtları ortaya ve diğer destek oksidatif stres 8 olabilir. Veya nitrojen (RNS; reaktif nitrojen türleri); canlı hücreler olarak, pro-oksidatif oksijen türleri (ROS reaktif oksijen türleri) türetilir. (H 2 O 2) ve hidrojen peroksit - (O 2) ROS superoksit anyon (. OH) hidroksil radikali içerir. Birincil RNS nitröz oksit (NO). Olduğunu. İkinci reaktif türlerin bir dizi betwee kendiliğinden etkileşimleri ile üretilebilirn ROS ve RNS veya ücretsiz metaller 9 iyonların. H 2 O 2 Fe2 + hidroksil radikalleri meydana ile reaksiyona sokulması sırasında, - örneğin, süperoksit anyon peroxynitrate (ONOO) oluşturmak için azot oksit ile reaksiyona girer. ROS ve RNS nedeniyle çok biyomoleküller ile tepkimeye yetenekleri için, fizyolojik redoks durumuna 10 bakımı için tehlikeli bir tehdit olarak kabul edilir. Korumak için redoks durumu hücreleri, anti-oksidan moleküllerini ve detoksifiye edici enzimler, bir dizi ile donatılmıştır. . 11 - süperoksit dismutaz (SOD), katalaz, glütatyon peroksidaz ve Peroxiredoxins esas H2O 2, OH ve Oono de dahil olmak üzere pro-oksidatif türlerden hücresel koruma sağlayan, anti-oksidan enzimatik-cephanelik oluşturmaktadır. Ayrıca C vitamini ve E, polifenoller ve CoEnzymeQ10 (CoQ10) gibi anti-oksidan moleküller ROS ve tehlikeli DE gidermek için kritik öneme sahip12,13 türevleri üzerinde. Bununla birlikte, ROS ve RNS, ya da anti-oksidan sisteminde bir fonksiyon bozukluğu, aşırı üretimi oksidatif stres 14 doğru hücresel redoks durumunu değiştirir. Onların olumsuz çağrışım yanı sıra, ROS farklı kökenli hücrelerde çeşitli fizyolojik roller oynayabilir. Hücreler normalde böyle konak savunma ve yara onarımı 15-17 gibi normal biyolojik olaylara aracılık için sinyal molekülleri olarak ROS üretir. Reaktif türlerin normal sinyalizasyon faktörleri, büyüme faktörleri, ve kalsiyum seviyeleri 18,19 hücre içi dalgalanmalara tepki olarak bu NOx (NADPH oksidaz) ve XO (ksantin oksidaz) gibi hücre içi enzimlerin hücrelerinde üretilir. Bu ROS diferansiyel örneğin p53 ya da ATM-kinaz, DNA hasarı 20 için cevabın bir ana regülatör olarak, hücresel bileşenler olarak önemli bir nükleer faktör aktivitesini modüle edebilir olduğu bildirilmiştir. Benzer ROS kuvvetle inci aracılık ederek hücresel sinyalizasyonu etkileyebilire oksidasyon ve sinyal iletimi 21 arasında önemli bir düzenleyici olarak oluşturulan protein tirozin fosfatazlar (PTP), inaktivasyonu. Ayrıca, proteomik göre yöntemler RNS aynı zamanda spesifik protein modifikasyonları ve moleküler sinyallemesinin değişikliklerden sorumlu olduğunu göstermektedir. S-RNS nitrothiols (SNO) içine değiştirerek ve bu enflamatuar ve otoimmün hastalıklarda 22,23 gibi patolojik durumları ile birlikte moleküler yolları tetikleme sistein tiyol grupları ile reaksiyona girmektedir. Hücre kültürü deneyleri sadece kısmen in vivo etkili faktörlerin sayıda yeniden beri, hayvan modellerinde 24,25 redoks çalışmalar gerçekleştirmek için büyük ilgi olduğunu. Bunu başarmak için, zebra balığı oksidatif stres dinamiklerini 26 incelemek için uygun bir omurgalı hayvan modeli olarak kabul edilmiştir. Zebra balığı çeşitli avantajları omurgalı dev sırasında hücresel ve genetik olayları incelemek için izin veren yeni bir model sistemelopment ve hastalık. Embriyolarının büyük kümeler deneysel ihtiyaçları için haftalık oluşturulur ve mevcut olabilir. Ayrıca Zebra balığı embriyolarının olağanüstü optik netlik, hem de kendi küçük boyutu, bütün organizmalar 27 tek hücre görüntüleme ve dinamik bir izleme sağlar. Son on yılda, zebra balığı mutantlar önemli sayıda kanser ve genetik hastalıklar 28-31 gibi insan patolojik durumları modellemek için oluşturulan edilmiştir. En önemlisi, transjenik soylarda çok sayıda genetik ve biyolojik manipülasyonlar 32 arasında geniş olanaklar sağlamak için hazırlanmıştır. Örneğin, transgenik dokuya özgü zebra balığı hatları düzenli olarak in vivo çalışmalar için kullanılmaktadır. Bu hatlar, in vivo olarak, tek hücreleri tanımlamak için yeteneği, hem de bu ihtiva anatomik yapısını sunan seçilen bir promoterin kontrolü altında bir floresan proteini ifade eder. Çeşitli toksikolojik çalışmalar zaten t kullanmışo ilaç keşfi ve oksidatif stres 33-35 alanında için bir hayvan modeli olarak, bu omurgalının uygunluğunu gösteren, redoks homeostazı ile ilgili kimyasalların in vivo etkisini değerlendirmek için zebra balığı. Bazı floresan probları Zebra balığı larvaları 36,37 oksidatif stresi izlemek için test edilmiş olsa da, Zebra balığı dokulardaki oksidatif stres düzeyleri ve yaşam hücreleri algılamak ve ölçmek için hiçbir kurulmuş tahliller vardır. Burada zebrafish embriyoların canlı hücreler oksidatif stres in vivo ölçümü için bir prosedür tarif eder. Görüntüleme araçları, FACS, flüoresan probları ve pro-oksidatif koşullar her zebra balığı embriyolar ve dokularda oksidatif türlerinin saptanması ve miktarının belirlenmesi için basit bir deney oluşturmak için birleştirilir.

<table><tbody><tr><td>Hidrojen peroksit çözeltisi</td><td>SIGMA</td><td>516813</td><td>DILÜITLERI SAKLAMAYIN</td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi 1x</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>Metil selüloz</td><td>SIGMA</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Anında Okyanus Akvaryumu Deniz Tuzu Karışımı</td><td>ANINDA OKYANUS</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Trikain</td><td>SIGMA</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Cgeneric ROS'a duyarlı prob: CellROX Deep Red Reagent</td><td>INVITROGEN</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>Mitokondriye özgü ROS'a duyarlı prob: MitoSOX&nbsp;</td><td>INVITROGEN</td><td>M36008</td>, <td>bir şişeyi 13 & mu ile çözer; l DMSO</td></tr><tr><td>Hidroetidin</td><td>INVITROGEN</td><td>D23107</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>SIGMA</td><td>R8875</td><td>DMSO'da 5 mM stok çözeltisi hazırlayın.</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>VAS2870; 3-Benzil-7- (2-benzoksazolil) tiyo-1,2,3-triazolo (4,5-d) pirimidin</td><td>EnzoLifeScience</td><td>BML-EI395</td><td>tozu DMSO'da çözer; balık suyunda diluit</td></tr><tr><td>Propidium İyodür &</td><td>Moleküler problar (Yaşam Teknolojileri)</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>7-aminoaktinomisin D (7-AAD)&nbsp;</td><td>Moleküler problar (Yaşam Teknolojileri)</td><td>A1310</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2a Morpholino</td><td>GeneTools</td><td>5'-CATTTCAATCTCCAT CATGTCTCAG-3'Ref</td><td>: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID: 12167159)</td></tr> <tr><td>Kollajenaz P</td><td>ROCHE</td><td>11213857001</td><td>Tozu steril HBSS'de 100 mg / ml'de çözün. Alikotları -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Komple Proteaz İnhibitörü Kokteyl Tabletleri</td><td>ROCHE</td><td></td><td>Bir tableti 1 ml suda</td></tr><tr><td>çözün %0.5 Tripsin-EDTA (10x), fenol kırmızısı yok</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td>Kullanmadan önce 1x çalışma solüsyonu hazırlayın</td></tr><tr><td>Bileşik mikroskop ve nbsp;</td>Floresan aydınlatmalı <td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Nikon</td><td>AZ100</td><td></td></tr><tr><td>Fotoğraf Makinesi</td><td>Floresan</td> görüntü elde etmek için ZEISS <td>AxioCamMRm</td><td></td></tr><tr><td>yazılımı</td><td>ZEISS</td><td>ZEN 2011</td><td></td></tr><tr><td>Floresanla aktive edilen hücre sıralayıcı</td><td>BD FACSCalibur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüjü&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>FACS tüpleri&nbsp;</td><td>BD</td><td>342065</td><td></td></tr><tr><td>Çok Kuyulu Plaka&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Sterilize edilmiş, işlem görmemiş Petri kapları 90 mm</td><td>VWR</td><td>391-1915</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Leica</td><td>Leica SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

zebra balığı embriyolar oksidatif stres analizi

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Reaktif oksijen türlerinin (ROS) yüksek düzeyde oksidatif stres durumuna karşı hücresel redoks durumunda bir değişikliğe neden olabilir. Bu durum, moleküllerin (yağ, DNA, protein) oksidasyonuna neden olur ve hücre ölümüne yol açar. Oksidatif stres de etkiler, diyabet, retinopati, nörodejenerasyon ve kanser gibi çeşitli patolojik koşulların ilerlemesi. Bu nedenle, tek hücre düzeyinde değil, aynı zamanda bütün organizmaların bağlamında sadece oksidatif stres koşulları araştırmak için araçlar tanımlamak önemlidir. Burada, bu tür çalışmalar gerçekleştirmek ve in vivo oksidatif stresi ölçmek için bir protokol mevcut in vivo sisteminde yararlı olarak Zebra balığı embriyo düşünün. &quot;I) oksidatif stres nitel ölçümü için&quot; bütün embriyo ROS-algılama yöntemi &quot;ve ii): floresan ROS prob ve zebra balığı transgenik floresan hatlarının yararlanarak, in vivo oksidatif stresi ölçmek için iki farklı yöntem geliştirmekoksidatif stres kantitatif ölçümleri için, tek hücreli bir ROS algılama yöntemi &quot;. Burada, oksitleyici maddeler ve fizyolojik ya da genetik yöntemlerle dokularda oksidatif stresi artırarak bu işlemlerin etkinliğini göstermektedir. Bu protokol, ileri genetik ekranlar için müsait olan ve bu tür nörolojik bozukluklar ve kanser gibi oksidatif stresle ilgili patolojiler hayvan modellerinde ROS adresi neden-sonuç ilişkilerini yardımcı olacaktır.

Burada anlatılan yöntemi uygulayarak, kolayca ölçebilir ve zebra balığı embriyonik dokularda oksidatif stres (ve ROS seviyelerini) algılar. Yetişkin zebrafish geçtikten sonra, yumurta toplandı ve 72 saat sonrası fertilizasyon (hpf) 28 ° C&#39;de gelişmeye bırakıldı. Güçlü pro-oksidan reaktifleri ile embriyoların 1) tedavi veya doku yaralanma sonrası 2) teşvik ROS oluşumu: oksidatif strese neden amacıyla, iki farklı yaklaşımı öneriyoruz. Hidrojen peroksit (2 H O 2), gene...

Burada canlı zebra balığı embriyolarında oksidatif stresi ölçmek için bir protokol bildiriyoruz. Bu prosedür, hem tüm embriyo dokularında hem de tek hücreli popülasyonlarda reaktif oksijen türlerinin (ROS) tespitine izin verir. Bu protokol hem kalitatif hem de kantitatif analizleri gerçekleştirecektir.

Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, canlı zebra balığı embriyolarındaki oksidatif stresi kalitatif ve kantitatif olarak ölçmektir. Bu, oksidatif stres indüksiyonu için hazırlanan embriyolara bir oksidatif solüsyon eklenerek veya embriyonun kuyruk yüzgecinde bir yara kenarı oluşturularak gerçekleştirilir. Embriyolar daha sonra, tek hücre yöntemi veya bütün montaj yöntemi kullanılarak oksidatif stres tespiti için işleme alınır.Ardından, preparatlar bir Ross tespit probu ile inkübe edilir. Sonuçlar, bütün montajların konfokal mikroskobisi veya tek hücrelerin sitofluorometrik analizi temel alınarak oksidatif stres miktarını ve Ross seviyesini gösterebilir. Bu tekniğin, oksistres belirteçleri için immünoflor gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, canlı bir organizma bağlamında ham tespite ve tekil doku düzeyinde nicelendirmeye olanak tanımasıdır.Bu yöntem, patolojik bir durum bağlamında oksidatif stres koşullarının araştırılması gibi temel araştırma alanındaki kritik soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu işleme yeni başlayan kişiler, ham hassas moleküler probların beklenmedik asidite kaynakları olabilmesi nedeniyle yanlışlıkla meydana gelen doku hasarlarıyla karşı karşıya kalabilirler. Yüksek düzeydeki oksidatif stres hücre ölümüne yol açarken, çok düşük düzeylerin uygulama ve deneylerle tespit edilmesi zor olabileceğinden, bu sorunlar yalnızca uygulama sırasında ortaya çıkacaktır. DMSO içinde çözünmüş olan ve mitokondrilerde oksidatif stresi tetiklemek için kullanılacak çözelti hazırlanırken, stok çözelti 5 ile 50 µM arasındaki bir konsantrasyonda hazırlanmalı ve asla 100 µM değerinin üzerine çıkılmamalıdır; çünkü bu konsantrasyonlar toksik ve tehlikelidir.Belirtilen önlemlere dikkat edin. Mount Ross delik tespiti için kullanılan prob çözeltisi, hazırlama aşamasında ışığa veya oksijene maruz bırakılmamalıdır ve tek hücreli Ross tespit yöntemi için taze olarak hazırlanmalıdır. PBS içinde FBS içeren bir durdurma çözeltisi hazırlanmalı ve 4 °C'de saklanmalıdır.Diğer hazırlıklar arasında, zebra balığı hava inkübatörünün 28 °C'ye ayarlanması ve tek hücre yöntemi için santrifüjün 4 °C'ye soğutulması yer alır. Zebra balığı çaprazlamaları, embriyo toplama ve anestezi işlemleri gerçekleştirilir. Standart metodoloji kullanılarak, döllenmeden sonraki 48 ile 72 saat arasındaki ilgili embriyolar toplanır.Embriyolar anestezi edildikten sonra anestezik maddeyi iki kez yıkayarak uzaklaştırın, ardından tek hücreli ham tespit için embriyoları, her birinde 30'dan fazla olmayacak şekilde üç kaba yerleştirin. Her koşul için birden fazla kapta en az 35 embriyo toplayın. Daha sonra, 10 mililitre oksidant çözeltisi veya negatif kontrol olarak ilgili çözeltiyi uygulayın.10 mililitre su uygulayın, ardından embriyolar 28 °C'de inkübe olurken 10 ila 60 dakika bekleyin. Ayrıca, yıkama işlemi için HBSS'yi 28 °C'ye önceden ısıtın. İnkübasyon sonrası, embriyoları sıcak HBSS içeren yeni bir kaba aktarın ve dairesel hareketlerle karıştırın.Ardından, tüm mount veya tek hücreli Ross saptama yöntemine geçiniz. Daha fizyolojik bir seçenek, NI Tomer ve arkadaşları tarafından tanımlanan kuyruk yüzgeci yaralama tekniğini kullanarak doku hasarı sonrası stres oluşturmaktır. Oksidan işleminden sonra, 10 adede kadar embriyodan oluşan grupları küçük tüplere aktarın.Bunları HBSS ile bolca durulayın ve folyo ile ışıktan koruyun. Ardından, her tüpe bir mililitre ham deteksiyon çözeltisi ekleyin ve tüpleri 28 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. Hem kontrol hem de deney koşullarını içerecek şekilde bir lam hazırlayın.Çukur lamın üzerini 300 µL metilselüloz ile kapatın. Metilselülozu boşaltırken hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Embriyo inkübasyonunun ardından, tüplerdeki solüsyonu hızlıca 2 mL HBSS ile değiştirin ve embriyoları yıkamak için tüpleri birkaç kez ters çevirin.Ardından embriyoları bir mikro pipet ucuyla aspire edin ve nazikçe işlem görmüş lam üzerine boşaltın. İnce bir naylon ip kullanarak embriyoları yönlendirin ve analiz için floresan veya konfokal taramalı mikroskop kullanımına geçin. Tüm embriyoların aynı ayarlar altında analiz edildiğinden emin olun.Embriyoları HBSS yıkamasından yeni bir kaba aktarın ve çözeltiyi mümkün olduğunca uzaklaştırın. Şimdi embriyoların koruyucu zarını (zona pellucida) manuel olarak giderin. Embriyoların tek hücrelere ayrışması için bu işlem gerçekten gereklidir.Ardından, embriyoları 24 kuyucuklu bir plakaya taşıyın ve her kuyucuğa 15 embriyo yerleştirin. Her bir koşul için tercihen üç kuyucuk doldurun. Daha sonra, tüm solüsyonu uzaklaştırın ve yerine 300 microliters HBSS, 30 microliters kollagenase p ve 50 microliters trypsin EDTA ekleyin.Bir mililitrelik pipet ucu kullanarak embriyoları triturasyonla homojenleştirin. Tüm kuyucuklar hazırlandığında, plakayı en az 20 dakika boyunca 28 °C'de bekletin; bu süre zarfında her beş dakikada bir, iyi bir homojenizasyon sağlamak için örnekleri triture edin. Ayrıca, dokular hazır olduğunda toplamak için bazı mikrosantrifüj tüplerini buz üzerinde bekletin.20. dakikada bir örnek alın ve mikroskop altında dokunun tek hücreli süspansiyona ayrışıp ayrışmadığını kontrol edin. Eğer ayrışmadıysa, inkübasyona toplamda 30 dakikaya kadar devam edin. Doku hazır olduğunda, reaksiyonu 200 µL ek durdurma çözeltisi ile durdurun.Bunu bir mililitrelik pipet ucu kullanarak TRI ile karıştırın. Ardından, her kuyucuğun içeriğini önceden soğutulmuş bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve bu tüpleri ışıktan uzak, buz üzerinde tutun. Sonrasında örnekleri 4 °C'de beş dakika boyunca 250 GS ile santrifüjleyin.Ardından, süpernatantı aspirasyon yoluyla uzaklaştırın. Hücre peletini, nazikçe pipetleyerek buz soğukluğundaki HBSS içinde yeniden süspande edin ve süspansiyonun en az 2 milyon hücre içerdiğini kontrol edin. Daha sonra, hücreleri bir mililitre ham hassas prob çözeltisi içinde yeniden süspande edin.Hücreleri oda sıcaklığında ve karanlıkta yaklaşık üç dakika boyunca inkübe edin. Bu inkübasyon süresini ampirik olarak ayarlayın. Ardından, hücreleri ışıktan korunan faks tüplerine aktarın.Transgenik belirteci saptamak için faks analizlerine geçiniz. Analiziniz sırasında floresan ve Ross prob floresanını değerlendiriniz. Arka plan floresanını normalize etmek amacıyla, kayıp seviyelerini her zaman kontrol örneklerine kıyasla kat artışlar şeklinde hesaplayınız.Bir yara bölgesindeki hidrojen peroksit birikimini incelemek için tüm Mount Ross tespiti kullanılmıştır. Oksidan uygulaması sonrası 20 dakika geçince, sağlam ve yaralı kuyruklar karşılaştırılmıştır. Her iki durumda da spesifik olmayan sinyal tespit edilmiştir.Embriyoların hidrojen peroksit seviyelerini düşürmek için ön işlemden geçirildiği aynı deney uygulanmıştır. OX inhibitörü VAs 28 70 kullanımı, saptanan sinyallerin gerçekten Ross birikim rotuna bağımlı olduğunu ortaya koymuştur. İşlem görmüş bilinen embriyolar ayrıca bütün mount yöntemiyle incelenmiştir.Yüksek büyütme altında anatomik bölgeler tanımlanabilmiştir. Tek hücreli Ross tespiti için faks yoluyla Ross pozitif hücrelerin floresan sayımıyla belirtildiği üzere Ross üretilmiştir. Bu analiz, ölü hücreler dahil edilmeden gerçekleştirilmiştir. Kontrol.İşlem görmemiş hücreler de analiz edilmiştir. Bu sonuçların karşılaştırılması, Ross birikiminin miktarının belirlenmesini oldukça kolaylaştırmıştır. Bu analiz yöntemi, herhangi bir sayıda deneysel manipülasyonun test edilmesi için mükemmel olduğu kanıtlanmıştır.Bu teknikten bir kez sonra hakim olunduğunda, düzgün şekilde uygulandığı takdirde 90 dakikada tamamlanabilir. Moleküler problarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceği ve önlemlerin gerekliliği unutulmamalıdır. Bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven kullanılmalıdır.

analysis-of-oxidative-stress-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Metabolik çalışmalar için-kullanılan altında olmuştur güçlü bir omurgalı modeli temsil zebrafish. Burada ölçmek için hızlı bir şekilde...

Zebra balığı Embriyolar Metabolik Profil Analizi

Bu video, sırasıyla DNA hasarını ve çift sarmallı DNA kırılmalarını gösteren 8-OHdG ve γH2AX seviyelerini ölçerek zebra balığı embriyolarının kalplerinde PM2.5'in neden olduğu oksidatif hasarı tespit etmek için oldukça hassas bir immünofloresan tabanlı testi göstermektedir.

Balık Embriyolarında PM2.5 Aracılı DNA Hasarını Tespit Etmek için İmmünofloresan Testi

Bazı genetik bozulmalar veya toksinlere maruz kalma, belirli hücre tiplerinin ölümüne yol açan normal gelişimsel süreçleri bozabilir. Zebra balığı embriyolarında tam montajlı immünofloresan ile aktive edilmiş Kaspaz 3'ün analizi, spesifik olarak apoptoz geçiren hücrelerin evre ve dokuya özgü lokalizasyonunu ortaya koymaktadır.

Aktif Kaspaz 3 Algılama Tüm montaj immünofloresans tarafından Zebra balığı Embriyolar Apaptozun Analizi

Zebra balığı, enerji homeostazı çalışmaları için önemli bir model organizmadır.  NADH2'ye duyarlı bir redoks indikatörü olan alamar Blue'yu kullanarak, zebra balığı larvalarının metabolik hızını 96 oyuklu plaka formatında ölçen ve ilaç veya gen keşfine uygulanabilen bir test geliştirdik.

Yüksek Verimli<em&gt; Danio rerio</em&gt; Enerji Harcaması Deneyi

teratojen Pozlama doğum kusurlarına neden olabilir. Balığı kimyasal teratojenik potansiyeli belirlemek için faydalıdır. Biz maruz kalma farklı zamanlarda da nitrit değişik düzeylerde embriyoların açığa tarafından zebrabalıkları yararını göstermektedir. Biz nitrit toksik ve ağır gelişimsel bozukluklara neden olduğunu göstermektedir.

Bir Model Olarak Zebra balığı Nitrit teratojenik potansiyelini değerlendirmek için

Zebra balığı embriyoları kimyasal bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılır. Onlar harici geliştirmek ve kimyasallara duyarlı, ince phenotik değişikliklerin tespitine izin. Deney sadece doğrudan embriyo içeren plaka eklenir bileşik küçük bir miktar gerektirir, test sistemi verimli ve maliyet-etkin hale.

Zebrabalığı Embriyoları Kullanılarak Kimyasal Bileşiklerin Toksisitesinin Hızlı Değerlendirilmesi

Bu protokol, zebra balığı embriyolarının parçalanmış kalplerinde PM2.5kaynaklı DNA hasarını tespit etmek için bir immünofluoresans testi kullanır.

Zebra Balığı Embriyo Kalplerinde PM2.5kaynaklı DNA Hasarını Tespit Etmek için İmmünofluoresans Kullanma

Zebra balığı son zamanlarda potansiyel radyasyon değiştiricilerini doğrulamak için bir model olarak kullanılmıştır. Mevcut protokol, radyasyona dayalı tarama deneyleri için zebra balığı embriyolarını kullanmanın ayrıntılı adımlarını ve farklı tedavilerin ve radyasyonun etkisini değerlendirmek için bazı gözlemsel yaklaşımları açıklamaktadır.

Potansiyel Radyosensitizörleri veya Koruyucuları Değerlendirmek için Bir Model Olarak Zebra Balığı Larvaları

Bu protokol, zebra balığı larvalarında döllenmeden 3-7 gün sonra bir ilaç tarama prosedürünü ve ardından morfolojik değerlendirmeyi tanımlar.

Erken Evre Zebra Balığı Larvalarında Küçük Molekül Taraması ve Toksisite Testi

RASopatiler, RAS-MAPK yolağı hiperaktivasyonunun neden olduğu multisistemik genetik sendromlardır. Doğrulanmayı bekleyen potansiyel olarak patojenik varyantlar sürekli olarak ortaya çıkarken, zayıf klinik öncesi kanıtlar tedaviyi sınırlar. Burada, genç muhabir zebra balığında canlı FRET görüntüleme ile RASopati ile ilişkili ERK aktivasyon seviyelerini ve embriyogenez sırasındaki farmakolojik modülasyonunu test etmek ve çapraz doğrulamak için in vivo protokolümüzü açıklıyoruz.

Canlı FRET mikroskobu ve immünofloresan ile erken zebra balığı Noonan sendromu modellerinde ERK aktivite modülasyonunu değerlendirmek için etkili bir protokol

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında kardiyak morfolojiyi ve işlevi değerlendirmek için düşük maliyetli bir ışık mikroskobu yöntemini açıklar ve gelişmiş görüntüleme sistemlerine ihtiyaç duymadan gelişimsel kardiyotoksisitenin tekrarlanabilir değerlendirmesini sağlar.

Zebra Balığı Embriyolarında Standart Mikroskopi ve Video Analizi Kullanılarak Fonksiyonel Kardiyak Görüntüleme: Çevresel ve Biyomedikal Araştırmalarda Uygulamalar

Öğrenin, canlı zebra balığı embriyolarında oksidatif stresi nicel ve nitel olarak ölçme yöntemini. Bu teknik, konfokal mikroskopi ve sitofluorometrik analiz ile ROS seviyelerini değerlendirir.

Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi

Daha fazla video keşfet