Rejeneratif Araştırma harmonik nanopartiküller

Aşağıdaki deneyin genel amacı, insan embriyonik kök hücrelerinden türetilen kardiyak atım kümelerinin in vitro olarak 3D gerçek zamanlı ve yüksek uzamsal çözünürlükte izlenmesidir. Bu, öncelikle embriyonik kök hücrelerin Embriyo cisimcikleri oluşturana kadar kültüre edilmesi ve genişletilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, atım kümeleri diseke edilir ve uzun süreli hava ortamında tutulmalarına olanak tanıyan POLYTETRAFLUOROETHYLENE veya PTFE gözenekli filtrelere ekilir.

Ardından, gerçek zamanlı çok fotonlu mikroskopi gerçekleştirmek amacıyla sıvı kültürlerdeki atan kümeler harmonik nanopartiküller ile işaretlenir. Elde edilen sonuçlar, mikroskobik ölçekte kardiyak kasılmaların uzamsal uzamasının ve frekansının analiz edilmesine olanak tanır. Dolayısıyla, bu nanopartiküllerin temel avantajı, özellikle kızılötesi olmak üzere herhangi bir dalga boyunun kullanılabilmesi sayesinde dokunun daha derinlerine inilebilmesi ve zamanla oldukça stabil kalmalarıdır.

Böylece uzun süreçlerimizi geniş zaman dilimleri boyunca izleyebiliriz. Bu kök hücre kültürü yöntemi, üç boyutlu kardiyomiyosit fonksiyonel kontraksiyon alanıyla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Özellikle kalp olgunlaşması ve doku mühendisliği konularında.

Yeni hastalık yöntemini kullanan bireyler, harmonik nanopartiküllerle etiketleme prosedürünün yalnızca çok fotonlu mikroskopi için kullanılabileceğinin ve diğer görüntüleme sistemi türlerine aktarılamayacağının farkında olmalıdır. Harmonik nanopartikülleri kullanma fikri ilk olarak 2005 yılında ortaya çıkmıştır. Bu nanopartiküller, floresan boyalara ve kuantum noktalarına göre avantajlar sunmaktadır.

Aslında, sinyalleri zamanla sönümlenmez ve gelişmekte olan örneklerin uzun süreler boyunca izlenmesi için kullanılabilirler. Örnek hazırlamanın görsel olarak gösterilmesi, özellikle ilaç testleri gerçekleştirilirken farklı adımların verimliliği ve tekrarlanabilirliği için kritiktir ve farklı dokulara veya hastalıklara da uygulanabilir. Doku modellemesi.

Metin protokolüne göre insan embriyonik kök hücreleri veya ESC'ler kültüre edilip genişletildikten ve sıcak kollajenaz ile 10 dakika boyunca inkübe edildikten sonra, koloni fragmanlarını iki mililitre taze farklılaşma besiyeri veya DM içinde toplayın ve 115 ×g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Embriyo gövdeleri veya eb'lerin oluşmasını sağlamak için koloni fragmanlarını ultra düşük yapışma özellikli altı kuyucuklu plaklarda dört gün boyunca süspansiyonda kültüre edin.

Ardından, yeni oluşan EBS'leri, atan kümeler görülene kadar 15 ila 30 gün boyunca %0,1 jelatin kaplı 24 kuyucuklu plakalara ekleyin. PBS'yi uzaklaştırın ve acutus kullanarak, santrifüj ve resüspansiyon işlemlerinden sonra kolonileri tek hücrelere ayırın; hücreleri DM ortamında süspanse ederek her bir kuyucuk bölmesine iki mililitre ekleyin ve 37 °C'de bir gün boyunca inkübe edin.

Yeni oluşturulan EBS'leri toplayın ve kültürde iki ila dört hafta geçtikten sonra, her kuyucuğa üç adet olacak şekilde %0,1 jelatin kaplı 24 kuyucuklu plakalara ekleyin. Atan kardiyomiyosit kümelerini tanımlayın ve uzun, ucu keskin bir pastör pipeti kullanarak bunları manuel olarak disseke edin. Her insert başına dört adet PTFE filtre yerleştirin ve her birini altı kuyucuklu bir plakanın kuyucuğuna yerleştirin.

Her birine bir mililitre DM ekledikten sonra, her bir PTFE filtre üzerine diseke edilmiş bir adet atan küme yerleştirin. Kümeleri etiketlemek için, atan kümelerin bulunduğu PTFE filtreleri 3,5 santimetrelik cam tabanlı bir kaba aktarın. Doğrusal olmayan optik görüntüleme yapmak için 50 µg/mL konsantrasyonda bir mililitre ikinci harmonik üretim nanoparçacıkları ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.

Etiketlenmiş HEB'ler veya atan kalp kümeleri bir görüntüleme odasına aktarıldıktan sonra, diferansiye olmuş EBS'ler veya aktif atan kümeler içindeki ilgi çekici yapıları belirlemek için beyaz ışık aydınlatması altında geniş alan görüntülemesi yapın. Kardiyak kümenin genel morfolojisini yeniden oluşturmak için düşük çözünürlüklü hızlı bir üç boyutlu tarama gerçekleştirin ve küme hacmi içerisinde, gerçek zamanlı olarak izlemek için görünür birkaç ikinci harmonik üretimi nanoparçacığının bulunduğu bir görüntü düzlemi seçin. Kardiyak küme kasılmaları, mikroskop optik tarayıcısını en hızlı moda getirerek iki boyutlu görüntülerin çok hertz hızında elde edilmesine olanak tanır.

Atım aktivitesini değerlendirmeden önce, burada gösterilen metin protokolüne uygun olarak MATLAB yazılımını kullanarak görüntüleri analiz edin. PTFE filtrelerin doğrusal olmayan optik yanıtının karakterizasyonu, çıplak substrattan foton floresansının çok zayıf olduğundan ve ilgili biyolojik örneklerin ölçülmesini ve izole nanoparçacıklardan gelen emisyonun alınmasını engellemeyeceğinden emin olmak için gerçekleştirilir. İkinci harmonik üretimi nanoparçacıkları, epi deteksiyon modunda substrat üzerinden görüntüleme yapılarak kolayca elde edilebilir.

Bu şekilde, ikinci harmonik üretimi nanoparçacıkları ile işaretlenmiş kardiyak yapılar ve EBS görüntülenmiştir. Kırmızı, sarı ve yeşil renkler NADH otofloresansına karşılık gelirken, yoğun mavi ikinci harmonik noktaları izole edilmiş ikinci harmonik üretimi nanoparçacıklarından kaynaklanmaktadır. Kuantum noktaları veya yukarı dönüştürücü nanoparçacıklara kıyasla iyi optik kontrasta ve nispeten seyrek işaretlemeye dikkat ediniz.

Bu şekil, ikinci harmonik üretimi nanopartikülleri ile işaretlenmiş, atan bir kardiyak hücre kümesinin kesit görünümünü göstermektedir. Bu videoda görüldüğü üzere, ikinci hücredeki kasılma modelini izlemek için 3D yapılar yüksek hızda kaydedilmiştir. NP hareketini çözümlemek için yüksek bir veri toplama hızını korumak amacıyla ikinci harmonik üretimi nanopartikülleri agregasyon oluşturmuştur.

Genel veri toplama hassasiyeti, ikinci harmonik üretmeden kaynaklanan ikinci harmonik emisyonla birlikte hücre otofloresansını kaydetmek için yeterli değildi. Video kareleri üzerinde gerçekleştirilen nanopartikül görüntü analizi, aynı kardiyak küme içindeki yer değiştirmelerin birkaç mikrometre mertebesinde olduğunu ve frekansın, düzlem içi ve dışı ikinci harmonik üretimi yapan nanopartikül hareketleri için sabit olduğunu göstermektedir. Hücre hazırlama tekniği uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütülürse küme diseksiyonu, hava-sıvı kültürü ve lambing işlemleri 24 ila 36 saat içinde tamamlanabilir.

Özellikle bu teknikte, kontaminasyonları önlemek için açık hava temaslarından kaçınılmalıdır. Bu prosedürü takiben, aksiyon potansiyeli profillerini üç boyutlu olarak atım frekansı ile ilişkilendirmek gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, çoklu elektrot dizileri kullanılarak yapılan elektrofizyolojik kayıtlar gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Harmonik nanoparçacıklar tarafından doğrusal olmayan sinyalin tespitine dayanan yeni tekniğimiz, görüntüleme için kullanılan dalga boylarının dokularda daha derin penetrasyona izin vermesi nedeniyle in vivo çalışmalar için daha da geliştirilebilir.

Olası bir gelişme, rejeneratif tıp uygulamaları için kök hücre türevli yapıların entegrasyonunun takip edilmesi olabilir.