Rejeneratif Araştırma harmonik nanopartiküller
1 Mayıs 2014
Protokol bilgilerini, ikinci harmonik üreten nanopartiküller ile in vitro etiketleme insan embriyonik kök hücreleri için temin edilmiştir. Çoklu foton mikroskopi ve kalp kümeler halinde kendi farklılaşma ile HESC soruşturma için metodolojiler de sunulmuştur.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, insan embriyonik kök hücrelerinden türetilen kardiyak boncuklanma kümelerinin 3D gerçek zamanlı ve yüksek uzamsal çözünürlükte in vitro olarak izlenmesidir. Bu, önce embriyonik kök hücrelerin Embry cisimciklerini oluşturana kadar kültürlenmesi ve genişletilmesiyle elde edilir. Daha sonra, çırpma kümeleri parçalara ayrılır ve POLİTETRAFLOROETILEN veya PTFE gözenekli filtreler üzerine kaplanır, bu da uzun süreli hava olarak muhafaza edilmelerini sağlar.
Sıvı kültürler daha sonra atan kümeler, gerçek zamanlı çoklu foton mikroskobu gerçekleştirmek için harmonik nanopartiküller ile etiketlenir. Elde edilen sonuçlar, mikroskobik ölçekte uzamsal uzama ve kardiyak kasılma sıklığının analizine izin verir. Bu nanopartiküllerin ana avantajı, herhangi bir dalga boyunu, özellikle de kızılötesini kullanabilmenizdir, böylece dokuda daha derine inebilirsiniz ve zamanla çok kararlıdırlar.
Böylece uzun süreçlerimizi uzun zaman dilimlerinde izleyebiliriz. Bu kök hücre kültürü yöntemi, kardiyomiyosit fonksiyonel kasılması alanındaki temel soruları üç boyutta yanıtlamaya yardımcı olabilir. Özellikle, kardiyak olgunlaşma ve doku mühendisliği.
Bireyler, yeni hastalık yöntemlerinde, harmonik nanopartiküller ile işaretleme işleminin sadece multifoton mikroskobu için kullanılabileceğini ve diğer tür görüntüleme sistemlerine aktarılamayacağını bilmelidir. İlk olarak 2005 yılında harmonik nanopartikülleri kullanma fikrimiz vardı. Bu nanopartiküller, floresan boyalar ve kuantum noktaları açısından avantajlar sunar.
Aslında, sinyalleri zamanla kaybolmaz ve uzun süreler boyunca gelişmekte olan örnekleri izlemek için kullanılabilirler. Numune hazırlamanın görsel olarak gösterilmesi, özellikle ilaç testi yapılırken farklı adımların verimliliği ve tekrarlanabilirliği için kritik öneme sahiptir ve farklı dokulara veya hastalıklara da uygulanabilir. Doku modelleme.
İnsan embriyonik kök hücrelerini veya ESC'lerini metin protokolüne göre kültürledikten ve genişlettikten ve bunları 10 dakika boyunca dört kez ılık kollajenaz ile inkübe ettikten sonra, koloni parçalarını iki mililitre taze farklılaşma, ortam veya DM'de toplayın ve yerçekiminin 115 katı basınçta üç dakika santrifüjleyin. Kültür, ultra düşük ataşmanlarda süspansiyon halinde koloni parçaları. Embriyo cisimcikleri veya ebs oluşturmalarına izin vermek için dört gün boyunca altı kuyulu plaka.
Daha sonra yeni oluşturulan EBS'yi, çırpma kümelerinin ortaya çıkmasına kadar 15 ila 30 gün boyunca% 0.1 Jelatin kaplı 24 oyuklu plaka üzerine yerleştirin. PBS'yi çıkarın ve acutus kullanarak, santrifüjleme ve resüsitten sonra kolonileri tek hücrelere ayırın, hücreleri tarım başına iki mililitre DM orta plakasında süspanse edin. Bir gün boyunca 37 santigrat derecede iyi oda ve inkübe edin.
Kültürde iki ila dört hafta sonra yeni oluşan EBS'yi ve plakayı% 0.1 jelatin kaplı 24 oyuklu plaka üzerinde oyuk başına üç plakayı toplayın. Atan kardiyomiyosit kümelerini tanımlayın ve uzun, keskin kesilmiş bir macun pipeti kullanarak, bunları manuel olarak inceleyin. Her bir uç için dört PTFE filtresi biriktirin ve her birini altı kuyulu bir plakadan oluşan bir kuyuya yerleştirin.
Her birine bir mililitre DM ekledikten sonra, her PTFE filtresine bir disseke çırpma kümesi ekleyin. Kümeleri etiketlemek için, PTFE filtrelerini çırpma kümeleriyle birlikte 3,5 santimetrelik bir cam alt tabağa aktarın. Mililitre başına 50 mikrogramda bir mililitre ikinci harmonik nesil nanoparçacık ekleyin ve doğrusal olmayan optik görüntüleme yapmak için 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
Etiketli HEB'leri veya kardiyak atım kümelerini bir görüntüleme odasına aktardıktan sonra, farklılaşmış EBS veya aktif atım kümeleri içindeki ilgili yapıları belirlemek için beyaz ışık aydınlatması altında geniş alan görüntülemeyi kullanın. Kardiyak kümenin genel morfolojisini yeniden oluşturmak için hızlı, düşük çözünürlüklü üç boyutlu bir tarama gerçekleştirin ve gerçek zamanlı olarak izlemek için birkaç görünür ikinci harmonik nesil nanoparçacık ile küme hacmi içinde bir görüntü düzlemi seçin. Kardiyak küme kasılmaları, mikroskop optik tarayıcısını en hızlı moda ayarlayarak iki boyutlu görüntülerin çoklu hertz ile elde edilmesini sağlar.
Dayak aktivitesini değerlendirmeden önce burada gösterildiği gibi metin protokolüne göre MATLAB yazılımını kullanarak görüntüleri analiz edin. PTFE filtrelerin doğrusal olmayan optik tepkisinin karakterizasyonu, çıplak substratın foton floresansına karşı çok zayıf olmasını ve ilgili biyolojik numunelerin ölçülmesini ve izole edilen emisyonun engellenememesini sağlamak için gerçekleştirilir. İkinci harmonik nesil nanopartiküller, epi algılama modunda substrat boyunca görüntüleme ile kolayca elde edilebilir.
Bu şekilde, kardiyak yapılar ve EBS olarak işaretlenmiş ikinci harmonik nesil nanopartiküller bıçak olarak gösterilmektedir. Kırmızı, sarı ve yeşil renkler NADH otofloresansına karşılık gelirken, yoğun mavi ikinci harmonik noktalar izole edilmiş ikinci harmonik nesil nanopartiküllerden kaynaklanır. Kuantum noktaları veya yukarı dönüşüm nanoparçacıkları ile karşılaştırıldığında iyi optik kontrasta ve nispeten seyrek etiketlemeye dikkat edin.
Bu şekil, kardiyak atım kümesi olarak etiketlenmiş ikinci bir harmonik nesil nanoparçacıkların bir kesit görünümünü göstermektedir. Bu filmde gösterildiği gibi, ikinci hücredeki kasılma modelini izlemek için 3D yapılar yüksek hızda kaydedilir. Harmonik üretim nanoparçacıkları, NP hareketini çözmek için yüksek bir edinme hızı oranını korumak için toplanır.
Genel edinim hassasiyeti, ikinci harmonik üretimden ikinci harmonik emisyon ile hücre otofloresansını kaydetmek için yeterli değildi. Film çerçeveleri üzerinde gerçekleştirilen nanopartiküller görüntü analizi, aynı kardiyak küme içinde yer değiştirmenin birkaç mikrometre mertebesinde olduğunu ve frekansın düz ikinci harmonik nesil nanopartikül hareketinin giriş ve çıkışı için sabit olduğunu gösterir. Hücre hazırlama tekniğine hakim olunduğunda, bahis kümesi hava sıvı kültürünü diseksiyon yapar ve uygun şekilde yapılırsa kuzulama 24 ila 36 saat içinde yapılabilir.
Özellikle bu teknikle, kontaminasyonları önlemek için açık hava temaslarından kaçınılmalıdır. Bu prosedürü takiben, aksiyon potansiyeli profillerini üç boyutta atma frekansı ile ilişkilendirmek gibi ek soruları yanıtlamak için çoklu elektrot dizileri kullanılarak elektrofizyolojik kayıtlar gibi başka yöntemler de uygulanabilir. Doğrusal olmayan sinyalin harmonik nanopartiküller tarafından tespit edilmesine dayanan yeni tekniğimiz, in vivo Çalışmalar, görüntüleme için kullanılan dalga boylarını enfekte ederek dokularda daha derin penetrasyona izin vermesi için daha da geliştirilebilir.
Olası bir gelişme, rejeneratif tıp uygulamaları için kök hücrelerden türetilmiş yapının entegrasyonunu takip etmek olabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler) ikinci harmonik üreten nanopartiküller kullanılarak in vitro etiketlenmesi için bir protokol sunmaktadır. hESC'leri çok fotonlu mikroskopi ile incelemek ve bunların kardiyak kümelere dönüşümünü ayrıntılı olarak ele almaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kök Hücre Araştırması
- Kardiyak Biyoloji
- Mikroskopi Teknikleri
Arka Plan
- İnsan embriyonik kök hücreleri çeşitli hücre tiplerine dönüşebilir.
- Kardiyak boncuk kümelerinin izlenmesi, kalp gelişimini anlamak için kritik öneme sahiptir.
- İkinci harmonik üreten nanopartiküller görüntülemede avantajlar sunar.
- Çok fotonlu mikroskopi, gerçek zamanlı analiz için yüksek uzamsal çözünürlük sağlar.
Çalışmanın Amacı
- hESC'lerden türetilen kardiyak boncuk kümelerini gerçek zamanlı izlemek.
- Kardiyak kasılmaların uzamsal uzamasını ve frekansını analiz etmek.
- Derin doku görüntüleme için nanopartiküller kullanmak.
Kullanılan Yöntemler
- Embroid bedenleri oluşturmak için hESC'lerin kültürlenmesi ve genişletilmesi.
- Çarpan kümeleri PTFE gözenekli filtrelere kesmek ve yerleştirmek.
- Çarpan kümeleri harmonik nanopartiküllerle etiketlemek.
- Gerçek zamanlı çok fotonlu mikroskopi analizi gerçekleştirmek.
Ana Sonuçlar
- Mikroskobik ölçekte kardiyak kasılmaların başarılı bir şekilde izlenmesi.
- Nanopartiküllerin zamanla stabilitesinin gösterilmesi.
- Daha derin doku penetrasyonu için çeşitli dalga boylarının kullanılabilirliği.
- Kardiyak küme davranışlarının dinamiklerine dair içgörüler.
Sonuçlar
- Metod, kardiyak kümelerin in vitro olarak etkili bir şekilde izlenmesine olanak tanır.
- İkinci harmonik üreten nanopartiküller görüntüleme yeteneklerini artırır.
- Bu yaklaşım, kök hücrelerden kardiyak gelişimin anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Labeling human embryonic stem cell-derived cardiac clusters with second harmonic generation nanoparticles (HNPs) enables high-resolution, real-time 3D monitoring of tissue dynamics critical for regenerative research. This approach provides stable, deep-tissue imaging for extended observation of cardiac maturation and functional contraction, supporting predictive confidence in early discovery and tissue engineering workflows. The method advances portfolio decision-making by enabling quantitative, reproducible analysis of stem cell-derived tissue constructs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of cardiomyocyte function and maturation in 3D tissue models.
- Supports mechanistic de-risking by providing direct visualization of contractile behavior in stem cell-derived systems.
- Facilitates functional target validation for cardiac tissue engineering and regenerative medicine research.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, labeled cardiac clusters for downstream multiphoton imaging assays.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of contraction frequency and displacement patterns.
- Supports assay standardization and scalability for compound evaluation in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling 3D functional analysis of cardiac constructs.
- Provides continuity from discovery-stage tissue modeling to preclinical validation of regenerative therapies.
- Reduces biological risk by supporting predictive assessment of tissue integration and function.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, functional validation, and quantitative analysis of stem cell-derived cardiac tissues.
- Discovery Biology: Supports mechanistic studies of cardiac differentiation and contractility in engineered tissues.
- Screening: Provides robust, quantitative imaging outputs for evaluating functional endpoints.
- Analytics: Enables measurement of displacement and contraction frequency for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro tissue modeling with preclinical assessment of regenerative strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis platform for diverse tissue engineering applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac tissue research.
- Operational Value: Delivers stable, reproducible imaging over long-term experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in regenerative portfolio development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of tissue engineering and regenerative medicine programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, tissue engineering, and multiphoton microscopy.
- Needs access to advanced imaging platforms and quantitative analysis software (e.g., MATLAB).
- Demands cross-team standardization of labeling and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation to other tissue types or disease models may require protocol optimization.
- Labeling with HNPs is limited to multiphoton microscopy and not transferable to other imaging modalities.
