Name: Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-17T16:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Öğrenin, fare embriyo kalplerine hücre ve DNA enjeksiyonu yaparak hücre kaderini izleme ve gen ifadesini yerel olarak manipüle etme yöntemlerini. Bu teknikler, kalp gelişimi ve gen fonksiyonlarını in vivo ortamda araştırmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Vakfı Leducq (Mitral) ve Agence Nationale bu araştırmalara fon la Recherche (ANR Specistem hibe) dökün kabul.

1.. Hazırlık Hayvan Prosedürleri Bir hayvan etik kurul onay almak ve virüs ile çalışmak için kurumsal yönergeleri izleyin, HuESC ve / veya iPSC (varsa) yanı sıra, fare kullanımı, fare embriyo elde edilmesi, ve fare ameliyat. Zamanlı eşleştirmesi için, tıpanın gün embriyonik gün (E) 0.5 / 0.5 gün post-coitum olarak kabul edilir. <ol><li> Mikroenjeksiyon iğneler: Ex utero mikroenjeksiyon için, 1 ya da 10 mikron iç uç çapını ve sırasıyla, DNA veya hücreleri enjekte etmek için keskin ve konik ucu şeklini almak için bir pipet çektirmenin / beveller kullanılarak cam pipetler (1.2 mm dış çaplı borosilikat kılcal tüpler) çekin. Ultrason aracılı enjeksiyonlar için, kullanımı, 50/35 um OD / ID ucu ile mm/0.53 1.14 mm&#39;lik bir iç / dış çapa (OD / İD) sahip steril iğneler, özel. </li><li> Silikon dolu petri: Kılavuzunda açıklandığı gibi silikon hazırlayın. Doldurmak~ 1 sm bir elastomer tabakası ile temiz bir cam 60 mm çapında Petri kabı. Hava kabarcıkları kaçının. </li><li> Araçlar: İşlem sırasında önce ve tüm cerrahi aletler steril tutun. </li><li> DNA hazırlanması: Tek bir tüp içinde 3 ug DNA ve 12 ul Opti-MEM ekleyin. Başka bir tüp içinde 3 ul Lipofektamin 2000 ve 12 ul Opti-MEM ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin ve her iki çözümü karıştırın. Hemen kullanın. </li><li> Hücre hazırlanması: 10 6 hücre süspansiyonunu hazırlamak / ml DMEM (Dulbecco&#39;nun Eagle Medium, yüksek glikoz ve% 50 fare) tedaviden geçirildi. Nihai hücre süspansiyonu, 50 ul 8-10 embriyolar için yeterlidir. </li><li> Boya hazırlama: 25 mg / ml DMSO de yeşil floresan CDCFDA-SE kullanın. -20 ° C&#39;de 20 ul alikotları ve mağaza hazırlayın Steril serum fizyolojik veya PBS kullanımdan önce 1:100 / 1:200 sulandırmak. </li><li> Virüs hazırlanması: ~ 10 9 10 -10 tra bir titreye sahip olan ticari bir 3. kuşak PGK-GFP-ifade lentivirüs kullanınbirim / ml DMEM nsducing. Lentivirüsünün hazırlanması için, Tiscornia vd. 14. kişisel koruyucu ekipman giyin ve güvenli bir şekilde kullanımı ve virüs imha bakın. </li></ol> Ex vivo Enjeksiyon için E9.5 ve E10.5 Embriyolar 2. Koleksiyonu <ol><li> Embriyonik gün 9.5 veya 10.5 hamile bir fareyi Euthanize. </li><li> % 70 etanol ile fare göğüs ve karın sterilize edin. </li><li> Karın açmak ve PBS içinde oda sıcaklığında uterin boynuz almak ve M16 ortamı ile bir silikon dolu bir Petri kabı iki PBS yıkar sonra aktarmak için bir ventral orta hat kesi olun. </li><li> Rahim vaskülarize yan alt böylece silikon tabakaya böcek pimleri ile uterin boynuzu Pin. </li><li> Yüzeyinin 1 mm ince forseps ile rahim yüzey ve desidua bir kapak kesin. </li><li> Yavaşça desidua duvarlar dışarı yayarak yumurta kesesinde embriyo almak. </li><li> 37 ° embriyolar Mağaza, Hücre enjekte edilmeden önce C M16 ortam. Enjeksiyon için her bir embriyo önceden ısıtılmış 37 ° C de M16 ortamı ile doldurulmuş silikon kabına aktarılır </li></ol> Stereomicroscope altında 3. DNA veya Hücre Enjeksiyon <ol><li> Bir Hamilton şırınga ile arka cam pipet doldurun ve ucunda kabarcıklarını çıkarmak için pipet sallayın. </li><li> Mikroenjeksiyon tutucuya pipet ayarlayın; 50, tutma basıncı (DNA) ya da 30 (hücreler) hPa ve 300 (hücre) için 150 enjeksiyon basıncı (DNA) hPa ayarlayın. 0.2 sn (DNA) veya 0.5 saniye (hücre) için enjeksiyon zamanı ayarlayın. Bu ayarlar, hafif mikroenjektör ve pipet türüne göre değişiklik gösterebilir. </li><li> Uygun embriyo dokunmadan sarısı ile silikon alt embriyo Pin. Kalbin bölge izlemek ve sadece bu bölgede yukarıda kese açık. </li><li> Hücre enjeksiyonu sırasında herhangi bir hareketi önlemek için embriyo yaklaşık 4 işaretçilerine ekleyin. </li><li> (Manuel ayarlı) mikromanipülatör kullanarak, slowlSadece (Şekil 1), enjekte edilecek olan kalbin bölgenin üstüne perikard en az 45 ° &#39;lik bir açı y konumu pipet ucu. </li><li> Ilgi bölgesi içine pipet hareket ve enjeksiyon tetikler. Mümkün olduğunca çabuk pipet dışarı atın. Emin kalp düzgün DNA / hücre enjeksiyonu sonra dayak olun. </li></ol> 4.. Embriyo, İzole Kalp ve Eksplantasyon Kültür <ol><li> Penisilin / streptomisin, 37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış ve% 40 O2 ile oksijen ile takviye edilmiş% 25 M2 ortamı ve% 75 sıçan serum içinde kültür E9.5 embriyolar. </li><li> , 25 ml&#39;lik bir cam tüp içinde 2 ml kültür ortamı nazikçe embriyo ekleyin ve boru üzerine kapak vidalanarak önce% 40 O2 ile oksijenat. Döner ya da (30 devir / dakika) çalkalanarak 37 ° C&#39;de 36 saate kadar inkübe edin. </li><li> Istediğiniz zaman noktasına (örneğin 24 saat) At, ilk DE, kalpleri dokunmadan, ince forseps ile dikkatlice kalpleri teşrihEmbriyoların capitating; kalp uzak çıkış yolunu kullanarak dışarı çekerek ÖTV kolaydır. </li><li> Kültür, 12 oyuklu bir plaka içerisinde geçen bir Matrigel ile kaplanmış bir ek üzerine% 50 FCS ile DMEM içinde 36-48 saat boyunca bir kalp izole edilmiştir. Kalp kültürünün 15 geliştirilmiş bir protokol için Dyer ve Patterson (2013) bakınız. </li><li> Ilgili bölgenin herhangi bir eksplant yapın. Bir örnek olarak, kollajen tip 1 jel 16 üzerinde 48 saat için atriyo-ventriküler kanal (AVC) ve kültür teşrih. </li></ol> Kalp I n utero 5. Ultrason eşliğinde Enjeksiyon <ol><li> Ultrason makinesi ve mikropüskürtücünün Kurulum: <ol><li> Bir ray üzerinde 40 MHz transdüser ve mikroenjeksiyon kurulum ile yüksek çözünürlüklü ultrason sistemi kullanın. </li><li> Enjeksiyon başına 69 nl de mikroenjektör üzerinde enjeksiyon ses seviyesini ayarlayın. Mikropüskürtücüden programlama için üreticinin mikroenjeksiyon kılavuzuna bakın. </li></ol></li><li> Microi hazırlanmasınjection kurulum ve enjeksiyon: <ol><li> Mikroenjektör bir cam mikropipet yerleştirin. Maksimum hacme kadar aspire verimli enjeksiyon, ilk kapladıkları mineral yağ ile pipet iç tarafını sağlamak. Daha sonra, iğne içindeki yağın 1-2 mm&#39;lik bir uzaklık bırakarak yeniden yağ çıkarın. </li><li> Maksimum ses ulaşılana kadar enjektat aspire. Bu ucu künt ve enjeksiyon daha zor hale getirecek gibi iğne ucu ile herhangi yüzeylerine dokunmayın için dikkatli olun. </li><li> Enjeksiyon sırasında embriyoları içeren uterin boynuzu stabilize etmek için, merkezi kesilmiş küçük bir yarık ile donatılır, ince silikon membran ile kaplı ortasında bir delik olan bir tadil edilmiş Petri kabı (2.5 cm çaplı), kullanımı ve insizyon üzerinde konumlandırmak . Yemeğin kenarlarının altında kil 3-4 yığınları konumlandırarak fare taşıma masaya Petri stabilize. </li></ol></li><li> Enjeksiyon prosedürü: <ol><li> Önce anestezi için (istenen embriyonik aşamada) hamile bir fare karın Tıraşsia saç kaldırmak için. Kalıntı tüylerden ve% 70 etanol ile sterilize etmek için, bir kimyasal saç temizleme maddesi ile karın tedavi. </li><li> Bir maske ile oksijen / izofluran ile hamile bir fare anestezisi. Prosedürün geri kalan kısmı boyunca 1-1.5%, ardından ilk anestezi için,% 100 oksijen içinde% 3-5 izofluran kullanın. Fare yeterince hafifçe pençeleri ve / veya kuyruk kısma anestezi emin olun. </li><li> (37 ° C ısı ayarlı) fare taşıma masaya fare sırtüstü yerleştirin ve korneanın su kaybını önlemek için yağlayıcı ile gözlerinizi kapayın. </li><li> Elektrotlar üzerinde elektrot jeli uygulayın ve kalp hızı, solunum hızı ve EKG izlemek için elektrotlara pençeleri bantlayın. Vücut sıcaklığını izlemek için bir rektal termometre yerleştirin. </li><li> İlk fare görselleştirme ve ultrason ile embriyolar sayarak hamile olduğunu doğrulayın. Karın ultrason jeli uygulayın ve mesane üzerinde tarama kafasına yerleştirin. Tutarlılık için, ilk olarak mesane görselleştirmekve mesane konumdan başlayarak, sol ve sağ embriyolar rahim boynuzları sayılır. Embriyonik kalpleri normal yenerek emin olun. </li><li> Fare hamile ise, kil ile gelecek kesi yukarıda Petri kabı yerleştirin. Çanak direkt temas halinde olduğunu böylece biraz karın üzerine çanak basın. </li><li> Çanak çıkarın ve tekrar karın sterilize. Karın ve periton açmak için, yaklaşık 0.75-1 cm vajina üzerinde, bir 1.5-2 cm ventral orta hat kesi olun. Iç organlara zarar görmesini önlemek. </li><li> Forseps ile sol veya sağ uterin boynuz Exteriorize, yavaşça yemeğin silikon zarından çekin ve tekrar kil üzerine çanağı stabilize. Önlemek kapsamlı bu uterus damarları ve kadın ve / veya embriyoların erken ölüm kanamaya neden olabilir bu yana, çekme ya da manipülasyon. </li><li> Embriyolar enjekte edildiği, yeterli kayıt tutulmasını sağlamak için tekrar embriyolar saymak. </li><li> U üzerinde ultrason jeli uygulayıngörüntü Terine boynuzları kalp ve dehidratasyonu önlemek için. </li><li> Görüntü ilk embriyo enjekte edilecek. Embriyonik kalbin normal dayak kontrol edin ve embriyonun kaudal-kafatası ve sağ-sol yönelim kayıtlarını tutmak. Gerekirse, uygun yönlenmesinin sağlanması için hafifçe uterin boynuzu yerleştirin. Bu zor ise, bir sonraki embriyo geçmek. </li><li> Biraz (Şekil 3) perikard dışında, embriyo üzerinde 45 ° açı iğne konumlandırmak için mikroenjeksiyon iğne ile dikkatlice rahim delinme. Bu atriyoventriküler oluk (Şekil 3) doğru çekiyor, böylece epikardiyal hücrelerin etiketlenmesi için, görüntü dört odacık görüntüsü kalp ve iğne pozisyon. Açısı ayarlanabilir gerekiyorsa, iğneyi çekin ve yeniden konumlandırmak. Bu iğneyi bozabilecek yana, rahim içinde iğne ile açısını ayarlamak etmeyin. Böyle bacaklarda veya plasenta gibi diğer dokuları, delinmesiyle kaçının. </li><li> Iğne taşımakperikard duvara ve yumuşak, ama hızlı hareket ile delinme. Genel olarak, orada bazı direnç olacak, fakat çok hızlı iğne hareket iğne ucu kalbi kendisi delinmeye neden olabilir. Ucu atriyoventriküler oluk perikard uzayda bitmelidir. Perikardiyal kanama durumunda, kan hücreleri, beyaz bir kar-benzeri bir model olarak görünür olacaktır. Bu durumda, embriyo enjekte durdurmak ve başka bir embriyo geçmek. </li><li> Enjekte edilecek enjekte edilir. Kalpler gelişimi üzerine olumsuz etkiyi önlemek için perikard uzaya maksimum 700 nl enjekte edilir. Perikardiyal kese hafif, geçici şişlik uygun enjeksiyon izleyin. </li><li> Enjeksiyonu takiben, dışarı iğneyi çekin ve enjektat hala iğne doku parçaları tarafından tıkanmış değildi sağlamak için çıkarılır olabilir onaylamak. </li><li> Görüntü işleme tablo konumlandırmak ve sonraki embriyo enjekte. Önlemek için (bir uterin boynuz) 3-4 maksimal enjekte edilen embriyoların sayısını tutunzıt uterin boynuzu kontrol embriyoları için izin vermek için ve prosedür, embriyo gelişimini rahatsız değil sağlamak için, anestezi genişletilmiş. </li><li> Embriyo istenilen sayıda enjekte ettikten sonra, fazla ultrason jeli kaldırın ve yavaşça onun uygun pozisyonda karın içine geri uterin boynuz yerleştirin. </li><li> Bir periton ve karın kasları için ameliyat dikiş ipliğinin bir tabaka ve cilt için dikişin ikinci bir katman kullanarak maternal karın kapatın. </li><li> Ağrı kesici ilk dozu ile fare enjekte edilir. Önceki 12 saat aralıklarla anestezi ve üç ek enjeksiyonları biten 0.05-0.1 mg / kg Buprenorphine 15 dakika bir enjeksiyonunu kullanın. </li><li> Anestezi durdurun ve prosedür yeterli kurtarma için fareyi izlemek. Ev izlem süresi için arzu edilen tek bir kafes içinde gebe fare. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes%3A+a+methods+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circ. Res. 111, 344-358 (2012).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organ+tissue+engineering%3A+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li>
<li>Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructing+the+differentiation+niche+of+embryonic+stem+cells+using+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials.</a> Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).</li>
<li>Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cardiac+development%3A+a+view+from+stem+cells+to+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Early cardiac development: a view from stem cells to embryos.</a> Cardiovasc. Res. In press, (2012).</li>
<li>Cai, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myocardial+lineage+derives+from+Tbx18+epicardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells.</a> Nature. 454, 104-108 (2008).</li>
<li>Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+human+stem+cells+into+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of human stem cells into the chicken.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+limb+and+brain+patterning+in+early+mouse+embryos+by+ultrasound-guided+injection+of+Shh-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells.</a> Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).</li>
<li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase%3A+the+universal+reagent+for+genome+tailoring%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26, 99-109 (2000).</li>
<li>Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+cells+for+tracking+cell+lineage+and+clonal%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Tracing cells for tracking cell lineage and clonal.</a> Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).</li>
<li>Phoon, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tools+for+the+developmental+biologist%3A+ultrasound+biomicroscopy+of+mouse+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development.</a> Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).</li>
<li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ex+vivo+Culture+Method+for+the+Embryonic+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vix.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse.</a> J. Vix. Exp. , (2013).</li>
<li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels%3A+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Yukarıda tarif edilen intra kardiyak ex vivo enjeksiyon protokolleri orta aşama (E9.5-E11.5) fare embriyo en az 48 saat boyunca miyokard fonksiyonu korumak için tasarlanmıştır. Bu enjeksiyon yaklaşımlar DNA ya da hücre konumsal hedeflenen enjeksiyon için izin verir. Şekiller 1-3 de gösterilen birkaç örnek ex vivo ve bu endokardiyal veya epikardiyal hücre EMT olarak kısıtlı kalp bölgelerinde yer alan gelişimsel süreçlerinin vivo moleküler mekanizmalar tasvir konseptini...

Daha on yıl önce, insan embriyonik kök hücreleri (HuESCs) insan blastosistlerin 1 elde edilmiştir. O zamandan beri, bu hücreler, insan gelişim biyolojisi karşılanmamış sorular adresleri önemli bir araştırma alanının konusu haline gelmiştir. HuESCs ayrıca rejeneratif tıpta umut sağladı. Son yıllarda, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) 2 genetik hastalık modelleri sağlayan, hastaya özgü somatik hücrelerinden elde edilmiştir. Kalp soy 3 de dahil olmak üzere çeşitli hücre soyları, doğru ya da embriyonik uyarılmış pluripotent kök hücrelerin farklılaşması için in vitro protokol birçok rapor edilmiştir. Farklılaşmış hücreleri genellikle RNA ve protein ifadesi, immun boyama, ve / veya in vitro fonksiyonel testler analizi ile fenotiplenir. Bununla birlikte, pluripotent kök hücresi türevleri tam cel elde olup olmadığını test etmek için uygun bir oluşum safhasındaki bir ortamda yerleştirilmesi gerekirl kendi embriyonik meslektaşı kaderi ve bölgesel uyaranlara yanıt olarak gerçek in vivo fonksiyonu özetlemek ister. Doku mühendisliği umut verici olmasına rağmen, henüz gelişmekte olan embriyonik doku 4,5 in vivo olarak uygun tüm bilinen ve bilinmeyen ipuçları sağlamaz. Fare embriyoları içeren embriyolar, boyalar veya retroviral vektörlerle hücre etiketleme, kalp gelişimi 6 sırasında hücre soylarının embriyonik kökeni gibi önemli bilgileri getirdi. Örneğin, izole edilmiş kalpler in vitro kültürü ile, ardından ex vivo fare embriyoları, en perikardiyal boşluğu içine enjeksiyon boya, epikardiyal hücreleri ve bunların soyundan 7 etiketlemek için kullanıldı. Ancak, boya ve retroviral hücre etiketleme çoğunlukla 8 daha kolay erişilebilir hala az gelişmiş organ veya tavuk embriyolar, erken fare embriyoları tatbik edilmiştir. Bir istisna e hedef kolaydır, beyin tarafındanmbryos 9,10. Böyle bir yaklaşım, henüz dayak embriyonik fare kalp tatbik edilmemiştir. Boyalar ya da virüs doğrudan etiketleme tamamlayıcı olarak ve daha ileri evre fare embriyo ve yetişkin farelerde izleme soy gerçekleştirmek için, hücre etiketleme yaklaşımı Cre / Lox teknolojisi kullanılarak transgenik farelerin analizi ile kombine edilmiştir. Cre / Lox yaklaşımı 11 ancak rekombinazın ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılabilir genomik düzenleyici bölgelerin uzaysal özgüllük ve Cre / Lox rekombinasyon 12 verim nedeniyle bazı sınırlamalar vardır. Sadece Cre ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılan düzenleyici bölgesi aktivasyonunun ardından bir ön etiket gibi Bundan başka, bu yaklaşım, tam hücre kaderin hücre göçü odaklı edinim özel soruları gidermez. Ayrıca bariz etik sorunları için insan embriyosu için geçerli olamaz. Bu sınırlamalar göz önüne alındığında, biz yeni p bir dizi tasarlanmışhedeflenmiş bölgelerinde bu gibi floresan boyalar, virüs, ve bu shRNAs DNA-bazlı hücre etiketleme vektörleri gibi gen ekspresyonu modülatörlerinin veya E9.5 ve gelişiminin sonraki evrelerinde de fare embriyo hücreleri gibi hücre etiketleme çeşitli ajanlar enjekte rotocols kalp. DNA / hücre enjeksiyonları Stereomikroskopta ve 48 saat veya 48-72 saat boyunca izole kalp ya da embriyonik eksplant kültürü kadar ex vivo embriyo kültürü ile birlikte basit bir mikroenjeksiyon cihazı kullanın. Biz de rahimde fare embriyonik gönlünde bir ultrason aracılı mikroenjeksiyon protokol rapor. Bu teknik embriyoların 13 gelişimini izleme sağlar ve injectates ve / veya etiketli hücrelerin uzun süreli takip için izin verir. Biz, bu yaklaşımlar organın işlevini korumak ve kök hücre potansiyeli in vitro test daha temsili bir ortam temin ettiği bulunmuştur. Ayrıca göç takip fırsat sağlarkendi kaderini izlemek hücreleri etiketli ve / veya enjekte. Sonuç olarak, bu bölge, doku desenleme ve önemli biyolojik süreçlerin daha iyi bir anlayış elde edilmelidir.

<table><tbody><tr><td>Setups/Donanım</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 MHz Dönüştürücü</td><td>VisualSonics</td><td>MS550S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroenjektör VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjektör Eppendorf</td><td>5242</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5171</td><td></td></tr><tr><td>Enjektörü basınçlandırmak için gereken</td><td>nitrojen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ray sistemi</td><td>VisualSonics</td> döndürücü<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>, <td>inkübatörün içindeki embriyolarla cam tüpü döndürmek için</td></tr><tr><td>Standart inkübatör</td><td></td><td></td><td>% 5 CO2, 37 & 176; C</td></tr><tr><td>stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Keşfi. V8</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Mikroenjeksiyon</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat kılcal borular</td><td>Dünya Hassas Enstrüman</td><td>KTW-120-6</td><td>1.2-&mu; m dış çap</td></tr><tr><td>Pipet çektirme</td><td>Sutter</td><td>Model P87</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon iğneleri</td><td>Origio-Humagen</td><td>C060609</td><td>OD/ID 1,14 mm/53 mm, 50/35 & mu ile; m OD / ID ucu</td></tr><tr><td>Hamilton şırıngaları ve nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td></td><td></td><td>10 cm çap</td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Silikon membran</td><td>Visualsonics</td><td></td><td>4,3 x 4,3 cm</td></tr><tr><td>Play-Doh</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet Bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tüy dökücü madde&nbsp;</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eye yağlayıcı</td><td>Optixcare</td><td>31779</td><td></td></tr><tr><td>Elektrot jeli (Signa)</td><td>Parker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Sofsilk 5-0</td><td>S1173</td><td></td></tr><tr><td>Ultrason jeli</td><td>Aquasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenex Buprenex (buprenorfin hidroklorür)</td><td>Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td>tuzlu suda 0.05-0.1 mg</td></tr> <tr><td>< güçlü>Diğer< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Silikon Elastomer</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Cam petrisaplar</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td></td><td>60 mm çap</td></tr><tr><td>Böcek pimleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26002-20</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Medya ve kültür reaktifleri< / güçlü> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimem orta</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>51985026</td><td></td></tr><tr><td>M2 orta</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-640F</td><td>yüksek glikoz ve% 50 sıçan serumu</td></tr><tr><td>M16 orta</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan serumu</td><td>Janvier</td><td>ODI 7158</td><td></td></tr><tr><td>Pennicilin / streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-12</td><td></td></tr><tr><td>oksijen %40</td> <td>Embriyo kültür ortamını oksijenlendirmek için gereken</td> <td>hava sıvısı</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>Fisher</td><td>RVJ35882</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen tip I</td><td>BD</td><td>354236</td><td>eksplant kültürü için kültür kaplarını kaplamak için</td></tr><tr><td>Kültür kapları</td><td>Dutcher / Turuncu</td><td>131020</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Enjekte eder< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>CDCFDA-SE</td><td>İnvitrojen / Moleküler Problar</td><td>C1165</td><td>25 mg / ml DMSO. -20 & # 176; C'de saklayın Kullanmadan önce 1: 100-200 oranında tuzlu su ile seyreltin.</td></tr><tr><td>PGK-GFP eksprese eden lentivirüs&nbsp;</td><td></td><td></td><td>~8E9 dönüştürücü birim/ml DMEM</td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11668019</td><td></td></tr></tbody></table>

embriyonik fare kalpler gelişmekte hücre etiketleme ve enjeksiyon

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

In vitro protokol embriyonik veya pluripotent kök hücre-türevlerinin kaderini test edilmesi zorunlu olarak in vivo potansiyel yansıtmaz tartışmalı sonuçlara yol açmıştır. Tercihen, bu hücreler, belirli bir fenotip elde etmek için uygun bir oluşum safhasındaki bir ortamda yerleştirilmelidir. Ayrıca, boya veya retroviral vektörler ile hücrelerin etiketlenmesi sonra fare çalışmaları izleme hücre soyu hala az gelişmiş organları ile erken evre fare embriyoları çoğunlukla sınırlı kalmıştır. Bu sınırlamaları aşmak için, E9.5 ve gelişiminin sonraki aşamalarında fare embriyosunda kalp hedeflenen bölgelerde çeşitli maddeler enjekte etmek, standart ve ultrason aracılı mikroenjeksiyon protokolleri tasarlanmıştır. Embriyonik eksplant ya da embriyolar ya da daha fazla kültürlendi utero geliştirmeye bırakılır. Bu maddeler, fluoresan boyalar, virüs, shRNAs veya hücre-türevi projenitör hücrelerini içerir. Bizim yaklaşımlar fu korunması için izinorganın nction göçünü ve işaretlenmiş ve / veya enjekte edilen hücrelerin kaderini gözlenerek. Bu teknolojiler diğer organlara uzatılabilir ve gelişim biyolojisinde önemli biyolojik soruları için çok yararlı olacaktır.

Yukarıda tarif edilen enjeksiyon protokolleri kullanılarak, hücreler, &#39;etiketlenmiş ve / veya embriyonik fare kalp içine enjekte edilebilir. Kavramının kanıtı olarak, birkaç örnek enjeksiyon protokolü ve ex vivo AVC eksplant, izole edilmiş kalp veya bir bütün olarak embriyo kültürü (Şekil 1) bir araya getirilmiş olduğu gösterilmiştir. Şekil 1, hücre enjekte edilmeden önce embriyonun hazırlanışını göstermektedir. Yumurta sarısı kese (Şeki...

Biz, (E) 9.5 ve daha sonraki aşamalarında embriyonik gün fare embriyoları olan embriyonik veya pluripotent hücrelerinden elde edilen iç ve aşılanmış hücrelerden hücre kaderine ve fenotipi hem izlenmesi amacıyla, boyalar enjekte DNA vektörleri, virüs, ve hücreler, bir dizi yöntem tarif gelişme.

Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik fare kalplerine hücre, boya veya DNA enjeksiyonu gerçekleştirmektir. Hücre kaderini incelemek veya gen ekspresyonunu lokal olarak manipüle etmek için bu işlem, öncelikle embriyoların gebe bir fareden diseke edilmesi ve embriyonik kalbin açığa çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, kalbin hedeflenen ilgili bölgesine DNA, boya veya hücreler enjekte edilir.Ardından, embriyo inkübe edildikten sonra kalp çıkarılır ve kültüre alınır. Son olarak, enjekte edilen veya işaretlenen hücrelerin akıbeti mikroskopi yoluyla belirlenir. Nihayetinde; enjekte edilmiş, işaretlenmiş veya genetiği değiştirilmiş hücrelerin akıbeti, kardiyak gelişim sırasında spesifik genlerin ve hücrelerin fonksiyonel önemini ortaya koyan konfokal mikroskopi veya ışık ve epi-floresans mikroskopisi ile izlenir.Bu tekniğin, farede transgenez gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, laboratuvar üretimi veya genetik olarak modifiye edilmiş hücreleri in vivo olarak yerel ve hassas bir şekilde enjekte edebilmemizdir. Bu durum, söz konusu hücrelerin uygun ortamda incelenmesine olanak tanır. Bu prosedürü ben ve laboratuvardan bir doktora öğrencisi olan Emily aar uygulamalı olarak göst

cell-labeling-and-injection-in-developing-embryonic-mouse-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, embriyonik deri ve timüs kan damarlarının etiketlenmesine yönelik bir yöntem açıklanmaktadır.

Embriyonik Farelerde damarları Etiketleme Bir Yöntem

Fare gelişim çalışmaları gebelik sırasında embriyonun erişilememesi tarafından engellenmektedir. Gebeliğin son aşamalarında embriyonik kalbin uzun vadeli bir kültür teşvik etmek için, eksize kalp, yarı-katı, seyreltik Matrigel kültüre edildiği bir protokolü geliştirilmiştir.

Yeni Bir<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Fare Kalp için&gt; Kültür Yöntemi

Bu el yazması, gelişmekte olan damar sisteminin görselleştirilmesi için bir tekniği açıklamaktadır. Burada fare embriyoları üzerinde in utero intrakardiyak FITC işaretli domates lektin mikroenjeksiyonları kullanıldı. Bu tekniği kullanarak, embriyonik böbrek boyunca perfüze olmuş ve edilmemiş damarları betimliyoruz.

Fare Embryolarının üzerinde Utero içi kardiyak Domates-lektin Enjeksiyonlar Renal Kan Akışı Ölçer için

Konjenital kalp kusurlarına yol açan mutasyonlar, gelişim sırasında kardiyak yapının in vivo araştırılmasından yararlanır, ancak fare embriyonik kalbindeki yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar teknik olarak zordur. Burada, gelişmekte olan fare kalbindeki kardiyomiyosite özgü yapıları değerlendirmek için sağlam bir immünofloresan ve görüntü analizi yöntemi sunuyoruz.

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

Bozulmamış embriyonik ve doğum sonrası kalplerin derinliklerindeki floresan protein etiketli hücreleri hacimsel olarak görüntülemek için bir protokol tanımlıyoruz. Tüm montaj boyama ile birlikte doku temizleme yöntemlerini kullanarak, embriyonik veya doğum sonrası bir kalbin içindeki tek floresan protein etiketli hücreler net ve doğru bir şekilde görüntülenebilir.

Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi

Burada, Bütün Dağı ayirt ve nicel hacimsel analizi erken sahne fare embriyo yansıma tabanlı bir protokol açıklayın. Bu teknik nitelik ve nicelik geliştirme sırasında kalp yapıları değerlendirmek ve diğer organ sistemleri yaygın olarak adapte olması teklif için güçlü bir yaklaşım olarak mevcut.

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

Bu yöntemde, embriyonik kalp dokuları cerrahi olarak microdissected, ayrışmış, fluorescently etiketli ve ana bilgisayar embriyonik dokuların implante vardır. Bu kişi veya doku düzeyinde gelişimsel organizasyon ektopik hemodinamik koşullar ve/veya değiştirilmiş parakrin/juxtacrine ortamlar altında eğitimi için bir platform sağlar.

Embriyonik Cardiomyocytes kuş embriyo implantasyonu Vivo için Mikroenjeksiyon tabanlı sistem

Biz bütün Dağı epifluorescent mikroskobu ventrikül belirli MLC-2v-tdTomato muhabir çakma fareler disseke fare embriyosu üzerinde kullanarak fare kalp geliştirme incelemek için protokolleri mevcut. Bu yöntem her aşamasında emek yoğun histochemical yöntemleri olmadan fare kalp geliştirme sırasında ventrikül oluşumu doğrudan görselleştirmek için bize izin verir.

Bütün Mount Epifluorescence kullanarak fare embriyogenez sırasında kalp odası gelişimin analizi

Farelerde miyokard enfarktüsü bölgesi etrafında ultrason rehberliğinde hücre dağıtımı, hücre nakli için güvenli, etkili ve uygun bir yoldur.

Miyokard Enfarktüslü Farelerde Ultrason Rehberliğinde İndüklenen Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyosit İmplantasyonu

Kardiyak progenitör hücrelerin 3D + zaman görüntülemesini sağlayan fare embriyo kültürü ve görüntülemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu video araç seti, başarılı canlı görüntüleme için gereken temel becerileri ele alır, aksi takdirde yalnızca metin yayınlarından elde edilmesi zordur.

Fare Embriyosundaki Erken Kardiyak Progenitörlerin Canlı Görüntülenmesi

Bu protokol, gelişmekte olan fare kalplerinde kalp hücrelerinin elektroporasyona dayalı transgenezi için ayrıntılı bir metodolojik çerçeve sunar. Burada sağlanan video varlıkları, bu çok yönlü tekniğin öğrenilmesini kolaylaştıracaktır.

Fare Embriyonik Kalbinde Gen İletimi için Etkili Bir Transgenez Yaklaşımı

Öğrenin, fare embriyo kalplerine hücre ve DNA enjeksiyonu yaparak hücre kaderini izleme ve gen ifadesini yerel olarak manipüle etme yöntemlerini. Bu teknikler, kalp gelişimi ve gen fonksiyonlarını in vivo ortamda araştırmak için kullanılır.

Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon

Daha fazla video keşfet