Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik fare kalplerinde hücre kalıbı veya DNA enjeksiyonu yapmaktır. Hücre yağını araştırmak veya gen ekspresyonunu lokal olarak manipüle etmek için, bu, önce hamile bir fareden embriyoların çıkarılması ve embriyonik kalbin açığa çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra DNA boyası veya hücreleri, kalpte hedeflenen ilgilenilen bölgeye enjekte edilir.

Daha sonra embriyo inkübe edildikten sonra kalp çıkarılır ve kültüre yerleştirilir. Son olarak, enjekte edilen veya etiketlenen hücrelerin kaderi mikroskopi ile belirlenir. Sonuç olarak, enjekte edilen, etiketlenen veya genetiği değiştirilmiş hücrelerin kaderi, konfokal mikroskopi veya ışık ve epi floresan mikroskobu ile izlenir ve kardiyak gelişim sırasında belirli genlerin ve hücrelerin fonksiyonel önemini ortaya çıkarır.

Farede transgenez gibi mevcut yöntemlerin bu tekniğinin ana avantajı, hücreleri in vivo olarak lokal ve doğru bir şekilde laboratuvarda enjekte edebilmemiz veya genetik olarak değiştirebilmemizdir. Bu, bu hücrelerin uygun ortamda araştırılmasına izin verir. Bu prosedürü gösteren ben ve bir laboratuvardan doktora öğrencisi olan Emily aar olacak.

Ekipman, reaktifler ve çözeltiler hazırlandıktan sonra, metin protokolüne göre, göğsü sterilize etmek için önce% 70 etanol kullanarak ötenazi yapılmış bir hamile fareden E 9.5 ve E 10.5 embriyolarını toplayın, karnı açmak için ventral orta hat insizyonu yapın ve rahim boynuzunu oda sıcaklığında PBS'ye aktarmadan önce. PBS'de iki ek yıkamadan sonra, silikon dolgulu bir Petri kabına aktarın. M 16 besiyeri ile, uterusun vaskülarize tarafı altında olacak şekilde uterus boynuzunu silikon tabakaya sabitlemek için böcek pimleri kullanın.

Daha sonra uterusun yüzeyini kesmek için ince forseps kullanın ve yaprak döken yüzeyi yüzeyin bir milimetre altında kapatın. Desidua'nın duvarlarını açın ve yumurta sarısı torbasındaki embriyoyu nazikçe alın. Enjeksiyonları gerçekleştirmek için hücre enjeksiyonundan önce 37 santigrat derecede M 16, orta derecede saklayın.

İlk olarak, arkadan bir cam pipeti DNA veya hücrelerle doldurmak için bir Hamilton şırıngası kullanın ve kabarcıkları çıkarmak için pipeti sallayın. Uçta, pipeti mikroenjeksiyon tutucusuna yerleştirin ve enjektörü aşağıdaki ayarlara göre ayarlayın. Daha sonra, embriyoya uygun şekilde dokunmadan embriyoyu yumurta sarısı torbasından silikon tabana sabitleyin.

Daha sonra kalbin bulunduğu bölgeyi belirleyin ve bu bölgenin hemen üzerindeki çuvalı açın. Hücre enjeksiyonu sırasında herhangi bir hareketi önlemek için embriyonun etrafına dört pim ekleyin. Manuel olarak ayarlanmış mikro manipülatörü kullanarak, pipet ucunu perikardın üzerinde 45 derecelik bir açıyla, enjekte edilecek kalp bölgesinin hemen üzerine yavaşça yerleştirin.

Pipeti ilgili bölgeye taşıyın, enjeksiyonu tetikleyin ve pipeti mümkün olan en kısa sürede çıkarın. DNA veya hücre enjeksiyonundan sonra kalbin düzgün bir şekilde attığından emin olun Epitelden mezenşime geçişi incelemek için bu videoda açıklanan enjeksiyon protokolünü kullanın ve E 9.5 Endokardiyal hücrelerin endotelyal mezenkimal geçişi için gerekli bir proteini aşağı regüle eden bir S-H-R-N-A ile bir VC explan enjekte edildi. Kontrol embriyosuna boş bir omurga vektörü enjekte edildi, benzer şekilde, SOX dokuz promotörün kontrolü altında GFP'yi eksprese eden HUES hücresinden türetilmiş endotelyal ön kapak hücreleri, E 10.5'te A VC'ye enjekte edildi ve ardından 48 saatlik eksplante kalp kültürü izledi.

Bu hücreler, endojen endokardiyal hücrelere benzer şekilde periostin gibi EMT belirteçleri alır. Burada gösterilen ex vivo yaklaşımlar nispeten kolaydır, ancak maksimum 48 ila 72 saatlik kısa süreli takip ile sınırlıdır. Bununla birlikte, metin protokolünde açıklanan ultrason kılavuzluğunda enjeksiyon prosedürü, teknik olarak daha zorlu bir yaklaşım sağlar, ancak doğum sonrası utero takip seçeneği de uzundur.

Belirli kardiyak bölgelerdeki hücreleri etiketlemek için boya veya viral vektörlerin utero enjeksiyonu burada gösterilmiştir. Bu yöntemle, epikardiyal hücrelerin spesifik olarak etiketlenmesi floresan boyalar veya virüs ile sağlanabilir ve yöntem, hücreler veya alternatif enjektabllar ile genişletilebilir. Bu prosedürü takiben, bir genin, bir molekülün uzun vadeli etkisi veya gelişiminden sonra doku morfogenezi gibi uzun liste okuması gibi ek soruları yanıtlamak için bryo kültürü gibi bir yöntem gerçekleştirilebilir.

Bu teknik, kardiyak gelişim biyolojisi ve genetiği alanındaki araştırmacıların önünü açmıştır. Yeni genlerin dünyasını keşfetmemizi ve insan hücresinin kaderini uygun embriyonik bağlamda araştırmamızı sağlar. Bu, transgenik bir fare çizgisi mevcut olmadığında çok kullanışlıdır.