İYİ: tetradların Barkod Etkin Sıralama

Bu prosedürün genel amacı, bir maya çaprazlamasından, hangi progenylerin aynı orijinal tetraddan türetildiği bilgisini koruyacak şekilde çok sayıda rekombinant progeny oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle çaprazlamada kullanılacak heterozigot diploid suşun, tetrad spesifik bir barkod ve sporülasyon spesifik bir floresan raporlayıcı içeren bir plazmid kütüphanesi ile transforme edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise barkodlanmış hücrelerin sporülasyon besiyerine aktarılmasıdır.

Bu işlem tetraların oluşmasını sağlar ve sporülasyon gerçekleştiremeyen hücrelerde değil, Tetralarda GFP floresan raporerinin ekspresyonunu indükler. Ardından, bir FACS ayıklayıcı floresan işaretli tetraları diğer hücrelerden ayırır ve tetraların dış kaplamasının enzimatik olarak sindirildiği bir agar plakasına doğrudan aktarır. Son adım, sindirilmiş tetraların sporlarını ayırmak ve agar plakası yüzeyine yaymak için cam boncuklar kullanmaktır; böylece her sporun tek bir koloni oluşturması sağlanır.

Nihayetinde, bu yöntemle elde edilen suşlar, her suşun tetra spesifik barkodunu okuyacak yüksek kapasiteli bir multipleks DNA sekanslama protokolü kullanılarak genotiplenecektir. Barkodlar daha sonra, tek bir miyotik olaydan kaynaklanan dört suşun her birini tanımlamak için kullanılır. Bu tekniğin, mikromanipülatör kullanılarak yapılan manuel tetrad diseksiyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tek bir araştırmacının sadece birkaç saat içinde birkaç bin rekombinant dölü izole edebilmesidir.

Bu çalışmada kullanılan diploid maya hücreleri, beraberindeki makalede açıklandığı üzere daha önce barkodlanmış plazmit kütüphanesi ile transforme edilmiş ve dondurulmuş stoklardan hücreleri canlandırmak için -80 °C'de saklanmıştır. Hücreleri, ertesi gün 30 °C'de ajitasyonla, 5 mL YPD artı 200 µg/mL G 418 içerisinde gece boyunca büyütün. Gece boyunca büyütülen kültürlerdeki hücreleri üç kez PBS ile yıkayın ve ardından hücreleri, sporülasyon ortamı artı 200 µg/mL içerisinde 2 mL nihai hacme yeniden süspanse edin.

Sporülasyon kültürlerini oda sıcaklığında çalkalayın. Yeni tetratların oluşumu durana kadar sporülasyon ilerlemesini günlük olarak izleyin. Genellikle, kültürler iyi oluşmuş tetratlar ve nispeten az sayıda dyat içerdiğinde bu süreç iki ila dört gün sürer.

Kültürleri ajitasyondan çıkarın ve tetrad ayıklama işleminden önce en az yedi gün boyunca oda sıcaklığında bekletin. Bu prosedürün en zor kısmı, sporların iyi bir şekilde ayrılmasını sağlamaktır. Sporülasyon geçiren kültürlerin tetrad ayıklamadan önce en az bir hafta boyunca ajitasyon olmadan oda sıcaklığında bekletilmesinin, spor ayrılmasını önemli ölçüde iyileştirdiğini ampirik olarak saptadık.

Sporülasyon kültüründeki tetratlar, diploid hücrelerdeki barkodlu plazmidler aynı zamanda sporülasyona özgü bir GFP füzyon proteini taşıdığı için floresanla aktive edilen hücre ayıklama (FACS) yöntemiyle tespit edilebilir ve izole edilebilir. Burada açıklanan protokol, bir FACS Aria II için geliştirilmiştir. Bu prosedüre başlamak için sporüle olmuş kültürü FACS ayıklayıcıya yükleyin ve döküntüleri, kümelenmiş hücreleri ve damla başına düşen çoklu hücreleri dışlamak için iki ileri saçılım (forward scatter) ve yan saçılım (side scatter) geçidi ayarlayın.

PS iki GFP reporter konstrüktü kullanıldığında diyadları ve tetradları içeren floresan hücre popülasyonu bulunmalıdır; bu floresan olayları dahil etmek için GFP'ye karşı FSC kapısı (gate) kullanın. Suş arka planına bağlı olarak, tetradları ve diğer hücreleri içeren kümeleri temizlemek için ek bir kapı eklemek gerekebilir. Floresan olayların FSC histogramını inceleyin.

Bu örnekte, soldaki piktekiler öncelikle tetradlar ve sağdaki piktekiler genellikle ekli bir tomurcuğa sahip tetradlardır; kırmızı çubuklarla belirtilen ve çoğunlukla tetradlardan oluşan, daha düşük FSC değerine sahip olayları içeren nihai bir kapı (gate) uygulayın. Yaklaşık 1.500 tetradı bir mikroskop lamına sıralayarak ve tetradların tetrad olmayanlara oranını sayarak kapılama rejiminin verimliliğini kontrol edin. 400 kat büyütmeli bir faz kontrast mikroskobu kullanarak, tetrad yüzdesi sadece yaklaşık 200 sıralanmış olayın sayılmasıyla doğru bir şekilde tahmin edilebilir, ancak yaklaşık 1.500 adet sıralama yapmak, mikroskop lamında hücre aramak için harcanan süreyi azaltır.

Bu aydınlık alan görüntüleri 600 kat büyütme ekler. Faktör sıralaması sonrası solda tetratların, sağda ise tetrat olmayanların örneklerini gösterir. Sıralayıcının olay sayısını doğru raporladığını periyodik olarak kontrol etmek için bir mikroskop lamına 25 tetrat sıralayın ve damlacık içindeki hücreleri 400 kat büyütmede faz kontrast mikroskobu kullanarak inceleyin.

Damlacıkta 25 tetrat bulunmalıdır. Söz konusu çalıştırmadaki fax cihazının varyansını değerlendirmek için işlemi üç veya dört kez tekrarlayın. Bu prosedür için gereken sayıda YPD artı G four 18 agar plakalarını, fax ayıklayıcının yanına yerleştirilmiş 37 °C'lik bir inkübatörde en az 1,5 saat boyunca ısıtarak hazırlayın.

Sıralama protokolünün temel bir özelliği, faks ile sıralanan tetratları, X çözeltisi havuzu içeren bir agar plakasındaki belirli bir konuma doğru bir şekilde yönlendirebilme yeteneğidir. Bunun için öncelikle, sıralayıcının otomatik hücre biriktirme ünitesine bir işaretçi 96 kuyucuklu plaka yerleştirin. Ardından, 96'lık plakanın tek bir kuyucuğuna 25 tetrat sıralayacak bir sıralama düzeni hazırlayın.

Plaka başına 25 tetra'nın kuyucuk formatında ayrıştırılması, iyi ayrılmış koloniler sağlar. Plakanın ortasına yakın bir kuyucuk seçin. Örneğin, D5 kuyucuğu.

37 derece Celsius'lik inkübatörden 10'lu agar plaka setini ayıklayıcıya getirin. Bir agar plaka alın ve plakanın merkezine yakın bir noktadaki agara 25 mikrolitre zy çözeltisi pipetleyin. Ardından plakayı, X damlacığını hedefin üzerine hizalayarak referans 96 kuyucuklu plakanın üzerine yerleştirin.

Bu daha önce seçilmişti. Şöyle ki D beş. Ayıklamaya başlayın ve agar plakası üzerindeki zy damlacığının ortasına 25 tetra bırakın.

Plakayı çıkarın ve üzerini kapatın. Yığındaki her plakada 25 tetrat zamo damlacıklarına ayrılana kadar ayıklama işlemini her plaka için tekrarlayın. Tetrat içeren plakaların bulunduğu yığını 37 derece Celsius inkübatöre geri yerleştirin.

Sıradaki 10 plaklık yığını ayıklayıcıya getirin ve ayıklama prosedürünü tekrarlayın. Tetrat içeren agar plakaları 37 °C'de 1,5 saat inkübe edildikten sonra sporlar ayrılabilir. Bu işleme başlamak için her plakaya 15 ila 25 adet steril üç milimetrelik cam boncuk ekleyin ve plakaları beşerli iki yığın halinde üç ila beş dakika boyunca çalkalayın.

En iyi spor ayrımı, plakaların sert bir şekilde yanlara veya öne arkaya hareket ettirilmesiyle sağlanır. Plakaları, boncukların plakanın dış kenarı boyunca dönerek hareket edeceği şekilde hareket ettirmeyin. İşlem bittiğinde boncukları plakaların üzerinde bırakın.

Boncukların yukarı baktığı plak yığınını 30 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Bir sonraki plak yığınını 37 °C'lik inkübatörden çıkarın ve boncukları kullanarak spor ayırma prosedürünü tekrarlayın. Sporların ayrılmasından bir gün sonra tüm plakları 30 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Cam boncukları yerinden oynatmadan plakaları 30 degrees Celsius inkübatörden dikkatlice çıkarın. Plakalar üzerinde küçük koloniler oluşmuş olmalıdır. Plakaları derin bir kabın üzerine dikkatlice ve hızlıca ters çevirerek cam boncukları uzaklaştırın.

Plaka ters çevrilmiş haldeyken altına vurmak, plakaya yapışmış boncukların yerinden çıkmasına yardımcı olabilir. Kaplar, boncukların geri sıçrayıp agar plakasına çarpmasını önleyecek kadar derin olmalıdır. Her plaka üzerindeki koloni sayısını sayın ve spor ayırma ile geri kazanım verimliliğini tahmin etmek için koloni sayısını kullanın.

Örneğin, yaklaşık %100 canlılığa sahip bir çaprazlama için plaka başına 25 tetrat, yüksek canlılık için 65'ten fazla koloni içeren yeterli sayıda koloniye sahip plakalardan plaka başına toplam 100 koloni sağlayabilir. Her koloniden alınan hücreleri, YPD sıvısı artı G four 18 içeren 96 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. Ayrıca, hangi kuyucukların aynı agar plakasından gelen kolonileri içerdiğini not edin.

Bu bilgiler, daha sonra tetra atamasını kolaylaştırmak için kullanılacaktır. Yazılım kullanımı, tetradlardan sporların izole edilme hızını önemli ölçüde artırabilir. Yöntemin mevcut iterasyonu manuel diseksiyona kıyasla bir miktar verimlilik kaybına sahip olsa da, başarıyla geri kazanılan tüm sporların oranına dayanarak; 1, 2, 3 veya dört koloni üreten en az bir başarılı geri kazanılmış spora sahip tetradların beklenen fraksiyonunu hesaplamak için binomial dağılım kullanılmıştır.

Bu grafik, burada gözlemlendiği üzere nihayetinde üç veya dört spor tetradı şeklinde birleştirilecek suş sayısı için kaba bir kılavuz görevi görebilir. Bu çalışmada, plaka başına düşen koloni sayısı arttıkça geri kazanılan tam tetrad sayısı da artmaktadır. Manuel diseksiyonla belirlendiği üzere spor canlılığı %100'e yakın olan 25 radlık örnekler 149 agar plakasına ekilmiştir.

Plaka başına gözlemlenen maksimum koloni sayısı 80 idi; bu durum, 20 sporun ayrık koloniler oluşturamadığını göstermektedir. Plaka başına ortalama koloni sayısı 62 idi; 65 veya daha fazla koloni içeren 61 plakadan toplam 4.354 koloni toplanmış ve dizilenmiştir. Dizileme kalite kontrolünden geçen 3.700 suşun 2.665'i veya %72'si, işlem tamamlandığında bilgisayarlı analizle üç veya dört sporlu tetratlara atanabilmiştir.

Bu teknik, saatte binin üzerinde tetrad işlemek için kullanılabilir. Ancak üç saatten daha uzun süren işlemler için yardıma ihtiyaç duyacaksınız.