Name: Yakalama Bileşik Kütle Spektrometre - Roman c-di-GMP Efektör Proteinler tanımlamak için güçlü bir araç (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Keşfedin, bakteriyel siklik di-GMP bağlayıcı proteinleri tanımlamak için yakalama bileşik kütle spektrometrisi (CCMS) yöntemini. UV ışığı ile kovalent çapraz bağlama ve streptavidin manyetik boncuklarla yıkama sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alberto Reinders'a P. aeruginosa için CCMS koşullarını optimize etme konusundaki çalışmaları için teşekkür ederiz. Ayrıca Pablo Manfredi'ye P. aeruginosa proteinlerinin açıklaması için teşekkür ederiz. Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNF) Sinergia hibe CRSII3_127433 tarafından desteklenmiştir.

1. Lizat Hazırlık <ol><li> P büyütün İstenen OD LB aeruginosa hücreleri. NOT: rehberlik için: log fazı kültürleri için sabit faz kültürler için ≈ 100 ml kültür / örnek ve ≈ 500 ml cultur / örnek (OD 600Nm = 0.5) kullanın. </li><li> 5.000 x g&#39;de 20 dakika boyunca santrifüj ile pelet. </li><li> Süspanse 0.5-1 1 mi liziz tamponunda pellet g (6.7 mM MES, 6.7 mM HEPES, 200 mM NaCI, 6.7 mM kaç, DDT, 1 mM, pH 7.5) ve proteaz inhibitörü (tam mini, EDTA-içermeyen) ekleyin de DNasel olarak. </li><li> Lyse 20.000 psi bir Fransız basınç hücresi ile 3 pasajlar ile hücre, (Malzeme listesi bakınız). </li><li> Ultra santrifüj 4 ° C &#39;de, 1 saat boyunca 100,000 x g&#39;de hücre lizatı. </li><li> Süpernatant kaydedin (2. adıma gidin). </li><li> Yukarı ve aşağı pipetleme lizis tamponu 1x 1 ml pelet yıkayın. </li><li> Ultrasantrifüj işlemi, 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca 100,000 x g&#39;de. </li><li> Pelet flaş dondurmaMembran proteinlerinin (adım 3) yakalanması için kullanılana kadar -20 ° C&#39;de, sıvı azot ve saklayın. </li></ol> C-di-GMP Ücretsiz ve Diğer Nükleotidlerinin 2. Temizleme (Çözünür Kesir Sadece) <ol><li> Soğuk lisiz tampon maddesi içinde 10 ml bir PD10 tuz giderme kolonu (bakınız Materyaller listesi) yıkayın. </li><li> Nükleotidleri gidermek amacıyla PD10 süpernatanların (≈ 1 mi) dökün. </li><li> 4 ml soğuk lisiz tamponu (500 ul aşama) ile yıkayın. </li><li> Bradford tahlili ile saptandığı haliyle en yoğun fraksiyonlar seçin ve bunları bir araya getirirler. </li></ol> 3. Pelet Tekrar Süspansiyonu ve Çözme (Membran Kesir Sadece) <ol><li> (Deterjan olmadan) 1x yakalama tamponu 500 ila 1000 ul pelletini tekrar (Tablo 1). NOT: pelet tekrar süspansiyon zordur. Kabaca iyi çözüm homojenize bir şırınga 27 G kullanmak için, sonra pelet tekrar süspansiyon bir pipet ile ilk pipet yukarı ve aşağı tavsiye edilir. </li><li> % 1 ekleyin (a / h) n-dodesil-β-D-maltopiranozit (DDİ). </li><li> Dönen bir tekerlek üzerinde, en azından 2 saat (ya da O / N), 4 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Ultrasantrifüj işlemi, 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca 100,000 x g&#39;de. </li><li> Süpernatant Hasat. </li></ol> 4. Protein Konsantrasyon Ölçümü <ol><li> (Membran fraksiyonunun BCA deneyi ile) Bradford tahlili ile protein konsantrasyonu ölçülür. </li><li> 10 mg / ml toplam protein konsantrasyonunu belirleyin. </li></ol> 5. Yakalama <ol><li> GSYİH GTP, ATP, CTP 1 mM ve 5x yakalama tamponu (100 mM HEPES, 250 mM Kac, 50 mM MgAc,% 5 gliserol, pH 7.5) (Tablo 1) 20 ul protein 300 ug karıştırın. H 2 O ile 100 ul reaksiyon ses seviyesini ayarlama NOT: Toplam hacmi rekabet kontrol durumunda CdG-CC ve c-di-GMP seviyesini içerir (adım 5.3 ve Tablo 2). Not: tüm deneyler 200 ve gerçekleştirildi# 181; l 12-tüp PCR şeritler (Thermo Scientific). NOT: zar kısmı için, her zaman kritik misel konsantrasyonu 8 M Üre protein çözündürme aşamasına kadar (7.1 Adım) (w / v% 0.01) Yukarıdaki DDM konsantrasyonunu tutmak için emin olun. </li><li> Dönen bir tekerlek üzerinde, 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 10 uM CdG-CC (nihai konsantrasyon) eklenir. NOT: (&quot;boncuk kontrolü&quot; olarak anılacaktır) CDG-CC olmayan bir denetim ve 1 mM c-di-GMP (&quot;yarışma kontrolü&quot;) ile desteklenmiş bir denetim vardır (Tablo 2). NOT: CdG-CC konsantrasyonu 1 ile 10 uM kadar ayarlanabilir. </li><li> Karanlıkta, dönen bir tekerlek üzerinde, en az 2 saat (O / N membran fraksiyonu), 4 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Bir CaproBox kullanarak 4 dakika UV ışığı ile CDG-CC reaktif parçasının aktivasyonu ile kısa bir sıkma, çapraz bağ, sonra (kaynak = 310 nm, Işınım ≥10 mW / cm², mesafe Malzemeleri Listesi görmek λ = 2 cm). NOT: şeritleri önce çapraz bağlama kapağını kaldırın. </li><li> Hafifçe homojenize, 25 ul 5x yıkama tamponu (5 M NaCl, 250 mM Tris, pH 7.5) yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve de streptavidin manyetik taneleri 50 ul ekle. </li><li> Dönen bir tekerlek üzerinde 1 saat süre ile 4 ° C&#39;de inkübe edilir. </li></ol> 6. Yıkama adımları NOT: (Mıknatıs: Malzeme Listesi&#39;ne bakın). Mıknatıs ile PCR şerit kapağı manyetik boncuk yakalama, ile başlayın. Ardından bir sonraki yıkama çözeltisi içeren yeni bir PCR şerit değiştirin. Mıknatısı çıkarın ve boncuklar tekrar süspansiyon ve 2 dakika inkübe. Spin ve taze kapakla kapağı değiştirin. <ol><li> Yıkama adımları (çözünebilir fraksiyon için) <ol><li> 200 ul 1x yıkama tamponu 6 kez yıkayın. </li><li> 200 ul HPLC dereceli H 2 O bir kez yıkayın </li><li> 200 ul% 80 asetonitril içinde 6 kez yıkayın. </li><li> 200 ul HPLC dereceli H 2 O 2 kez yıkayın </li></ol></li><li> Yıkama adımları (membrane fraksiyonu sadece) <ol><li> +% 0.1 DDM 200 ul 1x yıkama tamponu içinde 5 kez yıkayın. </li><li> + 0.05% DDM 200 ul 1x yıkama tamponu 2 kez yıkayın. </li><li> +% 0.025 DDM 200 ul 1x yıkama tamponu kez yıkayın. </li><li> + 0.0125% DDM 200 ul 1x yıkama tamponu kez yıkayın. </li><li> 200 ul 100 mM ABC 3 kez yıkayın (amonyum bikarbonat, NH 4 CO 3) + 2 M Üre. </li></ol></li></ol> 7. MS Numune Hazırlama <ol><li> 20 ul 100 mM ABC (membran fraksiyonu için + 8 M Üre 100 mM ABC) &#39;de (doğrudan kapakta) boncuk süspanse ve 1.5 ml tüpler içine aktarın. </li><li> Membran fraksiyonu, sadece 500 rpm&#39;de çalkalanarak, 5 dakika boyunca 60 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 200 mM TCEP (tris (2-karboksietil) fosfin) ul 0.5 ekleyin ve 500 rpm &#39;de çalkalanarak 1 saat boyunca 60 ° C&#39;de inkübe edin. 25 ° C&#39;ye kadar soğutun. </li><li> Bir çalkalama, iyodoasetamid, taze hazırlanmış 400 mM, 0.5 ul ilave edilir ve 30 dakika boyunca 25 ° C&#39;de inkübe500 rpm ve karanlıkta t. </li><li> 0.5 ul 0.5 M N-asetil-sistein ilave edin ve 500 rpm&#39;de çalkalanarak, 10 dakika boyunca 25 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Membran fraksiyonu, sadece: 1 ul Lys-C ekleyin ve 37 ° C, O / N inkübe edin. </li><li> 2 ug tripsin ekleyin ve 500 rpm (kurumasını önlemek için Parafilm olarak şal) sallayarak, 37 ° C&#39;de O / N kuluçkaya yatmaktadır. Not: örnekler, bu aşamada -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. NOT: Membran fraksiyon sadece: tripsin eklenmesinden önce &lt;2 M&#39;ye üre konsantrasyonunu ayarlamak için 100 mM ABC ekleyin. </li><li> Kısaca tüpler aşağı spin ve mıknatıs ile boncuk toplamak. </li><li> Yeni 1.5 ml tüp içine süpernatant aktarın (boncuk bırakılırsa bu adımı tekrarlayın). </li><li> 5 ul% 5 TFA (trifloroasetik asit) + 1 ul 2 M HCI (membran fraksiyonunun 15 ul% 5 TFA + 5 ul 2 M HCI) ekleyin. </li><li> Durum C18 MicroSpin sütunları ul asetonitril 150 ile (Nest Grubu, MA, ABD) (spin 2,400 rpm&#39;de 20 sn). </li><li> Equi% 0.1 TFA (spin 20 sn, 2.400 rpm) ul C18 sütunlar, 150 ile 2 kez librate. </li><li> Örnek yükleyin ve 2 dakika, 2.000 rpm döndürün. </li><li> Akış yoluyla kolonuna yükleyin ve sıkma aşamasına (2 dakika, 2000 rpm), tekrarlayın. </li><li> % 0.1 TFA ul 150 ile 3 kez yıkanır,% 5 asetonitril (20 sn, 2400 rpm). </li><li> Yeni bir tüp ve 150 ul% 0.1 TFA ile iki kez elüte,% 50 asetonitril (2 dakika, 2000 rpm). </li><li> Hızlı Vac peptidler kurulayın. </li><li> 40 ul% 98 H2O,% 2 asetonitril,% 0.15 formik asit içinde süspanse. </li><li> Sonikasyon 20 sn (darbe döngüsü 0.5, genlik 100%; Malzeme Listesi) ve 5 sn, 12.000 rpm (tezgah üstü santrifüj) aşağı doğru döndürün. Vortex 10 sn ve 5 sn, 12.000 rpm aşağı doğru döndürün. LC-MS / MS analizi için bir HPLC vialinde aktarın. </li><li> -20 ° C&#39;de dondurun. Not: örnekler, bu aşamada -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 8. LC-MS / MS Analizi <ol><li> Nano-LC çalıştırın (nano-LC sistemleri) equippBir RP-HPLC kolonuna (75 mm x 37 cm) C18 reçine ile dolu olan baskı (sihirli C18 AQ 3 um),% 95 çözücü A&#39;dan (% 0.15 formik asit,% 2 asetonitril) ile% 5 solvent B bir doğrusal eğimi kullanılarak ( 0.2 ul / dk&#39;lık bir akış oranında 60 dakika boyunca% 35 çözücü B için% 98 asetonitril,% 0.15 formik asit). </li><li> (Elektropüskürtmeli bir iyon kaynağı ile bağlanmış bir çift basınç LTQ-Orbitrap Velos kütle spektrometresi), LC-MS / MS kullanılarak peptidleri analiz edin. NOT: veri toplama modu MS 20 en yoğun iyonların doğrusal iyon tuzağı MS / MS taramaları ardından 60.000 FWHM çözünürlükte kütle spektrometresi FT bölümünde tarama bir yüksek çözünürlük elde etmek için kurulmuştur. MS / MS girişimleri verimliliğini artırmak için, ücret devlet tarama modus atanmamış dışlamak için etkin ve tek iyonları şarj edildi. Haberci 100 iyon sayıları aşıldığında Hile bağlı ayrışma tetikledi. Dinamik dışlama süresi 30 saniye olarak ayarlandı. iyon birikimi süresi 300 ms (MS) ve 50 olarak ayarlandımilisaniye (MS / MS). </li></ol> 9. Veritabanı Arama <ol><li> P İndir aeruginosa NCBI-veritabanı NCBI ana aracılığı ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/</a> ). </li><li> MassMatrix dönüştürme aracı (kullanarak maskotu jenerik dosyalarının içine MS ham spektrumları (mgf) dönüştürün <a href="http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py">http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py</a> ). </li><li> P. karşı MASCOT sürüm 2.3 kullanarak bu mgf dosyasını ara İleri içeren ve ters-tuzak protein girişleri aeruginosa NCBI-veritabanı. </li><li> İki tam Triptik peptitler de bölünmelere cevapsız tolere (prolin ardından sürece) lisin ve arginin sonra siliko tripsin sindirim bir gerçekleştirin. </li><li> Değişken değişiklikler ve sabit modifikasyon gibi sistein kalıntısı carboxyamidomethylation (+57.021464 Da) olarak oksitlenmiş metioninler (15,99491 Da) izin veritabanı arama parametrelerini ayarlayın. MASCOT bizi arar İçinyüksek çözünürlüklü taramalar ing, 15 ppm habercisi kitle toleransını ayarlamak ve Da 0.6 fragmanı kitle toleransını ayarlayın. Son olarak,% 1 protein FDR ayarlayın. </li><li> P. Maskot aramalar İthalat İskele (Proteomesoftware, Versiyon 3) içine aeruginosa MTSK deneyleri,% 1 protein FDR yakın edinmek ve toplam spektral sayıları ayıklamak için parametrelerini ayarlamak. </li><li> Temsilcisi sonuçları bu çalışmada sunulan için, rekabet kontrolü ile deney karşılaştırmak için eşleştirilmiş t testi kullanıldı ve sadece 0.1 altında bir p değeri ve 2 (spektral sayıları deneme / yarışma kontrol spektral üzerinde spektral sayım oranı ile hit kabul sayımları). </li><li> Veriler daha fazla analiz için herhangi bir elektronik tablo yazılımı ihraç edilebilir. </li></ol> 10. Etiket serbest Niceleme <ol><li> Progenesis LC-MS yazılımı (Doğrusal Olmayan Dinamikleri, Sürüm 4.0) içine çiğ dosyalarını içe aktarın. </li><li> Varsayılan Setti LC-MS hizalama ve özellik algılama gerçekleştirinNGS. </li><li> Progenesis LC-MS mgf formatında veri ihracat. </li><li> NCBI P. karşı maskotu kullanan MS / MS spektrumları ara İleri içeren ve ters-tuzak protein girişleri aeruginosa veritabanı. </li><li> Progenesis LC-MS içine veritabanı arama sonuçlarını İthalat ve MS1 özellikleri peptidler kimlik haritası. </li><li> (: 0.1 altında q değeri, 2 üzeri spektral sayım oranı eşiği) veri değerlendirme (anlamlılık düzeylerinin hesaplanmasında, kat-değişim oranları) için SafeQuant ve ProteinSQAnalysis komut kullanılmıştır. </li></ol>

<ol><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).</li>
<li>Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+c-di-GMP+signalling+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Principles of c-di-GMP signalling in bacteria.</a> Nature reviews. Microbiology. 7, 263-273 (2009).</li>
<li>Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((You%27ve+come+a+long+way%3A+c-di-GMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">You've come a long way: c-di-GMP signaling.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).</li>
<li>Schirmer, T., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+mechanistic+determinants+of+c-di-GMP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling.</a> Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).</li>
<li>Furukawa, S., Kuchma, S., O'Toole, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+their+options+open%3A+acute+versus+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Keeping their options open: acute versus persistent infections.</a> J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).</li>
<li>Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+cyclic+di-GMP-specific+phosphodiesterase+and+its+allosteric+control+by+GTP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP.</a> J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).</li>
<li>Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+di-GMP+signaling+in+bacteria%3A+recent+advances+and+new+puzzles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles.</a> J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).</li>
<li>Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+the+PilZ+domain+protein+PA4608+complex+with+cyclic+di-GMP+identifies+charge+clustering+as+molecular+readout%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout.</a> J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).</li>
<li>Fazli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRP%2FFNR+family+protein+Bcam1349+is+a+c-di-GMP+effector+that+regulates+biofilm+formation+in+the+respiratory+pathogen+Burkholderia+cenocepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia.</a> Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).</li>
<li>Hickman, J. W., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FleQ+from+Pseudomonas+aeruginosa+as+a+c-di-GMP-responsive+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor.</a> Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).</li>
<li>Sudarsan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboswitches+in+eubacteria+sense+the+second+messenger+cyclic+di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP.</a> Science. 321, 411-413 (2008).</li>
<li>Lenz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+methyltransferases+and+other+S-adenosyl-L-homocysteine-binding+Proteins+by+Capture+Compound+Mass+Spectrometry+%28CCMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS).</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Köster, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+compound+mass+spectrometry%3A+a+technology+for+the+investigation+of+small+molecule+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).</li>
<li>Düvel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+proteomics+approach+to+identify+c-di-GMP+binding+proteins+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).</li>
<li>Christen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+control+of+cyclic+di-GMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Allosteric control of cyclic di-GMP signaling.</a> J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).</li>
<li>Balasubramanian, D., Mathee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptome+analyses+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Human+genomics%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa.</a> Human genomics. 3, 349-361 (2009).</li>
<li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+models+and+empirical+bayes+methods+for+assessing+differential+expression+in+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Stat+Appl+Genet+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments.</a> Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).</li>
<li>Baraquet, C., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+diguanosine+monophosphate+represses+bacterial+flagella+synthesis+by+interacting+with+the+Walker+A+motif+of+the+enhancer-binding+protein+FleQ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).</li>
<li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).</li>
<li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).</li>
<li>DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+differential+scanning+fluorimetry+as+a+high-throughput+assay+to+identify+nuclear+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+receptor+signaling%22%5BJournal%5D)">Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands.</a> Nuclear receptor signaling. 10, e002(2012).</li>
<li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+quantifies+biomolecular+interactions+under+previously+challenging+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions.</a> Methods. 59, 301-315 (2013).</li>
<li>Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+messenger+bis-%283%E2%80%98-5%E2%80%99%29-cyclic-GMP+and+its+PilZ+domain-containing+receptor+Alg44+are+required+for+alginate+biosynthesis+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+cyclic+diguanylate+in+the+non-catalytic+EAL+domain+of+FimX+induces+a+long-range+conformational+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change.</a> J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Özel dikkat protokolünün çeşitli adımlarda alınmalıdır. Protein konsantrasyonu, 10 mg bir konsantrasyonda olan kritik bir parametredir / ml hücreleri özel büyüme koşulları altında (örneğin, biyofilm veya küçük koloni varyantları) altında yetiştirilir zaman erişilmesi zor olan. Bu nedenle, pelet yeniden süspansiyon lisis tamponu düşük bir hacme yapılmalıdır. Protein konsantrasyonları, 8 mg / ml&#39;ye kadar azaltılabilir. Nesper ve diğ. 1 tarafından yayınlanan yönteme karşılaştırıldığında, nü...

c-di-GMP onların büyüme ve davranış çeşitli yönlerini kontrol etmek için en bakteriler tarafından kullanılan bir anahtar ikinci habercidir. Örneğin, Cı-di-GMP hücre döngüsü ilerlemesini, motilite ve eksopolisakaridlerin ve yüzey adhesinler 2-4 ekspresyonunu düzenler. Bu işlemler, koordinasyonu yoluyla, c-di-GMP biyofilm oluşumunu, patojenik bakterilerin 5 bir dizi kronik enfeksiyonlar ile ilişkili olan bir süreci desteklemektedir. c-di-GMP katalitik GGDEF alanı 4 liman diguanylate siklazlar (KEGM) olarak adlandırılan enzimler tarafından sentezlenmiş edilir. Bazı KEGM aşağı c-di-GMP bağlanması üzerine siklaz aktivitesini düzenleyen bir inhibitör sitesine sahip. C-di-GMP bozulması katalitik EAL veya HD-GYP ya etki 6,7 barındıran fosfodiesteraz iki farklı sınıflarına (PDE) ile katalize edilmektedir. doğrudan, c-di-GMP bağlayan bilinen efektör proteinlerin çoğunluğu protein sadece üç sınıftan birine ait: katalitiğimüttefiki inaktif GGDEF veya EAL etki ve Pilz alanları, c-di-GMP 8 bağlanması üzerine yapısal değişikliklere uğrarlar küçük moleküler anahtarlar. KEGM, KDD ve Pilz proteinleri iyi karakterize edilir ve onların etki nispeten güvenli silico tahmin edilebilir. Belirli bir ilgi şimdi c-di-GMP efektörlerinin yeni sınıfların belirlenmesi üzerine odaklanmıştır. Farklı bağlama motifleri ile Bazı c-di-GMP efektörleri Burkholderia cenocepacia CRP / FNR protein ailesi Bcam1349 veya P. transkripsiyonel regülatör FleQ olarak son zamanlarda böyle tarif edildi aeruginosa 9,10. Buna ek olarak, c-di-cGMP-spesifik riboswitches son zamanlarda belirlenen ve bir C-di-GMP-bağımlı bir şekilde 11 içinde gen ekspresyonunu kontrol etmek için gösterilmiştir. Farklı etkileyicilerin c-di-GMP bağlama motifleri sadece kötü korunmuş tür proteinlerin biyoinformatik tahminleri zor yapıyoruz. Bu sorunu çözmek için, bir C-di-GMP SPE kullanımına dayanan bir biyokimyasal yöntemler geliştirilmiştir, spesifik yakalama Bileşik kütle spektrometresi 1,12,13 ile birlikte. Biz son zamanlarda (CDG-CC, Şekil 1) yeni bir üç değerlikli c-di-GMP Yakalama Bileşik tasarladık 1. Bu kimyasal iskele oluşmaktadır: bağlayıcı proteinleri, c-di-GMP yakalamak için yem olarak kullanılan 1), bir c-di-GMP kısım, 2) bir UV ışıkla reaktif grup bağlantı geçmek için kullanılan bağlı proteinlere CdG-CC ve 3) ise biotin streptavidin-kaplı manyetik boncuklar kullanılarak çekilen proteinleri izole etmek. CdG-CC doğrudan olarak ve özellikle hücre lizatları gibi makromoleküllerin kompleks bir karışımdan, c-di-GMP efektör yakalamak için kullanılabilir. Yakalama Bileşik bazlı ve kimyasal proteomik temelli yaklaşımlar, daha önce organizmaların geniş bir yelpazede için geçerli olduğu bildirilmiştir, örneğin Caulobacter crescentus, Salmonella enterica serovar typhimurium ve S. aeruginosa 1,14. Bu metodolojik yazıda,Biz P. özler kullanılarak MTSK prosedürü derinliği açıklamasında bir sağlamak Örneğin, aeruginosa. Bu çalışma, biyokimyasal küçük molekül sinyalizasyon dahil yeni bileşenleri tanımlamak için güçlü ve çok yönlü bir araç olarak CCMS kurar.

<table><tbody><tr><td>caproBox</td><td>caprotec bioanalytics</td><td>1-5010-001 (220 V)</td><td>96 plakalı soğutma bloğuna bağlı UV lambaları, fotoaktivasyon</td></tr><tr><td>için caproMag</td><td>caprotec bioanalytics</td><td>CCMS Başlangıç Kitine dahildir</td><td>Pipetleme olmadan manyetik partiküllerin kolay kullanımı için</td></tr><tr><td>c-di-GMP caproKit</td><td>caprotec bioanalytics</td><td>talep</td> <td>üzerineKit, c-di-GMP-yakalama bileşiği, c-di-GMP (rekabet kontrolü için), streptavidin kaplı manyetik boncuklar, yakalama tamponu ve yıkama tamponu içerir</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık PD-10 Tuz Giderme Sütunları</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>12 tüplü PCR şeritleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1114</td><td></td></tr><tr><td>UIS250v sonikatör ile VialTweeter</td><td>Hielscher ultrason teknolojisi</td><td>UIS250v ve VialTweeter</td><td></td></tr><tr><td>Minyatür Fransız Basınç Hücresi</td><td>Termo Elektron Şirketi</td><td>FA-003</td><td></td></tr></tbody></table>

yakalama bileşik kütle spektrometre - roman c-di-gmp efektör proteinler tanımlamak için güçlü bir araç

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Kayda değer bir ilerleme, ikinci haberci, c-di-GMP sentezi (diguanylate siklazlar) ve ayrışma (fosfodiesteraz) yer alan enzimler üzerindeki tanımı ve karakterizasyonu için doğru, son on yıl içinde yapılmıştır. Buna karşılık, az bilgi bu sinyal molekülü hücresel süreçlerin çeşitli bir yelpazede düzenleyen hangi aracılığıyla moleküler mekanizmalar ve hücresel bileşenleri ile ilgili mevcuttur. Bilinen efektör proteinlerin çoğu Pilz ailesine ait veya kataliz vazgeçmiş ve efektör fonksiyonunu benimsemiş diguanylate siklazlar veya fosfodiesterazları dejenere edilmektedir. Bu nedenle, daha iyi bir deneysel yöntemler siliko tahminler güvenilir başarısız olduğu için yeni etkenleri tanımlamak ve doğrulamak için gerekli olan bakterilerin geniş bir aralıkta hücre C-di-GMP ağ tanımlamak için kullanılır. Biz son zamanlarda güçlü bir araç olarak bir roman Yakalama Bileşik Kütle Spektrometre (MERNİS) tabanlı teknoloji geliştirdikbiyokimyasal tespit ve c-di-GMP bağlayıcı proteinler karakterize etmektedir. Bu teknik, daha önce organizmaların 1 geniş uygulanabilir olduğu bildirilmiştir. Burada biz böyle sinyal bileşenlerini prob kullanan protokol ayrıntılı bir açıklamasını verir. Bir örnek olarak, Pseudomonas aeruginosa, C-di-GMP hastalık oluşturma ve biyofilm kontrolünde önemli bir rol oynadığı bir fırsatçı patojendir kullanın. MTSK C-di-GMP ağ bilinen ya da tahmin edilen bileşenlerin% 74 (38/51) tespit edilmiştir. Bu çalışma detaylı MTSK prosedürü açıklar ve küçük molekül sinyalizasyon dahil yeni bileşenleri tanımlamak için güçlü ve çok yönlü bir araç olarak kurar.

P. roman c--di-GMP efektörler belirlemek için aeruginosa sistematik P. Çözünür ve zar fraksiyonları analiz etmek için kullanılan CCMS Bir günlük faz kültüründen aeruginosa suşu PAO1 (= 0.5 OD 600). Burada özetlemek ve bu balıkçı sefer temsili sonuçlarını tartışmak. Dört bağımsız biyolojik kopyaları kullanılmıştır. Her deney için, iki farklı CdG-CC konsantrasyonu (5 uM, 10 uM) kullanılmıştır. Özgüllük için prob için, deneyler (Tablo 1) (örneğin, CdG...

Her yerde bulunan ikinci haberci c-di-GMP, birçok bakterinin büyümesini ve davranışını kontrol eder. Hemen hemen her bakteri türünde c-di-GMP bağlayıcı proteinleri biyokimyasal olarak tanımlamak ve karakterize etmek için yeni bir Yakalama Bileşik Kütle Spektrometresi tabanlı teknoloji geliştirdik.

Yakalama Bileşik Kütle Spektrometre - Roman c-di-GMP Efektör Proteinler tanımlamak için güçlü bir araç

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Yakalama bileşiği kütle spektrometresi deneyinin genel amacı, döngüsel kalıp GMP bağlayıcı proteinleri yakalamak ve tanımlamaktır. Bu, Fransız presi ile bir hücre kültürü olan fraksiyonlama ve serbest döngüsel kalıp gmp'nin çıkarılmasıyla elde edilir. İkinci adım olarak bir PD 10 sütunu kullanılarak, yakalama bileşiği eklenir ve fazla miktarda serbest döngüsel kalıp GMP'nin yokluğunda veya varlığında yakalama bileşiğine bağlı döngüsel kalıp GMP bağlayıcı proteinleri kovalent olarak çapraz bağlamak için UV ışığı ile aktive edilir.Daha sonra, yakalama bileşiği, yakalanan proteinleri yoğun bir şekilde yıkamak için streptavidin kaplı manyetik boncuklara bağlanır. Son olarak, yakalanan proteinler sindirilir ve üretilen peptitleri tanımlamak için kütle spektrometresi için hazırlanır Sonuçlar daha sonra in silico olarak analiz edilir. CCMS'nin birlikte çökeltme gibi mevcut yöntemlerimizin ana avantajı, yakalama bileşiğinin doğrudan ortakların spesifik yakalamayı iyileştirmesi ve kovalent maliyet bağlantısı sayesinde zorlu yıkama koşullarına izin vermesidir.Şimdi bu yöntem, bakteriyel döngüsel di GMP sinyalizasyonu hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca, genel olarak nükleotid sinyalizasyonu

capture-compound-mass-spectrometry-powerful-tool-to-identify-novel-c

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kütle spektrometresi büyük protein kompleksleri ve analiz etmek için değerli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu yöntem, çok-altbirim meclislerinin bileşimi, stokiyometri ve genel mimari içgörüler sağlar. Burada, tarif, adım-adım yapısal bir kütle spektrometresi analizi gerçekleştirmek ve makromoleküler yapıları karakterize etmek için nasıl.

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Yakalama Bileşikler fotoğraf crosslinking ve saflaştırma takip fonksiyonel geri dönüşümlü küçük molekül-protein etkileşim proteom karmaşıklığını azaltmak için trifunctional küçük moleküllerdir. Burada Yakalama...

Methyltransferases, profilleme ve Diğer S Adenosil- L</subYakalama Bileşik Kütle Spektrometresi (CCMS)> homosistein bağlayıcı Proteinler

Kararlı İzotop Standartlar ve Anti-Peptid Antikorlar (SISCAPA) kendi proteinler için vekilleri olarak peptidler kantitatif ölçüm sağlamak için kararlı izotop dilüsyon kütle spektrometresi (MRM-MS) ile peptitler çiftler yakınlık zenginleştirme yakalayın. Burada kısmen otomatik bir biçimde manyetik parçacıklar kullanarak protokol açıklar.

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

Biz doğru ve yanlış protein-protein etkileşimleri ayırmak için önce tanıtıldı HIZLI (Nakavt ile birlikte kantitatif immünopresipitasyon) yaklaşımın bir çeşitleme sunuyor. Bizim yaklaşıma...

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

sıvı kromatografisi / kütle spektrometresi ile pufferfish türleri genotipleme için geliştirilmiş bir polimeraz zincir reaksiyonu restriksiyon parça uzunluk polimorfizm yöntemi tarif edilmektedir. Ters-faz silis yekpare kolonu sindirilmiş amplıkonları ayırmak için kullanılır. Bu yöntem, baz bileşimi tanımlamak için yararlıdır oligonükleotidlerin Monoizotopik kitleleri aydınlatmak olabilir.

Sıvı Kromatografi / Kütle Spektrometresi zehirlidir pufferfish Geliştirilmiş Polimeraz Zincir Reaksiyonu-kısıtlama Parça Uzunluk Polimorfizmi Genotiplemesi

Kombine ön-madde izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) izobarik etiketlerin örnek çoğullama kabiliyetini arttıran bir sayısal proteomik stratejisidir. Bu protokol bir Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tipli kontrollerden dokulara cPILOT uygulanmasını tarif etmektedir.

Geliştirilmiş Numune Kombine Öncül İzotop Etiketleme ve Isobaric Etiketlemeyi Kullanma Dokuların çoğullama (cPILOT)

Protein kompleksleri onların fonksiyonu için temel bir mimaridir. Çeşitli kitle spektrometrik teknikleri birleştirerek kendi derleme çalışması için güçlü olduğunu kanıtladı. Biz kimyasal cross-linking ve yerel kütle spektrometresi protokolleri sağlamak ve nasıl çoklu alt birim protein derlemeler mimarisini aydınlatmak için tamamlayıcı bu teknikleri yardımcı göstermek.

Kimyasal Cross-linking ve çoklu alt birim Protein derlemeler mimarlık okumak için olduğu gibi Protein kompleksleri kütle spektrometresi birleştirme

Kompleks biyolojik örneklerden her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidlerin arıtılmı, saptanması ve tanımlanması için bir yöntem salıyoruz. Sunulan yöntem çoğaltılabilir, sağlam ve ubiquitinome analizinin derinliği düzeyine göre yayınlanmış yöntemleri geride bırakır.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

Bu iş akışı, nicel küresel proteomik analiz için aynı anda birden fazla protein çeviri sonrası modifikasyonun (PtM) zaman ve maliyet-etkin zenginleşmesinin performansını açıklar. Protokol, ptm çapraz konuşmasına biyolojik kavrayışlar kazandırmak için birden fazla konjuge antikorla peptid düzeyinde PTM zenginleştirme, ardından da veri bağımsız iktisap kütle spektrometresi analizini kullanmaktadır.

Niceleme ve Site Yerelleştirmesi Için İki Çeviri Sonrası Modifikasyonun Eşzamanlı Affinity Zenginleştirmesi

Kombine öncül izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT), mevcut izobarik etiketlerle eş zamanlı olarak analiz edilebilen numune sayısını artırabilen gelişmiş bir numune çoklama stratejisidir. Robotik bir platformun dahil edilmesi deneysel iş bilgililiği, tekrarlanabilirliği ve nicel doğruluğu büyük ölçüde artırmıştır.

Kombine Öncül İzotopik Etiketleme ve İzobarik Etiketleme (cPILOT) kullanılarak Otomatik Numune Çoklama

Keşfedin, bakteriyel siklik di-GMP bağlayıcı proteinleri tanımlamak için yakalama bileşik kütle spektrometrisi (CCMS) yöntemini. UV ışığı ile kovalent çapraz bağlama ve streptavidin manyetik boncuklarla yıkama sağlar.

Yakalama Bileşik Kütle Spektrometre - Roman c-di-GMP Efektör Proteinler tanımlamak için güçlü bir araç

Daha fazla video keşfet