Name: Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-23T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Keşfedin Sendai virüsü ile insan fibroblast hücrelerini transgen içermeyen iPSC'lere yeniden programlama yöntemini. Bu protokol, kök hücre biyolojisinde güvenli ve verimli bir teknik sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz el yazması değerli tartışmalar için Lee laboratuar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Lee laboratuarda çalışma Hücre Araştırma Fonu (Tedco) Kök New York Kök Hücre Vakfı Robertson Araştırmacı Ödülü ve Maryland hibe tarafından desteklenmiştir.

1.. Hücre hazırlanması ve Ortam (Gün 1) <ol><li> Kültür ve DMEM ortamı,% 10 FBS ihtiva eden insan fibroblast genişletmek. </li><li> Plaka insanlara özgü fibroblastlar; transdüksiyon bir gün önce oyuk başına uygun bir yoğunlukta bir 24-yuvalı plaka üzerine (Şekil 1). NOT: farklı hücre tipleri farklı bağlanma yeteneği var çünkü şu seri seyreltme (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K ve 6.25K) önerilir. </li><li> Hücreler tamamen yapışmış ve genişletmiştir sağlanması, bir 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde bir gün için hücreler inkübe edin. </li></ol> 2.. İletimi yapın (2. Gün) <ol><li> Transdüksiyon gününde, hücre yoğunluğunu kontrol etmek ve en etkin yoğunluğu kuyu (Şekil 2) seçtik. Yüksek (80 ~% 90), orta (50 ~% 70) ve düşük (20 ~ 40%): Bu üç farklı yoğunlukları almak daha iyidir. </li><li> En az 1 saat önce transdüksiyon, fibrobl aspireast hücrelerden ortam ve fibroblast ortamın yeni bir 300 ul değiştirin. </li><li> -80 ° C depolama 4 farklı Sendai virüs tüplerin bir set çıkarın. Birkaç saniye için bir 37 ° C su banyosu içinde, aynı zamanda, her tüp çözülme ve sonra su banyosundan tüpleri alır. Daha sonra, oda sıcaklığına kadar bunları çözülme; santrifüj 10 saniye boyunca 6.000 xg&#39;de tüpler ve kullanıma kadar buz koyun. -Donma yeniden ve titreleri korumak değil çünkü virüs cozundurmeden. </li><li> Mikro santrifüj tüpüne dört Sendai virüsü boruların (Ekim-4, Klf-4, c-Myc ve Sox-2) her birinin, belirtilen miktarlar ekleyin. Çözelti hafifçe pipetleme iyice karıştırılır olduğundan emin olun. Örneğin, transdüksiyon için 24 oyuklu plaka içinde LOOKWELL 50K hücre / bir de: (Life Technologies Analiz Sertifikalarını dayalı Titer, partiden diğer partiye farklı olabilir) Tüp hOct-4 = 6.0 x 10 7 UKÜ, 3 İçişleri Bakanlığı 5 ul = Tüp hSox-2 = 6.5 x 10 7 CIU, 3 MOI = 4.6 μ; L Tüp hKlf-4 = 6.3 x 10 7 UKÜ, 3 İB = 4.8 ul Tüp hc-Myc&#39;nin = 7.8 x 10 7 UKÜ, 3 İB = 3.8 ul Toplam = 24 oyuklu plakanın dört virüs faktör karışımı / bir de (50K hücreleri) 18.2 ul </li><li> Hücre yoğunluklarına göre; 2X, 1X ve kuyunun içine virüs karışımı 0.5x hacim eklemek. Yavaşça, plaka önden arkaya sallayın sol ve sağ (2X: virüs karışımı, 1X 36.4 ul: 18.2 ul ve 0.5x: 9.1 ul). </li><li> 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe hücreleri koyun ve bir gece boyunca inkübe edilir. </li></ol> 3.. Kültür Orta Değiştirme (Gün 3 &amp; Day 5) <ol><li> 24 saat transdüksiyon sonra, 500 ul taze fibroblast ortam ile orta yerine. </li><li> 5. günde, taze fibroblast medya ile Orta değiştirin. </li></ol> 4.. Co-kültür için MEF Yemekleri hazırlayın (Gün 8) <ol><li> % 10 ile 60 mm kültür tabaklarında MEF hücreleri hazırla FBS DMEM ortamı bir da ihtivaMEF besleyici-hücreleri üzerine transdüse fibroblast pasaj önce y. Not: Her 60 mm çanak MEF 5 x 10 5 kullanıyorsunuz. </li></ol> 5.. Başlangıç ​​Co-kültür MEF besleyici hücreler (Gün 9) ile Hücreleri kalıt <ol><li> Transduced hücreleri kaplama önce, aspirat% 10 FBS MEF besleyici yemekler DMEM ortamı bulunan ve FBS DMEM ortamı ihtiva eden taze% 10 ekleyin. </li><li> 24 oyuklu bir plaka içerisinde olan ve D-PBS ile bir kez yıkama hücreleri transduse fibroblastlardan orta çıkarın. 24-çukurlu plaka inthe fibroblast hücreler içine% 0.25 tripsin / EDTA, 200 ul ekleyin. Hücreler plakadan kopmaya başladığından zaman tripsin / EDTA, birlikte en az 5 dakika inkübasyondan sonra, 15 ml konik bir tüp içinde büyüme ortamı ile hücreleri toplamak. Daha sonra 4 dakika boyunca 6,000 x g de santrifüj. NOT: 2X, 1X ve 0.5X virüs Havuzlanması transdük fibroblast tavsiye edilir. </li><li> Süpernatan Ortamı çıkarın ve yeniden askıya yıkamatripsin ile nötrleştirme için taze ortam fibroblast 4-5 ml hücre topağı. Daha sonra 4 dakika boyunca 135 x g&#39;de santrifüj. </li><li> Örneğin 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 ve 1/128 60 sayısı: seri seyreltme yoğunluğu olarak ve MEF üzerine fibroblast ortam ile birlikte kültür için başlangıç ​​Plaka hücreleri mm çanak. Transdüksiyon ilk haftasında hücre ölüm oranı ile ilgili olarak, bir 1/2 veya 1/128 yoğunluğa seyreltilmesi gerekmeyebilir. Transgen RT-PCR için bir pozitif kontrol olarak, toplam RNA çıkarmak için bir kenara kalan hücrelerin koyun. </li><li> % 5 CO2 inkübatör gece boyunca, 37 ° C&#39;de 60 mm yemekler yerleştirin. </li></ol> 6.. İnsan Embriyonik Kök Hücre Orta Yem ve Hücreleri (Gün 10) Monitör <ol><li> Ertesi gün, 10 uM Y-27632, insan ES ortama fibroblast ortamı değiştirmek. Bundan sonra, insan ES ortamı ile günlük orta değiştirin: 800 ml DMEM/F12 + 200 mi Knockout Serum Replacement + 10 ml L-glutamin, 10 mM + 10 minimum MEM esansiyel olmayan amino asitler miTemel Fibroblast Büyüme Faktörü 2-mersaptoetanol + 10 ng / ml + 1 ml. </li><li> Taze insan ES medya ile bir günlük medya değişiklik yapmak. Bir hafta sonra, koloni ES-benzeri hücre kümeleri oluşumu için bir mikroskop altında bir kez toplam 2 ~ 3 gün bulaşıkları kontrol edin. Koloniler bulundu önce hücre tipine bağlı olarak, kültür daha çok veya daha az zaman alacaktır. </li></ol> 7. Uyarılmış pluripotent hücre kolonileri Kök ve Hücreleri genişletin Toplama (Gün 20 ~) <ol><li> Üç hafta sonra, transdüksiyon, koloni toplama için uygun yetiştirilen görünmelidir. </li><li> Koloni toplama bir gün önce, 24 oyuklu bir plaka içerisinde MEF besleyici hazırlar. NOT: Biz bir 24-plaka içinde MEF 12.5 x 10 5 kullanıyorsanız. </li><li> Ertesi gün, 10 uM Y-27632, insan ES ortama fibroblast ortamından MEF yemekler orta değiştirin. Elle toplama başlığı içinde mikroskop altında her zaman bir koloni almak ve pipetleme küçük kümeleri yapmak ve bunları aktarmakyeni birçok klon almak için MEF dishes.Try hazırlanan üzerine. </li><li> Geçidi ve başlangıçta bir 6 yuvalı plakaya bir 24-çukurlu plaka her bir genişletme. Daha sonra, 6-çukurlu plaka yayılımıyla önce, 60 mm tabaklar için. </li></ol> (10 geçiş sonrası) İnsan iPSCs 8. Karakterizasyonu <ol><li> İmmünofloresan <ol><li> Günde ortam değişikliği ile 4-5 gün boyunca 24 oyuklu plaka ve kültür Plate insan iPSCs. </li><li> Imüno-flüoresan deneyi çalıştırmak için, bir kere D-PBS ile plakayı yıkayın. Daha sonra 30 dakika boyunca% 0.4 paraformaldehid içinde hemen hücreleri gidermek. Daha sonra 5 dakika süre ile D-PBS içinde üç kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton X-100 çözeltisi ile işlem görmüş hücrelerin tedavi. </li><li> Permeablization çözeltisi (% 0.1 triton X-100 çözeltisi) aspire, daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 0.5 BSA bloke çözeltisi ilave edilir. </li><li> Nanog&#39;un, Ekim-4, SSEA (evre özgü embriyonik ANTIG bir algılama gerçekleştirinen) ve TRA-1-81,% 0.5 BSA çözeltisi içinde bir anti-insan antikoru kullanılarak (tümör rejeksiyon antijen) (antikor seyreltme oranı için malzeme tablosunu kontrol edin). Oda sıcaklığında 2 saat için primer antikor inkübe edin. Daha sonra 5 dakika her biri için D-PBS içinde üç kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında% 0.5 BSA çözeltisi içinde 1:2,000 seyreltilmiştir 2. antikor olarak Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG antikorları ile inkübasyondan 1 saat sonra floresan mikroskobu kullanılarak kontrol edin. DAPI ile her bir besleyici hücreleri ve MEF hiPSCs tüm çekirdek Leke. </li></ol></li><li> Transgen Teyit RT-PCR <ol><li> RNA ekstraksiyon reaktifleri kullanılarak hücre pelletinden toplam mRNA ekstrakte edin. </li><li> Ters transkriptaz ile PCR amplifikasyonu için toplam RNA ve elde edilen cDNA alikotları üzerinde bir ters transkripsiyon (1 ug) yapın. </li><li> CDNA şablon 2 ul, 2x PCR Master Mix 10 ul, primerler 2 pmol 2 ul içeren PCR karışımları hazırlamak(Ileri: 1 ul ve ters: 1 ul) ve DW 6 ul. Tablo 1 &#39;de sıralanan primerler ile RT-PCR yapmak, gen ekspresyonunu tespit etmek için. </li><li> Amplifikasyon reaksiyonları verimliliği için bir kontrol olarak, GAPDH geni ile RT-PCR&#39;ler gerçekleştirin. Görselleştirme ve% 1 agaroz jel elektroforezi ile analiz PCR ürünü. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+without+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.</a> Science. 322, 949-953 (2008).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
<li>Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+induced+pluripotent+mouse+stem+cells+by+the+piggyBac+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon.</a> Nature Methods. 6, 363-369 (2009).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Yoshioka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Human+iPSCs+by+a+Synthetic+Self-Replicative+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA.</a> Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).</li>
<li>Fluri, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation%2C+expansion+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+continuous+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures.</a> Nature Methods. 9, 509-516 (2012).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+without+Myc+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.</a> Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22P+Jpn+Acad+B-Phys%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.</li>
<li>Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome+inactivation+and+epigenetic+fluidity+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

HiPSCs insan somatik hücreleri yeniden programlama temel biyoloji, kişisel tıp ve transplantasyon 12 görülmemiş sözleri tutar. Daha önce, insan iPSC nesiller gibi ilaç geliştirme ve nakli tedavileri 13 gibi diğer klinik uygulamaları sınırlandıran istenmeyen genetik mutasyonlar oluşturabilir konakçı genomu içine entegrasyon riski DNA virüsü gereklidir. Bu nedenle birlikte, birçok çalışmada çeşitli alternatif yöntemlerle vektör ve transgen-free sistemi, insan iPSCs oluşturmak için rapor edilmiştir, a...

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) ilaç taraması için, hastalık modelleme için potansiyel olarak yararlı olabilir ve hastalık ve doku yaralanmaları tedavi etmek için hücre tabanlı tedaviler geliştirmek için kendini yenilemek in vitro ve sahip pluripotensin bir kapasiteye sahip. Ancak, HESC çünkü, immünolojik onkolojik ve etik engellerin hücre replasman tedavisi için bir sınırlama var, ve hastalık ile ilgili genlerin çalışma, hastalığa özgü HESC pre-implantasyon genetik tanı (PGD) yaklaşımları ile izole edilebilir, ama yine de teknik açıdan zor ve embriyo bağışlar oldukça nadirdir. Bu sorunlar, uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) gelişmesine yol açmıştır kök hücre biyolojisi, ilerleme ile ilgilidir. İnsan iPSCs genetik yetişkin insan somatik hücrelerinden yeniden programlanan ve onları böyle d gibi rejeneratif tıp için yararlı bir kaynak yapar HESC benzer pluripotent kök hücre benzeri özellikler, liman vardırhalı keşif, hastalık modelleme ve hastaya özgü şekilde 1,2 hücre tedavisi. Bugüne kadar, virüs aracılı (retrovirüs ve adenovirüs) dahil olmak üzere insan iPSCs oluşturmak için çeşitli yöntemler, 3, non-virüs aracılı (BAC sistemi ve vektörler transfeksiyon) 4 gen transdüksiyon ve protein dağıtım sistemi 5-7 vardır. Virüs-aracılı gen iletim verimliliği belirli bir düzeyde olmak, ancak bunlar, kontrolsüz bir şekilde yeniden programlama genleri ifade etmek için bir ev sahibi kromozomları içine entegre, çünkü viral vektörler, genetik iz bırakabilir. Transkripsiyon faktörlerinin viral entegrasyonu etkinleştirmek veya konak genleri 8 inaktive olabilir bile, bu beklenmedik bir genetik sapma ve tümörgenez 5,9 riskini neden olabilir. Öte yandan, somatik hücrelere protein veya RNA doğrudan katılması bildirilmiştir, ancak bu emek-yoğun, tekrarlı transf gibi bazı dezavantajları vardır edildiection ve 7,10 yeniden programlama düşük seviyesi. Hatta epizomal olmayan entegre adenovirüs, adeno-bağlantılı virüs, ve plasmid vektörler yine 11 göreli olarak daha az verimlidir. Bu nedenlerden dolayı, iPSC nesil yüksek etkinlik ve daha az genetik anormallikler olmayan entegrasyon yeniden programlama yöntemlerini seçmek için makul. Bu çalışmada, bir-Sendai virüs esasına dayalı yeniden programlama kullanın. Bu yöntem, konakçı genomuna entegre olmayan ve tutarlı bir şekilde, transgen entegrasyon olmadan insan iPSCs üreten olduğu bilinmektedir.

<table><tbody><tr><td>CytoTune-iPS Yeniden Programlama Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>A1378002</td><td></td></tr><tr><td>CF-6, MEF'ler, neomisin dirençli, mitomisin C ile tedavi edilmiş&nbsp;</td><td>Küresel kök</td><td>GSC-6105M</td><td>5 x 105 / 6 cm veya 12,5 x 105 / 24 kuyulu plaka</td></tr><tr><td>Tripsin EDTA 4Na ile% 0.25 Tripsin 1X</td><td>Invitrogen</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F-12 orta</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu Hücre Kültürü Plakası, kapaklı düz tabanlı</td><td>BD</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td>10 &#956; M (Stok: 10 mM)</td></tr><tr><td>temel fibroblast büyüme faktörü</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td>PHG0263</td><td>10 ng (Stok: 100 ug)</td></tr><tr><td>Nakavt serum replasmanı</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039; s Modifiye Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), sıvı (yüksek glikoz)</td><td>İnvitrojen</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin-200 mM (100X), sıvı</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td>1/100</td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi, 100X</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td></td> 11140050 <td>1/100</td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol (1.000X), sıvı</td><td>GIBCO</td><td>21985023</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>Hausser Faz Kontrast Hematitometreleri</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax %0.1 Jelatin</td><td>Çözeltisi Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>DSHB</td><td>MC-813-70</td><td>1/200</td></tr><tr><td>anti-Tra-1-81</td><td>Hücre Sinyali</td><td>4745S</td><td>1/200</td></tr><tr><td>fare monoklonal Oct4 antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>Nanog Ar-Ge</td><td> D</td><td>AF1997</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>Alexa Flouor 488 keçi anti-fare</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>948492 1/2.000</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&#039; s Fosfat Tamponlu Salin), 1X kalsiyum içermez & magnezyum</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>205313</td><td></td></tr><tr><td>PCR Master Mix [2X]</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>toplama başlığı</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td></td></tr><tr><td>diseksiyon kapsamı&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td> dijital fotoğraf</tr></tbody></table> makinesi

sendai-virüs ile İnsan somatik verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Birkaç yıl önce, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) kurulması biyomedikal yeni bir dönem başlatmıştır. Insan iPSCs potansiyel kullanımları, insan genetik hastalıklarının modellenmesi patogenezi, gen düzeltme sonrası otolog hücre tedavisi ve hastaya özgü ve belirti gerekli hücrelerin bir kaynağı sağlayarak kişiselleştirilmiş ilaç tarama içerir. Ancak, bu tür bir insan iPSCs üretim sonrası kalan yeniden programlama faktörü transgen ekspresyonunu ortadan kaldırarak üstesinden gelmek için çok engel vardır. Daha da önemlisi, farklılaşmamış insan iPSCs kalıntı transgen ifadesi doğru farklılaşmaları engel ve hastalıktan ilgili vitro fenotiplerinde yorumunu şaşırtıp-saptırırlar olabilir. Bu neden ile, entegrasyon içermeyen ve / veya transgen içermeyen insan iPSCs adenovirüs, piggyBac sistemi minicircle vektör epizomal vektörler, direkt protein temini gibi çeşitli yöntemler kullanılarak geliştirilmiş ve mRNA sentezlenmiştir. Bununla birlikte, reprogra etkinliğientegrasyon-ücretsiz yöntemlerle features çoğu durumda oldukça düşüktür. Burada, Sendai-virüsü (RNA virüsü) tabanlı yeniden programlama sistemi kullanarak insan iPSCs izole etmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem, yeniden programlama tutarlı sonuçlar ve düşük maliyetli bir şekilde yüksek bir verimlilik göstermektedir.

Genellikle enfekte fibroblastlar Sendai virüs iletiminde sonra birkaç gün içinde herhangi bir morfolojik değişiklik görünmüyor, ancak beş gün sonra, farklı şekiller (Şekil 1) sahip başlar. Şekil 1, bir sağ panelde tarif edildiği gibi, hücreler, daha fazla tipik fibroblast morfolojiye sahip değildir. Bunlar sitoplazmada daha yuvarlak bir şekil ve büyük çekirdeği vardır. Transdüksiyon% 80 hücresel confluency gerçekleştirildiğinde bile onlar yeniden programlamak başladıktan sonra onlar kuy...

Burada, biz tutarlı sonuç ve geliştirilmiş verimlilik gösterir Sendai virüs ile transgen-özgür insan iPSCs içine insan somatik hücreleri yeniden programlamak için kurulan yöntem sunuyoruz.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Bu prosedürün genel amacı, Sendai virüsü ile insan kaynaklı pluripotent kök hücreler üretmektir. Bu, önce transdüksiyona tabi tutulacak fibroblast hücrelerinin hazırlanması ve kaplanması ile gerçekleştirilir. İşlemin bir sonraki adımı, hücreleri Sendai virüsü ile enfekte etmektir.Daha sonra enfekte fibroblast hücreleri taze fare embriyonik fibroblast besleyici hücrelerine aktarılır. Son adım, yeniden programlananı manuel olarak seçmektir. Şimdi pluripotent kök hücreler, sonuçta fibroblast hücrelerinin trans genler kullanılmadan I PSC'lere yeniden programlanması, immüno-etiketleme ve R-T-P-C-R yoluyla gösterilebilir.Bu tekniğin mevcut yönteme göre en büyük avantajı, transing bırakmadan ve uygun maliyetli bir şekilde yeniden programlama verimliliğini arttırmasıdır Bu protokol için DMEM'de kültürlenmiş hazır insan fibroblastlarına sahip olun. FBS ile bu hücreleri deney plakası için 24 kuyucuklu plakaya aktarın, hücre bağlanması için en iyi yoğunluğu belirlemek için hücreleri altı seri seyreltmede kullanın. 24 oyuklu plakanın her sırası, bir seyreltme hücre serisini barındırabilir.Böylece, dört hücre tipi bir plaka üzerinde test edilebilir, seyreltmeyi 24 saat boyunca inkübe edebilir. Ertesi gün, transdüksiyon için üç birleşme seviyesinde kuyuları seçin. Biri %80 ila %90 gibi yüksek bir birleşme seviyesinde, biri yaklaşık %60 birleşmede ve üçüncüsü transdüksiyondan bir saat veya daha fazla önce yaklaşık %30 birleşmede.Transdüksiyonun çözülmesi için ortamı 300 mikrolitre taze fibroblast ortamı ile değiştirin. Bir set Sendai virüsü tüpü birkaç saniye boyunca 37 santigrat derecede ve sonra bitirin. Onları oda sıcaklığında çözdürmek.Çözülmüş virüsleri 6.000 G'de 10 saniye santrifüjleyin ve bir mikro santrifüj tüpünde buz üzerinde saklayın. Transdüksiyon yapılacak hücre sayısına göre hesaplanan virüslerin bir karışımını yapın. Hesaplama detayları metin protokolünde bulunabilir.Nazik pipetleme ile virüsleri iyice karıştırın. Şimdi en yoğun hücrelere iki hacim virüs ekleyin. Orta yoğunluklu hücrelere bir hacim virüs ekleyin ve en az yoğun seleksiyona yarım hacim virüs ekleyin.Plakayı döndürün ve reaksiyonun ertesi gün gerçekleşmesi için gece boyunca inkübe etmesine izin verin. Ortamı 500 mikrolitre taze fibroblast ortamı ile değiştirin. Bunu iki gün sonra, transdüksiyonlu hücreler üzerinde yapılan ikinci medya değişikliğinden üç gün sonra tekrar yapın.Tabak başına %10 FBS plakası 500.000 hücre içeren DMEM ile 60 milimetrelik tabaklarda meth hücreleri hazırlayın ve gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, metamfetamin hücrelerindeki ortamı taze ortamla değiştirin ve ardından ko-kültürü kurmaya devam edin. İlk olarak, ortamı transdüksiyon fibroblastlarından çıkarın ve bunları DPBS ile bir kez yıkayın.Daha sonra, beş dakika içinde dönüştürülen her bir hücre kuyusuna 200 mikrolitre% 0.25 tripsin EDTA ekleyin. Tüm ayırma hücrelerini tek bir 15 mililitrelik konik tüpte toplayın. Hücreleri dört dakika boyunca 1.350 G'de döndürün.Daha sonra süpernatanı çıkarın ve trippin'i nötralize etmek için peletlenmiş hücreleri yaklaşık beş mililitre taze ortamla yıkayın. Şimdi hücreleri 1.350 G.Next plakada dört dakikalık bir dönüş ile toplayın. Hücrelerin çoğu metamfetamin içinde altı seri seyreltme olarak görülür.Hücrelerin ölüm hızına bağlı olarak ilk ve son seyreltmelere ihtiyaç duyulmayabilir. RNA ekstraksiyonu için bazı hücreleri saklayın ve plakaları gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, ortamı 10 mikromolar RO kinaz inhibitörü Y 2 7 6 3 2 ile desteklenmiş insan ES ortamı ile değiştirin.İlerleyen günlerde hücre sağkalımını iyileştirmek için, ortamı normal unsu takviyeli insan ES ortamına değiştirin. Bir haftalık kültürlemeden sonra, hücre kümeleri gibi ES kolonisi oluşumu için birkaç günde bir bulaşıkları kontrol etmeye başlayın. Göründüklerinde, büyümeyi izleyin.Transdüksiyondan üç hafta sonra, ES hücre kümelerinin kolonileri genişlemeye hazır olmalıdır. Metamfetamin besleyici hücreleri, 60 milimetrelik plakalar için hazırlandıkları gibi 24 kuyulu plakalarda da hazırladınız. Herhangi bir koloni seçmeden önce, metamfetamin hücreleri üzerindeki ortamı 10 mikrolitre Y, 2, 7, 6, 3, 2 içeren ES ortamına değiştirin.Bulaşıklardan her seferinde bir koloni seçin. Koloniyi, orada çözelti bulunan 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Pipetleyiciyi kullanarak koloniyi parçalayın.Sonra bir beni koru. Parçalanmış koloni ile. Sonuç olarak, her kuyuya parçalanmış bir koloni yükleyin ve mümkün olduğunca çok kuyu yükleyin.Hücreleri günlük ortam değişiklikleriyle koruyun ve bunları altı kuyucuklu plakaya ve ardından 60 milimetrelik kaplara genişletin. Tipik olarak, Sendai virüsü ile enfekte olan fibroblastlar, beş gün sonrasına kadar herhangi bir morfolojik değişiklik göstermezler. Daha sonra hücreler daha büyük bir çekirdeğe ve daha küçük sitoplazmaya sahip yuvarlak bir şekil alır.Bu küçük ölçekli protokol, fibroblast yoğunluğu, virüs titresi ve mes'e kaplama yoğunluğu gibi optimize edilebilecek çeşitli parametreler içerir. Farklı renklerde gösterilen farklı eş akıcılıktaki hücrelerin transdüksiyonu da optimize edilebilir. Metamfetamin besleyici hücrelerle bir haftalık ko-kültürden sonra, kısmen yeniden programlanmış fibroblastlar gevşek bir şekle sahiptir ve tripsin kullanılarak toplanmak yerine kolayca toplanır.Tamamen yeniden programlanmış I PSC'ler, kısmen yeniden programlanmış hücrelerden açıkça tanımlanabilir. Tamamen yeniden programlanmış hücreler sıkıca paketlenir ve koloniler net sınırlara sahip olabilir. Kısmen yeniden programlanmış hücreler, kolayca ayrılabilen gevşek kümeler oluşturur.IPSC klonlarını birkaç hafta boyunca genişlettikten sonra, H dokuz hücrelerine kıyasla kök hücre belirteçleri için boyama garanti edilir. IPC'ler, pluripotent kalitelerini destekleyen SSEA dört, OCT dört, TRA 81 ve nano G dahil olmak üzere beklenen birkaç antikora pozitiftir. İnsan IPSC klonlarında R-T-P-C-R transgen ekspresyonu kullanılması not edilmedi.Ekzojen OCT dört, SOX iki, klf dört ve Cmic için 10 primerden sonra, güçlü transgen ekspresyon seviyeleri gösteren pozitif kontrol örnekleri ile kullanıldı. Bu videoyu izledikten sonra, poli potent kök hücreleri indüklemek için somatik hücrelerin nasıl yeniden programlanacağını ve bunların nasıl seçileceğini, hücrelerin diğer hücrelerden nasıl tamamen yeniden programlanacağını iyi anlamış olmalısınız.

efficient-generation-human-induced-pluripotent-stem-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz, insan faktörleri Oct4, Sox2, Nanog ve Lin28 lentivirüs aracılı teslim kullanarak insan somatik hücre alınan uyarılmış pluripotent kök hücreleri üretimi için protokol göstermektedir. Pluripotency morfolojisi ve embriyonik kök (ES) hücre-spesifik belirteçler varlığı teyit edilmiştir.

Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla

Biz retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-myc (OSKM) kodlayan vektörler ve canlı boyama ile doğru yeniden programlanması hiPSC belirlenmesi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC) Tra-içine insan somatik hücre verimli yeniden programlama için bir protokol sunmak 1-81 antikor.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed

OCT4 bir retrovirüs-aracılı ektopik ifadesi ile insan kaynaklı hücreler pluripotent kök (iPSCs) üretmek için bir yöntem olup, SOX2, KLF4 ve MYC tarif edilmektedir. GFP dayanarak insan iPSC koloniler tespit etmek pratik bir yolu da tartışılmaktadır.

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Burada tek bir lentiviral yeniden programlanması vektörü kullanılarak periferal kan 3-4 ml insan iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Hazır kan hücrelerinin yeniden programlanması daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknoloji kullanımı hızlandırmak için vaat ediyor.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Lentiviral temelli, yeniden programlanmış ve karakterize edilmiş, faktörsüz insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin türetilmesi ve varsayılan klinik dereceli koşullara dönüştürülmesi için bir protokol tanımlıyoruz.

Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu protokol, yeniden programlama faktörleri içeren matrigel ve Sendai virüs vektörlerinin bir kombinasyonunu kullanarak, besleyicisiz koşullarda insan periferik T hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) nasıl üretileceğini açıklar.

Besleyici içermeyen şartlar Sendai virüs kullanılarak insan periferik T hücrelerinden uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu protokolün amacı, melanom tümörüne sızan lenfositlerin indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlanması için protokolü göstermektir.

İnsan Melanom tümör-süzücü lemfositler ile ilgili uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) yeniden programlanması için bir protokol öneriyoruz. Transdüksiyon kan hücrelerini santrifüjleme ile matris kaplı plakalara kaplayarak, iPSC'ler yüzen hücrelerden başarılı bir şekilde indüklenir. Bu teknik, PBMC'ler ve CBMC'ler gibi hücreler için basit ve etkili bir yeniden programlama protokolü önerir.

Sendai Virüs ve santrifüj kullanılarak Kan Hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücre Üretimi

Bu protokol, insan yetişkin periferik kan hücrelerinden entegrasyon gerektirmeyen iPSC'lerin verimli bir şekilde üretilmesi için ayrıntılı bir yöntemi açıklar. Yeniden programlama faktörlerini ifade etmek için dört oriP/EBNA bazlı epizomal vektörün kullanılmasıyla, KLF4, MYC, BCL-XL veya OCT4 ve SOX2, 1 mL periferik kandan binlerce iPSC kolonisi elde edilebilir.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Protokol, çevresel kan mononükleer hücrelerin yeniden programlanması ile sinirsel kök hücrelerini Sendai virüs enfeksiyonu, dopaminerjik nöronlar içine inscs farklılaşma, tek taraflı-lesioned içine da öncüleri transplantasyon teşvik sunar Parkinson hastalığı fare modelleri ve PD tedavisi için iNSC-türetilen DA öncüleri güvenlik ve etkinliğini değerlendirilmesi.

Periferik mononükleer hücrelerden Indüklenen nöral kök hücrelerin üretimi ve transplantasyon çalışmaları için Dopaminergic neuron precursors doğru farklılaşma

Keşfedin Sendai virüsü ile insan fibroblast hücrelerini transgen içermeyen iPSC'lere yeniden programlama yöntemini. Bu protokol, kök hücre biyolojisinde güvenli ve verimli bir teknik sunar.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

Daha fazla video keşfet