Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

Bu prosedürün genel amacı, Sendai virüsü ile insan kaynaklı pluripotent kök hücreler üretmektir. Bu, önce transdüksiyona tabi tutulacak fibroblast hücrelerinin hazırlanması ve kaplanması ile gerçekleştirilir. İşlemin bir sonraki adımı, hücreleri Sendai virüsü ile enfekte etmektir.

Daha sonra enfekte fibroblast hücreleri taze fare embriyonik fibroblast besleyici hücrelerine aktarılır. Son adım, yeniden programlananı manuel olarak seçmektir. Şimdi pluripotent kök hücreler, sonuçta fibroblast hücrelerinin trans genler kullanılmadan I PSC'lere yeniden programlanması, immüno-etiketleme ve R-T-P-C-R yoluyla gösterilebilir.

Bu tekniğin mevcut yönteme göre en büyük avantajı, transing bırakmadan ve uygun maliyetli bir şekilde yeniden programlama verimliliğini arttırmasıdır Bu protokol için DMEM'de kültürlenmiş hazır insan fibroblastlarına sahip olun. FBS ile bu hücreleri deney plakası için 24 kuyucuklu plakaya aktarın, hücre bağlanması için en iyi yoğunluğu belirlemek için hücreleri altı seri seyreltmede kullanın. 24 oyuklu plakanın her sırası, bir seyreltme hücre serisini barındırabilir.

Böylece, dört hücre tipi bir plaka üzerinde test edilebilir, seyreltmeyi 24 saat boyunca inkübe edebilir. Ertesi gün, transdüksiyon için üç birleşme seviyesinde kuyuları seçin. Biri %80 ila %90 gibi yüksek bir birleşme seviyesinde, biri yaklaşık %60 birleşmede ve üçüncüsü transdüksiyondan bir saat veya daha fazla önce yaklaşık %30 birleşmede.

Transdüksiyonun çözülmesi için ortamı 300 mikrolitre taze fibroblast ortamı ile değiştirin. Bir set Sendai virüsü tüpü birkaç saniye boyunca 37 santigrat derecede ve sonra bitirin. Onları oda sıcaklığında çözdürmek.

Çözülmüş virüsleri 6.000 G'de 10 saniye santrifüjleyin ve bir mikro santrifüj tüpünde buz üzerinde saklayın. Transdüksiyon yapılacak hücre sayısına göre hesaplanan virüslerin bir karışımını yapın. Hesaplama detayları metin protokolünde bulunabilir.

Nazik pipetleme ile virüsleri iyice karıştırın. Şimdi en yoğun hücrelere iki hacim virüs ekleyin. Orta yoğunluklu hücrelere bir hacim virüs ekleyin ve en az yoğun seleksiyona yarım hacim virüs ekleyin.

Plakayı döndürün ve reaksiyonun ertesi gün gerçekleşmesi için gece boyunca inkübe etmesine izin verin. Ortamı 500 mikrolitre taze fibroblast ortamı ile değiştirin. Bunu iki gün sonra, transdüksiyonlu hücreler üzerinde yapılan ikinci medya değişikliğinden üç gün sonra tekrar yapın.

Tabak başına %10 FBS plakası 500.000 hücre içeren DMEM ile 60 milimetrelik tabaklarda meth hücreleri hazırlayın ve gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, metamfetamin hücrelerindeki ortamı taze ortamla değiştirin ve ardından ko-kültürü kurmaya devam edin. İlk olarak, ortamı transdüksiyon fibroblastlarından çıkarın ve bunları DPBS ile bir kez yıkayın.

Daha sonra, beş dakika içinde dönüştürülen her bir hücre kuyusuna 200 mikrolitre% 0.25 tripsin EDTA ekleyin. Tüm ayırma hücrelerini tek bir 15 mililitrelik konik tüpte toplayın. Hücreleri dört dakika boyunca 1.350 G'de döndürün.

Daha sonra süpernatanı çıkarın ve trippin'i nötralize etmek için peletlenmiş hücreleri yaklaşık beş mililitre taze ortamla yıkayın. Şimdi hücreleri 1.350 G.Next plakada dört dakikalık bir dönüş ile toplayın. Hücrelerin çoğu metamfetamin içinde altı seri seyreltme olarak görülür.

Hücrelerin ölüm hızına bağlı olarak ilk ve son seyreltmelere ihtiyaç duyulmayabilir. RNA ekstraksiyonu için bazı hücreleri saklayın ve plakaları gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, ortamı 10 mikromolar RO kinaz inhibitörü Y 2 7 6 3 2 ile desteklenmiş insan ES ortamı ile değiştirin.

İlerleyen günlerde hücre sağkalımını iyileştirmek için, ortamı normal unsu takviyeli insan ES ortamına değiştirin. Bir haftalık kültürlemeden sonra, hücre kümeleri gibi ES kolonisi oluşumu için birkaç günde bir bulaşıkları kontrol etmeye başlayın. Göründüklerinde, büyümeyi izleyin.

Transdüksiyondan üç hafta sonra, ES hücre kümelerinin kolonileri genişlemeye hazır olmalıdır. Metamfetamin besleyici hücreleri, 60 milimetrelik plakalar için hazırlandıkları gibi 24 kuyulu plakalarda da hazırladınız. Herhangi bir koloni seçmeden önce, metamfetamin hücreleri üzerindeki ortamı 10 mikrolitre Y, 2, 7, 6, 3, 2 içeren ES ortamına değiştirin.

Bulaşıklardan her seferinde bir koloni seçin. Koloniyi, orada çözelti bulunan 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Pipetleyiciyi kullanarak koloniyi parçalayın.

Sonra bir beni koru. Parçalanmış koloni ile. Sonuç olarak, her kuyuya parçalanmış bir koloni yükleyin ve mümkün olduğunca çok kuyu yükleyin.

Hücreleri günlük ortam değişiklikleriyle koruyun ve bunları altı kuyucuklu plakaya ve ardından 60 milimetrelik kaplara genişletin. Tipik olarak, Sendai virüsü ile enfekte olan fibroblastlar, beş gün sonrasına kadar herhangi bir morfolojik değişiklik göstermezler. Daha sonra hücreler daha büyük bir çekirdeğe ve daha küçük sitoplazmaya sahip yuvarlak bir şekil alır.

Bu küçük ölçekli protokol, fibroblast yoğunluğu, virüs titresi ve mes'e kaplama yoğunluğu gibi optimize edilebilecek çeşitli parametreler içerir. Farklı renklerde gösterilen farklı eş akıcılıktaki hücrelerin transdüksiyonu da optimize edilebilir. Metamfetamin besleyici hücrelerle bir haftalık ko-kültürden sonra, kısmen yeniden programlanmış fibroblastlar gevşek bir şekle sahiptir ve tripsin kullanılarak toplanmak yerine kolayca toplanır.

Tamamen yeniden programlanmış I PSC'ler, kısmen yeniden programlanmış hücrelerden açıkça tanımlanabilir. Tamamen yeniden programlanmış hücreler sıkıca paketlenir ve koloniler net sınırlara sahip olabilir. Kısmen yeniden programlanmış hücreler, kolayca ayrılabilen gevşek kümeler oluşturur.

IPSC klonlarını birkaç hafta boyunca genişlettikten sonra, H dokuz hücrelerine kıyasla kök hücre belirteçleri için boyama garanti edilir. IPC'ler, pluripotent kalitelerini destekleyen SSEA dört, OCT dört, TRA 81 ve nano G dahil olmak üzere beklenen birkaç antikora pozitiftir. İnsan IPSC klonlarında R-T-P-C-R transgen ekspresyonu kullanılması not edilmedi.

Ekzojen OCT dört, SOX iki, klf dört ve Cmic için 10 primerden sonra, güçlü transgen ekspresyon seviyeleri gösteren pozitif kontrol örnekleri ile kullanıldı. Bu videoyu izledikten sonra, poli potent kök hücreleri indüklemek için somatik hücrelerin nasıl yeniden programlanacağını ve bunların nasıl seçileceğini, hücrelerin diğer hücrelerden nasıl tamamen yeniden programlanacağını iyi anlamış olmalısınız.