Name: Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Öğrenin, bireysel insan embriyonik kök hücrelerinde gen ekspresyonunu kantitatif RT-PCR ile profilleme yöntemini. Bu teknik, kök hücre popülasyonlarındaki heterojenlikleri analiz ederek rejeneratif tıp araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz el yazması değerli tartışmalar için Lee laboratuar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Lee laboratuarda çalışma Hücre Araştırma Fonu (Tedco) Kök New York Kök Hücre Vakfı Robertson Araştırmacı Ödülü ve Maryland hibe tarafından desteklenmiştir.

Bir 96-yuvalı plaka içinde 1. Hazırlanması <ol><li> 9 ul Tek Hücre Çözme Çözüm Tek Hücre DNase1 1 ul karıştırın. </li><li> 96 çukurlu PCR plakanın her çukuruna 10 ul karıştırılmış çözeltisi koyun. </li></ol> FACS Arıtma 2. Ayrılmakta HESC <ol><li> Insan ES ortam ile nötralize edildi, 37 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1 ml Accutase ile 60 mm tabak, ikinci Oct4 :: EGFP ES hücre hattı çıkarın. </li><li> FACS tampon 1 ml hücre popülasyonu hazırlayın ve 1 x 10 6 hücre / ml hücre ayarlayın. </li><li> Bir 35 um hücre filtresi kapak tüp aracılığıyla hücre örneği geçirin. </li><li> Hücre sıralama önce buz içinde tüpü saklayın. </li></ol> 96 oyuklu plakanın her bir FACS-arıtıldı Tek Hücre 3. Lysis <ol><li> Eğitimli bir operatör ile bir hücre sıralayıcı EGFP pozitif hücreler için örnek sıralayın. 96 oyuklu bir plaka içerisinde PCR tek hücre Lysis/DNase1 çözeltisi içine tek bir hücre koyun. Gerekirse, 9Örnek 6 oyuklu plaka bir aydan daha kısa bir -80 ° C derin dondurucuda saklanabilir. </li><li> Hücre lizizi, oda sıcaklığında numuneleri 5 dakika inkübe edin. </li><li> Parçalama reaksiyonu durdurmak için Stop Çözüm 1 ul ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin. </li></ol> 4. Ters Transkripsiyon <ol><li> 20 uM SMA-T15, SMA-A, her bir kısım için 0.5 ul ekle. </li><li> Her bir oyuğa 4 ul 5X tampon maddesi, 2 ul DTT, 1 ul ters transkriptaz ve 1 ul dNTP ekleyin. </li><li> , Bir termal döngü içinde, ters transkripsiyon yapın. <ol><li> 90 dakika × 42 ° C &#39;de termal programı ayarlamak ve 85 ° C x 5 dak ters transkriptaz etkisiz hale getirirler. </li></ol></li></ol> 5. Amplifikasyon <ol><li> Her ters transkripsiyonu örnek ExoSAP-IT reaktif 4 ul ekleyin. <ol><li> ExoSAP-IT reaktif inaktive edilmesi, 15 dakika, 15 dakika ve 80 ° C&#39;de, 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> PCR reaksiyon karışımı w hazırlayınith SMA-p2 (2 nM) </li><li> Her bir ters transkripsiyonu örnek PCR reaksiyon karışımı 10 ul ekle. </li><li> Denatürasyon 20 döngü (30 saniye için 94 ° C), tavlama (30 saniye boyunca 57 ° C) ve uzatma (68 ° C 10 dakika süre ile) &#39;dan oluşan, amplifikasyon yapın. </li></ol> 6. Mah-PCR Performans <ol><li> Her bir oyuğa 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 ul büyütülmüş cDNA, 2 nM primerler ve 7 ul su içinde 10 ul ekle. <ol><li> 3 saniye boyunca 95 ° C&#39;de, ardından bir program ayarlama, 30 saniye x 40 döngü için 60 ° C. </li></ol></li><li> Teknik hatalar için çift olarak gerçekleştirin. </li></ol>

<ol><li>Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+ground-state+pluripotency+by+allelic+regulation+of+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog.</a> Nature. 483, 470-473 (2012).</li>
<li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+germ+cells+from+mice+and+rats+exhibit+properties+consistent+with+a+generic+pluripotent+ground+state%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state.</a> Development. 137, 2279-2287 (2010).</li>
<li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).</li>
<li>Stewart, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+isolation+of+hESCs+reveals+heterogeneity+within+the+pluripotent+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment.</a> Nat Methods. 3, 807-815 (2006).</li>
<li>O'Malley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+with+novel+cell-surface+markers+identifies+routes+to+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells.</a> Nature. 499, 88-91 (2013).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+primed+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li>
<li>Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+neural+crest+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).</li>
<li>Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+template+switching%3A+A+SMART+%28TM%29+approach+for+full-length+cDNA+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction.</a> Biotechniques. 30, 892-897 (2001).</li>
<li>Pan, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+full-length+RNA+sequencing+for+low+quantities+of+cells+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).</li>
<li>Tang, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Tek hücre gen profilleme tek bir hücrenin işlevini veya tüm nüfusu tahmin etmek için önemli bir araç olabilir. Nedeniyle teknik sınırlaması, bütün gen profili analizi nüfus ortalamasına sınırlı olmuştur. Gen ekspresyonu ve tek tek hücreler ile alt grupları arasında seviyelerindeki varyasyonlar yanlış yorumlanmasına yol açtığı önerilmiştir. Gibi çeşitli hücresel yönleri HESC bulunabilir ve bunların heterojenite pluripotensini ve kader şartname sürecini korumak için kurnazca farklı yeteneği neden olur. <p class="jove_...

En yüksek ökaryot nüfus toplanmış nüfus analizi dolayısıyla heterojen, onların hücresel özelliklerini yorumlamak zordur. Bir nüfus içinde, tek tek hücrelerin kurnazca farklı olabilir, ve bu farklılıklar tüm nüfusu 1, 2 özelliği ve fonksiyonu için önemli sonuçlar doğurabilir. Özellikle, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) hassas bir şekilde ayırt edici 3, 4 içinde soy spesifikasyonuna pluripotensin farklı düzeylerde ve çeşitli potansiyelleri neden olan, heterojen olduğu bilinmektedir. Örneğin, farklı hücre yüzeyi antijenleri farklılaşmamış pluripotent kök hücreleri sınıflandırmak için kullanılabilir, 5 ve Austin Smith grup, morfoloji, farklılaşma yolu eğilimi ve 6 sinyal bağımlı bir göre, fare embriyonik kök hücreleri pluripotensin farklı düzeylerde önerdi. Bu olgu insan embriyosunda hipotezinic kök hücreler 7. Genel çalışmalar, farklı kök hücre hatları, bireysel değil tek bir kök hücreler arasında tülürken, potansiyel tüm somatik hücre soylarının doğru onların farklılaşma kapasitelerini etkileyen tek hücre düzeyinde pluripotensin farklı düzeylerde analiz etmek çok ilginç olabilir. Hücresel ve moleküler heterojenite &#39;tek hücreli transcriptome&#39; denir, transkripsiyon profilleme tarafından dikte ve gen ekspresyon düzeyleri 8-10 ölçülmesi için yeni yaklaşımlar vurguluyor olabilir. Tek tek hücrelerin gen ekspresyonu seviyesini ölçmek için, tek bir hücre nicel RT-PCR, basit, ancak güçlü bir protokol geliştirilmiştir. Bu asgari teknik varyasyonlar ve farklar ile sonuçlanan, her bir hücre lizatlarının yarısı gibi hESC seri olarak seyreltildi, toplam RNA karşılaştırarak eden protokol etkinliğini ve uygulanabilirliğini doğruladı. Ayrıca, biz homojen p izole etmek için genetik bir muhabir hattı kullanılırGen hedefleme sistemi kullanılarak hESC opulation. Oct4 lokusunu (Oct4-2A-EGFP-PGK-Puro yapı) ve TALEN plasmidlerin bir çift hedeflenmesi için verici vektör 11 kullanılmıştır. Donör vektör ve TALEN plasmitler bir çift bizim nucleofection ve klonal seleksiyon protokol ve HESC bizim rutin protokolüne 12 dayanılarak yapılmıştır bakım kullanılarak hESC (H9, WA09) girmiştir. Biz bu genetik muhabir hat Oct4 içinde Oct4 ifade EGFP ifade :: EGFP hESC doğruladı. Bizim sonuç (Oct4 olanlar :: EGFP kuvvetli pozitif hücreler) bireysel HESC Oct4 ifade yüksek düzeyde, ama Nanog ifade farklı düzeylerde sahip olduğunu göstermektedir. Yani, bizim tek bir hücre gen ekspresyon tahlil pluripotent kök hücrelerin nüfus heterojenliklerin incelemek yararlı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>96 kuyulu PCR Plakası</td><td>ABD bilimsel</td><td>1402-8900</td><td></td></tr><tr><td>Ambion Hücre Lizis Kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>4458235</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe Ters Transkriptaz</td><td>Clonetech</td><td>639536</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>USB</td><td>78200</td><td></td></tr><tr><td>Platin Taq DNA polimeraz Yüksek Sadakat</td><td>Invitrogen</td><td>11304</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Karışımı, PCR Sınıfı</td><td>Invitrogen</td><td>18427</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Evrensel 2X Master Mix</td><td>Kapa biyosistemi</td><td>KR0389</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Yenilikçi Hücre Teknolojisi</td><td>S-1100-1</td><td></td></tr><tr><td>FACS tamponu</td><td></td><td></td><td>45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 & mu; l DNase, filtre sterilize edilmiş</td></tr><tr><td>35 & mu; m hücre süzgeç kapağı tüpleri</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

kantitatif rt-pcr ile bireysel İnsan embriyonik kök hücreleri profilleme

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Kök hücre nüfusun heterojenliği gibi farklı soy doğru onların farklılaşma eğilimi gibi, kök hücre biyolojisi ayrıntılı bir anlayış engellemektedir. Tek bir hücre transcriptome tahlil bireysel farklılık diseksiyon için yeni bir yaklaşım olabilir. Biz tek hücre Mah-PCR yöntemi geliştirdi ve bu yöntem, birkaç gen ekspresyon profilleri iyi çalıştığını doğruladı. Tek hücre düzeyinde, Oct4 olanlar her insan embriyonik kök hücre, :: EGFP pozitif hücreler, Oct4 yüksek ifade, ama Nanog bir ifade farklı bir düzeye sahiptir. Bizim tek bir hücre gen ekspresyon tahlil nüfus heterojenliklerin sorgulamak için yararlıdır olmalıdır.

Verimli ve güvenilir bir hücre RNA amplifikasyonu HESC arasında kopyalanma değişimini en aza indirmek için, kullanılan :: Oct4 FACS arıtma için EGFP HESC klonu. 96 oyuklu bir plaka içerisine Oct4 :: EGFP pozitif hücreler sıralama sonra, her bir hücre parçalama tamponu içinde lize edildi ve SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) primeri kullanılarak ve SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ile sabitleme tam uzunlukta cDNA&#39;ya poli (A) + RNA dönüştürülmüş ) SMAR...

Tek hücre gen sentezleme tahlili kök hücre heterojeniteler anlamak için gereklidir.

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Bu prosedürün genel amacı, tek hücreli kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu veya R-T-P-C-R kullanarak bireysel insan embriyonik kök hücrelerinin gen ekspresyon seviyelerini profillemektir. Bu işlem, öncelikle floresan aktive edilmiş hücre ayıklama yöntemiyle bireysel hücrelerin, hücre lizis tamponu içeren 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna ayıklanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, tek hücre lizatlarından cDNA üretmek için RNA'nın ters transkripsiyonudur.Ardından, cDNA polimeraz zincir reaksiyonu ile amplifiye edilir. Son adım, amplifiye edilen cDNA üzerinde kantitatif R-T-P-C-R gerçekleştirmektir. Nihayetinde bu analiz, insan embriyonik kök hücreleri gibi heterojen popülasyonlarda gen ekspresyonunu incelemek için kullanışlıdır.Bu tekniğin mevcut tek hücreli kantitatif yapay damarlara göre temel avantajı, bu yöntemin EEG'den daha sağlam olması ve fax saflaştırmasından önce uygulanmasıdır. OCT dört EGFP insan embriyonik kök hücreleri veya Hess, 60 milimetrelik kapta ayrıştırılır. Tüm besiyeri uzaklaştırılır, 1 mL Accutane eklenir ve 37 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edilir.Accutane'ı bir mililitre insan ES medyumu ile nötralize edin; süpernatantı attıktan sonra hücreleri peletlemek için santrifüjleyin, ardından hücreleri FACS tamponunda yeniden süspande edin ve konsantrasyonu 1 × 10⁶ hücre/ml olacak şekilde ayarlayın. Sonrasında, hücre örneğini 35 µm'lik bir hücre süzgeci kaplı tüpten geçirin. Hücre ayırma işleminden önce tüpü buz üzerinde saklayın.Bu prosedüre, 1 µL single cell D Ns 1 ve 9 µL tek hücre lizis çözeltisi içeren bir master mix hazırlayarak başlayın. FAXS analizi için, hazırlanan karışım çözeltisinden 10 µL'lik porsiyonları 96 kuyucuklu bir PCR plakasının her bir kuyucuğuna aktarın. Hücre ayırıcıyı, tekli EGFP pozitif hücreleri 96 kuyucuklu PCR plakasının kuyucuklarına ayıracak şekilde programlayın. Hücre ayırma işleminden sonra, hücre lizisi için örnekleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Lizis reaksiyonunu durdurmak için 1 µL stop çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin.Bu prosedüre başlamak için öncelikle 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 0,5 µL 20 µM SMAT 15 ve SMAA primerleri ekleyin. Numuneleri 80 °C'de beş dakika boyunca ısıtın. Ardından dört µL 5x tampon, iki µL DTT, bir µL ters transkriptaz ve bir µL dNTP ekleyin.Her bir kuyucukta, bir termal döngüleyici kullanarak ters transkripsiyon işlemini gerçekleştirin. Termal programı 90 dakika boyunca 42 °C, ardından beş dakika boyunca 85 °C olacak şekilde ayarlayın. Ters transkripsiyon tamamlandığında ters transkriptazı inaktive etmek için her bir CDNA örneğine dört µL exo reaktifi ekleyin; fazla oligonükleotidleri sindirmek için 15 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin, ardından 15 dakika boyunca 80 °C'de bekletin.Exo reaktifini inaktive etmek için, iki nanomolar SMAP iki primeri ile PCR reaksiyon karışımını hazırlayın. Her bir ters transkriptaz işlemi görmüş örneğe 10 mikrolitre PCR reaksiyon karışımı ekleyin.Denatürasyon, bağlanma ve uzama aşamalarından oluşan 20 döngülük amplifikasyonu gerçekleştirin. Örneklerin amplifikasyonu tamamlandıktan sonra, R-T-P-C-R sonuçlarını doğrulamak amacıyla ayrı plaklarda iki set kantitatif R-T-P-C-R reaksiyonu yürütün. Her iki 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 10 µL 2x SYBR Green PCR master mix, 1 µL amplifiye cDNA, iki primer ve 7 µL su ekleyin. Programı 95 °C'de 3 saniye ve ardından 60 °C'de 30 saniye olacak şekilde ayarlayın.Primer hatasını azaltmak için 40 döngü boyunca bir annealing basamağı kaldırılmıştır. Bu çalışmadaki annealing işleminde, teknik değişkenliği değerlendirmek ve düşük miktarlardaki toplam RNA üzerindeki farkların tespitini sağlamak amacıyla Hess toplam RNA'sının mikrogram miktarları nano ve pikogram seviyelerine kadar seyreltilmiştir. G-A-P-D-H geninin kantitatif R-T-P-C-R analizi, 10 nanograms per microliter'dan 0.1 picograms per microliter'a kadar seri seyreltilmiş havuzlanmış husks MR.NA kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Her bir nokta, seri seyreltilmiş mRNA'nın ve FACS ile ayrıştırılmış tek hücre mRNA'sının CT değerini göstermektedir.Her bir örnek ile QR TPCR sonuçları arasında bir korelasyon gözlemlenmiş ve birkaç tek hücre benzer CT değerleri göstermiştir. Bir OCT dört EGFP reporter HESC hattından güçlü EEG FP pozitif hücreleri ayıklamak ve seçmek için Fax kullanılmıştır. Sonuçlar, ters transkripsiyon ve amplifikasyon reaksiyonlarının farklı partileri arasındaki tutarlılığı doğrulamak amacıyla, negatif popülasyona kıyasla yaklaşık %60'lık bir EGFP pozitif popülasyon göstermektedir.Fax ile saflaştırılmış tek hücre lizatları ikiye ayrılmış ve grup karşılaştırmaları için her bir yarıya protokol uygulanmıştır. Tek hücre lizatlarının her bir yarısının OCT four CT değerleri arasında anlamlı bir korelasyon gözlemlenmiştir. Tek bir hücrenin gen ekspresyonunun ısı haritası sunumu, OCT four ekspresyonunun tutarlı ve güçlü bir düzeyde olduğunu, ancak bir diğer kök hücre belirteç geni olan NAN og düzeylerinin değişkenlik gösterdiğini ortaya koymaktadır; sonuç olarak elde ettiğimiz veriler, bu tek hücre gen ekspresyon analizinin pluripotent kök hücrelerin popülasyon heterojenliklerini incelemek için yararlı olduğunu kanıtlamaktadır.Bu videoyu izledikten sonra, tek hücre transkriptomu için QITP'nin nasıl uygun şekilde uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

profiling-individual-human-embryonic-stem-cells-by-quantitative-rt-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tek hücreli ifade profil, tek tek hücrelerin ayrıntılı gen ekspresyon analizi sağlar. Biz kardiyomiyositlerde izolasyonu için yöntemler tanımlamak ve belirli hedeflere bütün transcriptome mikroarray veya qPCR için lizatları hazırlanıyor.

Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde Tek Hücre transkripsiyonel Profilleme

Tek retina hücreleri ve bunların cDNAlann sonraki amplifikasyon izolasyonu için bir yöntem tarif edilmiştir. Tek hücreli transkriptomik bir dokusunda hücresel heterojenite mevcut derecesini ortaya koymaktadır ve nadir hücre popülasyonu için yeni belirteç genlerin ortaya çıkarır. Beraberindeki protokol birçok farklı hücre tiplerine uyacak şekilde ayarlanabilir.

Gelişen ve Olgun Retina Nöronlar Tek hücreli Profilleme

Beyin tümörü başlatan hücreler (BTICs), heterojen bir tümör sahip kök hücre özellikleri içinde nadir hücrelerinin tanımlanması insan beyin tümörü patogenezinde sağlayan yeni anlayışlar içine. Biz BTICs için zenginleştirmek özgü kültür koşullarının rafine var ve biz rutin daha bu popülasyonların zenginleştirmek için flow sitometri kullanın. Tek hücre RT-PCR ile kendini yenileme analizleri ve transkript analiz sonra bu izole hücreler üzerinde de yapılabilir.

Sıralama Kök Hücre Tahliller ve Akış Primer Beyin Tümörü Doku İşleme

Muhabir hücre çizgileri, görselleştirmek etiket ve heterojen popülasyonlar ilgi hücreleri izole etmek için bir araç sunmaktadır. Bununla birlikte, hedef gen, insan embriyonik kök hücreleri alışılmış homolog rekombinasyon kullanılarak son derece verimsizdir. Bu yazıda, çinko-parmak nukleaz gelişmiş homolog rekombinasyon kullanarak EGFP ile CNS Ortabeyin özel transkripsiyon faktörü PITX3 odağı hedefleme açıklar.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Hedefleme Çinko parmak Nükleazlar Geliştirilmiş Gen

Farklılaşmış insan nöral kök hücreleri (hNSC'ler) üzerindeki miRNA'lardaki değişiklikleri karakterize etmek amacıyla, üç boyutlu bir sistemde hNSC farklılaşmasını, miRNA PCR dizisi ile mikroRNA ekspresyonundaki değişikliklerin değerlendirilmesini ve miRNA hedef tahmini için hesaplamalı analizi ve ikili lusiferaz testi ile doğrulanmasını açıklıyoruz.

Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Bu protokol, ek eksojen takviye veya hPSC'ye özgü sentetik substrat olmaksızın jelatin kaplı bir tabakta yalnızca insan plasentasından türetilen şartlandırılmış ortamı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerini (hPSC'ler) çoğaltmak için basit ve etkili bir yol sağlar.

A Novel Kültür Modeli İnsan Pluripotent için Plasenta klimalı Medyada Jelatin üzerinde hücre çoğalma Kök

Bu protokol, serumdan türetilmiş fare embriyonik kök hücrelerin içinde (Mesc) -conditioned ortamı (Mesc-CM) için bir yöntem sağlar (fetal inek serumu, FBS) - ve besleyici (fare embriyonik fibroblastlar, MEF'ler) bir hücrenin içermeyen koşullar -ücretsiz yaklaşım. Bu yaşlanma ve yaşlanma ile ilişkili hastalıkların tedavisi için uygun olabilir.

Serum- toplanması ve Besleyici serbest Fare Embriyonik Hücre içermeyen Yaklaşım Hücre klimalı Orta Kök

Tek memeli hücrelerini sıralamak ve her hücrede ilgilenilen 96'ya kadar hedef genin ekspresyonunu ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, mutlak transkript sayılarının tahminini sağlamak için dahili qPCR standartlarının kullanılmasını içerir.

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Toplu gen ifade ölçümleri bulut tek hücre farkları türdeş olmayan hücre popülasyonlarının. Burada, bir protokol açıklamak nasıl tek hücreli gen ifade analizi ve dizin için Variety aktif hücre sıralama (FACS tarafından) sıralama heterojenite betimlemek için birleştirilebilir ve immunophenotypically karakterize tatlı ayrı hücre popülasyonlarının.

Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen

Burada fare embriyonik dokularında gen ekspresyonunu profillemek için çok katlı tek hücreli mRNA dizileme yöntemi ni sunduk. Damlacık tabanlı tek hücreli mRNA dizileme (scRNA-Seq) yöntem çoklama stratejileri ile birlikte aynı anda birden fazla örnekten tek hücre profili olabilir, hangi önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve deneysel toplu etkileri en aza indirir.

Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

Mevcut protokol, 2i ve LIF ortamı ile kültür sırasında fare embriyonik kök hücrelerinin ters poli-transfeksiyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yöntem, geleneksel ileri transfeksiyon protokollerinden daha yüksek canlılık ve verimlilik sağlarken, aynı zamanda plazmit oranlarının tek kap optimizasyonunu da sağlar.

Nükleik Asit Oranlarının Hızlı Araştırılması için Optimize Edilmiş Bir Fare Embriyonik Kök Hücre Tabanlı Ters Poli-Transfeksiyon Tekniği

Öğrenin, bireysel insan embriyonik kök hücrelerinde gen ekspresyonunu kantitatif RT-PCR ile profilleme yöntemini. Bu teknik, kök hücre popülasyonlarındaki heterojenlikleri analiz ederek rejeneratif tıp araştırmalarına katkı sağlar.

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Daha fazla video keşfet