Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Bu prosedürün genel amacı, tek hücreli kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu veya R-T-P-C-R kullanarak bireysel insan embriyonik kök hücrelerinin gen ekspresyon seviyelerinin profilini çıkarmaktır. Bu, ilk olarak, hücre lizis tamponu içeren 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna tek tek hücreleri sıralamak için floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması kullanılarak gerçekleştirilir. İkinci adım, tek hücreli lizatlardan CDNA oluşturmak için RNA'yı ters çevirmektir.

Daha sonra, CDNA polimeraz zincir reaksiyonu ile amplifiye edilir. Son adım, amplifiye edilmiş CDNA üzerinde kantitatif RTPCR gerçekleştirmektir. Sonuç olarak, bu tahlil, insan embriyonik kök hücreleri gibi heterojen popülasyonlarda gen ekspresyonunu incelemek için yararlıdır.

Bu tekniğin mevcut tek hücreli kantitatif yapay damarlara göre en büyük avantajı, bu yöntemin, EEG ve daha sağlam faks saflaştırmasından önce olmasıdır. OCT dört EGFP insan embriyonik kök hücresi veya Hess, 60 milimetrelik çanaktan ayrılır. Tüm ortamı çıkarın, bir mililitre Accutane ekleyin ve 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Accutane'ı bir mililitre insan ES ortam santrifüjü ile nötralize edin, süpernatan hücreleri attıktan sonra hücreleri pelet haline getirin, faks tamponunda hücreleri yeniden süspanse edin ve konsantrasyonu mililitre başına altı hücreye bir kez 10 kez ayarlayın. Ardından, hücre örneğini 35 mikrometrelik bir hücre süzgeci kapağı tüpünden geçirin. Hücre sıralamasından önce tüpü buz üzerinde saklayın.

Bu prosedüre, bir mikrolitre tek hücreli D N, bir ve dokuz mikrolitre tek hücreli lizis çözeltisi içeren bir ana karışım hazırlayarak başlayın. Her biri için, faks analiz programı için 96 kuyulu bir PCR plakasının her bir oyuğuna 10 mikrolitre karışım çözeltisi aktarın, hücre sıralayıcı, hücre sıralamasından sonra tek EGFP pozitif hücreleri 96 kuyulu PCR plakasının kuyucuklarına sıralamak için hücre sıralayıcı, hücre lizisi için numuneleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Lizis reaksiyonunu durdurmak için, bir mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin.

Bu işleme başlamak için, önce 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 20 mikromolar SMAT 15 ve SMAA primerlerinden oluşan 0.5 mikrolitrelik bir Eloqua ekleyin. Numuneleri 80 santigrat derecede beş dakika ısıtın. Daha sonra dört mikrolitre beş x tampon, iki mikrolitre DTT, bir mikrolitre ters transkriptaz ve bir mikrolitre D ve tps ekleyin.

Her kuyuya bir termal döngüleyicide ters transkripsiyon yapın. Termal programı 90 dakika boyunca 42 santigrat dereceye, ardından beş dakika boyunca 85 santigrat dereceye ayarlayın. Ters transkripsiyon tamamlandığında ters transkriptazı etkisiz hale getirmek için, fazla oligonükleotid kaymalarını sindirmek için her CDNA numunesine dört mikrolitre ekzo reaktifi ekleyin, 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin, ardından 15 dakika boyunca 80 santigrat derece inkübe edin.

Ekzo reaktifini inaktive etmek için, PCR reaksiyon karışımını SMAP iki primerin iki nano molar kısmı ile hazırlayın. 10 mikrolitre PCR reaksiyon karışımı ekleyin. Her ters transkripsiyonlu örneğe.

20 döngü denatürasyondan oluşan amplifikasyonu gerçekleştirin, numunelerin amplifikasyonundan sonra diz çökme ve uzatma gerçekleştirdi, R-T-P-C-R sonuçlarını doğrulamak için ayrı plakalarda iki set kantitatif R-T-P-C-R reaksiyonu gerçekleştirdi 2 96 kuyucuklu plakanın her birine 10 mikrolitre iki x siber yeşil ekleyin. PCR master, bir mikrolitre güçlendirilmiş CDNA, iki primer ve yedi mikrolitre su karışımı. Programı üç saniye boyunca 95 santigrat dereceye ve ardından 30 saniye boyunca 60 santigrat dereceye ayarlayın.

40 döngü boyunca, astar hatasını azaltmak için diz çökme basamağı kaldırılır. Bu çalışmada, Hess'in toplam RNA'sının mikrogram miktarları, teknik değişkenliği değerlendirmek için nano ve pikogram seviyelerine kadar seyreltildi ve G-A-P-D-H geninin düşük toplam RNA miktarlarındaki farkın tespiti kantitatif R-T-P-C-R MR kullanılarak gerçekleştirildi. Mikrolitre başına 10 nanogramdan mikrolitre başına 0.1 pikograma seri olarak seyreltilmiş havuzlanmış kabukların NA'sı. Her nokta, seri olarak seyreltilmiş mRNA'nın ve faksla sıralanmış tek hücreli mRNA'nın CT değerini gösterir.

Her örnek ile QR TPCR sonuçları arasında, benzer BT değerleri gösteren birkaç tek hücre ile bir korelasyon gözlendi. Faks, bir OCT dört EGFP raportörü HESC hattından güçlü EEG FP pozitif hücreleri sıralamak ve seçmek için kullanıldı. Sonuçlar, farklı ters transkripsiyon ve amplifikasyon reaksiyonları grupları arasındaki tutarlılığı doğrulamak için negatif popülasyona kıyasla yaklaşık% 60'lık bir EGFP pozitif popülasyonu göstermektedir.

Faksla saflaştırılmış tek hücreli lizatlar yarıya bölündü ve toplu karşılaştırmalar için her iki yarıya da protokol uygulandı. Tek hücreli lizatların her yarısının OCT dört BT değeri arasında anlamlı bir korelasyon gözlendi. Tek kabuklu gen ekspresyonunun bir ısı haritası sunumu, tutarlı ve sağlam bir OCT dört ekspresyonu seviyesini gösterir, ancak başka bir kök hücre işaretleyici geninin değişen seviyeleri, NAN og birlikte alındığında, sonuçlarımız, bu tek hücreli gen ekspresyonu testinin, pluripotent kök hücrelerin popülasyon heterojenliklerini incelemek için yararlı olduğunu göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, tek hücreli transkriptom için QITP'yi düzgün bir şekilde nasıl gerçekleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.