Name: İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Öğrenin insan nötrofillerinin akış odası yapışma deneyiyle kesme gerilmesi altında yapışmasını ölçme yöntemini. Bu teknik, otoimmün hastalıklarda yapışma moleküllerinin işlevsel rollerini araştırmak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Lupus Araştırma Enstitüsü (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 ve NIH UL1-TR00165 tarafından desteklenmektedir. Biz onun sürekli destek için Dr Robert P. Kimberly teşekkür ederim.

Bu çalışma için alınan tüm donörler yazılı bilgilendirilmiş onam verdi ve çalışma Birmingham Kurumsal Değerlendirme Kurulu Alabama Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1.. HUVEC İlk Kültür ve alt kültür <ol><li> Endotel hücre bazal ortamda oluşan tam bir büyüme ortamı içinde in vitro kültür insan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC), endotel hücre büyüme faktörleri ile takviye edilmiş (Malzemelerin listesine bakınız). Not: Bu çalışmada kullanılan büyüme faktörleri şunları içerir: 5 ng / ml insan rekombinan epidermal büyüme faktörü (hEGF), 1.0 mg / ml hidrokortizon, 50 mg / ml gentamisin ve 50 ng / ml amfoterisin B (GA-1000), 2 % Fetal Bovine Serum (FBS), 0.5 ng / ml Vasküler Endotel Büyüme Faktörü (VEGF), 10 ng / ml insan Fibroblast Büyüme heparin (hFGF-B) ile faktör-Basic, 20 ng / ml insan rekombinan insülin-benzeri büyüme faktörü ( R3-IGF-1) / ml askorbik asit 1 ug ve 22.5 ug / ml heparin. Tam ortam37 ° C de ilk olarak hazırlanır ve daha sonra hazırlama 1 ay içinde kullanım için 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Hücreler için bir şişe hazırlamak için, tam büyüme ortamı, 75 cm doku kültür şişesi 2 (1 ml / 5 cm2) ve daha sonra şişe, bir nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C /% 5 CO2 dengelenmeye bırakılır ilave edilir en az 30 dak. İnsan HUVEC / cm 2 2,500-5,000 hücre yoğunluğunda bu dengeye kültür şişesi doğrudan ekildi olacaktır. </li><li> Ortam dengeye olsa da, hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu içinde stok HUVEC cryovial eritin. Vorteks orjinal depolama şişede hücreleri dağıtılır ve daha sonra / cm 2 2,500-5,000 bir hücre yoğunluğu elde etmek için ön-dengelenmiş HUVEC tam büyüme ortamını içeren kültür şişesi doğrudan ekleyin. Yavaşça hücreler eşit olarak, dağıtılması ve daha sonra inkübatör şişeyi geri dönmek için şişeyi sallayın. Bu hücreler artık 1 st geçişini temsil eder. </li> &lt;Hücreler% 70-80 konfluent kadar li&gt; ortam her iki günde bir değiştirilmelidir. </li><li> HUVECler artık tripsin / EDTA ile kültür şişelerinde hasat edilebilir. Kültür ortamı, hücrelerden herhangi bir artık protein ve kalsiyum çıkarmak için PBS ile durulanır ve ardından kültür şişelerinden aspire edilir. A% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ilave edilir ve ışık mikroskopisi ile değerlendirilen 2-6 dakika hücresi ayrılmasıdır içinde belirgin olmalıdır. </li><li> Hücrelerin% 90&#39;ı plaka kapalı yuvarlanır olduğunda, 2x tripsin inhibitörü eşit hacmi eklenerek trypsinization durdurun. Hücrelerin hasat kolaylaştırmak için, tam büyüme ortamında bir diğer eşit miktarda ekleyin. Steril bir 15 ml santrifüj tüpüne müstakil hücreleri aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 225 x g de müstakil hücreleri santrifüjleyin. Süpernatanı havalandırın, ve daha sonra tam büyüme ortamı içinde 2-3 ml hücreleri tekrar süspansiyon. , Bir hemasitometre ve tripan mavisi kullanarak hücre konsantrasyonuna ve canlılığı belirler. </li><li> Th kullanmak içine çalışma için hücreler, yeniden tohum ek olarak 75 cm / cm 2 10,000 hücre yoğunluğunda hücreler hasat edilmiş ve 2 şişe 2,2 adıma geçin. Alternatif olarak, hücreler gelecek çalışmalar için bu noktada dondurulabilir. Hücre dondurma için, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 225 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. Süpernatan aspire ve 1 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda,% 10 DMSO içeren FBS hücre pelletini. Hücre süspansiyonu daha sonra bir hücre dondurma kap içindeki hücrelerin dondurma sonra cryovials aktarılır ve -80 ° C&#39;de saklanır. </li></ol> 2.. HUVEC Katman Hazırlık <ol><li> Dondurulmuş 2. pasaj HUVEC&#39;lerin Kullanımı: canlanma ve kültür. Aktif büyüyen hücreleri kullanıyorsanız, 2.2 adıma geçin. <ol><li> Bir 37 ° C su banyosu içinde hızla aşama 1.8 &#39;den 2 nci geçiş HUVECler içeren dondurarak saklama viali çözülme. 15 ml steril santrifüj tüpüne dondurarak saklamaya uygun vialler hücreleri aktarın ve 10 mi büyüme medi eklemekum. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de hücreleri santrifüj ve kalıntı DMSO&#39;yu çıkarmak için süpernatan aspire. </li><li> Tam büyüme ortamı ile hücre pelletini ve bir 75 cm 2 şişeye hücreleri aktarın. Toplam hacim, yaklaşık 20-25 ml büyüme ortamı ilave edin ve 37 ° C /% 5 CO2 ile inkübe edilir. </li></ol></li><li> Görsel olarak ortam değişiklikleri her iki günde bir ile her gün birleştiği için hücre kültürü inceleyin. Genellikle 2-4 gün içinde, hücreler akış odası deneyinde kullanıma hazır olacak hangi zaman% 80-90 ulaşacak. </li><li> Akış odasının kullanılacak bir kültür tabağı hazırlamak için (bkz. Bölüm 5) için 10 ug / ml fibronektinin 1 ml ve% 0.05 bir 35 mm doku kültürü çanağı ve pipet (w / v) jelatin birkaç kez eklemek Emin bütün plaka yüzeyi kaplanır. Matris protein oluşumunu optimize etmek için en az 30 dakika boyunca plaka kuru aşırı fibronektin ve jelatin çözeltisi ve hava çıkarın. Fibronectin ve jelatin çözüm 10x&#39;e kadar tekrar edilebilir. </li><li> 1,5-1,7 adımları tarif edildiği gibi tripsin-EDTA kullanılarak aşama 2.2 &#39;den HUVEC hücreleri hasat. Her bir kaplanmış doku kültür kabına 500,000 hücreleri tohum. Her bir tabağın içinde 2 ml büyüme ortamı ilave edin ve 37 ° C /% 5 CO2 ile inkübe edilir. </li><li> Hücreler adım 2.2 olarak çoğalmak üzere büyümeye olanak sağlar. Hücreler görsel ortam değişiklikleri her iki günde bir günlük muayene edilmelidir. Önceki akış odası deneyine, yapışma molekülü ekspresyonunu ve teşvik etmek için 4-6 saat boyunca 20 ng / ml insan TNF-α ile HUVEC ana. </li></ol> 3.. Saf Ligand Kaplama <ol><li> Bir 35 mm doku kültürü çanağı merkezinde bir işaretleyici ya da kalem ile 0.5 cm çapında bir daire çizin. </li><li> Işaretli alandaki 20 ug / ml protein A Levha 20 ul. Protein 0.5 cm çaplı bir daire içinde tüm alanı kapsayacak şekilde bir çözeltisi yaymak için pipet kullanın. Bu d yüzeyine dokunmayın veya çizmeyin önemlidirish. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 1 ml PBS (pH 8.0) ile protein-kaplanmış bir tabak 3 kez yıkayın. </li><li> Spesifik olmayan plaka üzerine bağlanmasını bloke etme işaretli alanda plaka 50 ul% 1 BSA. 4 ° C&#39;de 2 saat boyunca inkübe </li><li> Adım 3.3 &#39;de olduğu gibi 1 ml PBS ile bloke plaka 3 kez yıkayın. </li><li> Kaplama için Fc-reseptör ligand yapışma kimerik protein solüsyonları hazırlayın. Bu deneyde, 25 ug / ml &#39;de bir ICAM-1/Fc kimera çözeltisi ve PBS içinde 0.5 ug / ml&#39; de bir P-Selectin/Fc kimera (pH 8.0) kullanıldı. </li><li> Coat alt-tabakanın 50 ul ile işaretli alanı. 4 ° C de bir gece inkübe Çanak iki gün içinde kullanılmalıdır ve kaplanmış alan kurumasına izin verilmemelidir. Plaka üzerinde 50 ul çözelti sağlamak için gerekirse PBS ilave edin. </li></ol> 4. Nötrofil Ayırma (Oda Sıcaklığında Yapılan tüm adımlar) <ol><li> Bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra, bir içine flebotomiden tarafından katılımcı kan toplamakn antikoagülan kan toplama tüpü veya vacutainer (EDTA veya heparin). Kan toplandıktan sonra, ayrılmasından önce PBS ile kan 01:01 sulandırmak. </li><li> 50 ml santrifüj tüplerine PBMC ve nötrofilleri ayrılması için iki tabakalı bir Ficoll hazırlayın. Ilk olarak 15 mL ağır Ficoll (Malzeme Listesi, ρ = 1,118-1,120 bakınız) ekleyin ve sonra dikkatlice 10 ml ağır Ficoll&#39;ün üstüne (Malzeme Listesi, ρ = 1,077-1,080 bakınız) Ficoll ışık katmanı. Hafif Ficoll&#39;ün ve ağır Ficoll katmanları arasında keskin bir sınır olmalıdır. Son olarak, dikkatli bir Ficoll tabaka bozmadan ışık Ficoll üstüne seyreltilmiş kan örneğinin 25 ml katman. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüje tüpü. Not: Bu spin santrifüj sonunda rotor yavaşlama sırasında hücre ayırma potansiyel bozulmasını en aza indirmek için santrifüj rotor freni kapalı olmalıdır. Santrifüjlemeden sonra, (yukarıdan aşağıya) aşağıdaki tabakaları mevcuttur: üst tabaka plazma Follo olduğuışık Ficoll tabakanın üzerine PBMC tabakası ile evli, az kırmızı kan hücrelerinin (RBC) ile nötrofil tabaka tüpün altındaki ağır Ficoll katmanı ve eritrositlerde ardından hafif ve ağır Ficoll arasındadır. </li><li> Hasat ve bir transfer pipeti ile yeni bir 50 ml tüp içine nötrofil tabaka transferi, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 225 x g hızında 50 ml ve santrifüj bir son hacme PBS ekleyin. <ol><li> Santrifüj işleminden sonra hala nötrofiller ile karıştırıldı eritrosit olabilir. Aşağı 10 ml işaretine süpernatant aspire. Tüp (veya kısa bir düşük hız vorteks) yumuşak çalkalama ile, nötrofil-RBC pelletini ve daha sonra PBS, 50 ml ile tekrar yıkanır. </li></ol></li><li> İkinci yıkamadan sonra, süpernatan aspire. , Kirletici eritrositlerde kaldırma çalkalama (veya kısa vorteks) ile artık PBS içinde tekrar süspansiyon pelet hücreleri için, 25 ml H2O ve RBC lize etmek için 10 saniye boyunca nazikçe girdap ekleyin. <ol><li> % 1.8 NaCl, 25 ml eklenir ve karışım hemenOda sıcaklığında 10 dakika boyunca 225 x g&#39;de santrifüj ile. Kirletici RBC artık, beyaz bir nötrofil hücre pelletini terk lize olmalıdır. </li></ol></li><li> PBS ile nötrofil hücre pelletini yıkayın. </li><li> % 10 FBS ile RPMI ortamı içinde yeniden süspanse edin ve izole edilmiş nötrofiller bir hemasitometre ile ışık mikroskobu altında hücre konsantrasyonunu belirler. </li><li> Tam RPMI-% 10 FBS ortamı ile 500,000 hücre / ml hücre yoğunluğu ayarlayın. </li></ol> 5. Akış Odası Yapışma Deneyi <ol><li> Akış odasının birleştirin. Mikroskop masaya birleşik HUVECler ya da saflaştırılmış yapışma reseptörü ligandları ihtiva eden 35 mm tabak yerleştirin. Şırınga pompası, vakum sistemi ile paralel plaka akış odasına bağlayın ve nötrofil girişi için açık bir satır bırakın. Plakanın üst akış odası takın ve akış odası düzeneğini 13 sabitleyin. (Bkz. Şekil 1) </li><li> Bilgisayar bağlı t video kayıt programını başlatınmikroskop o. Tam olarak büyümüş HUVEC hücreleri ile açık alan veya ligand kaplama bölge görünür içinde bir alana dek mikroskop alanını ve odağı ayarlayın. </li><li> Şırınga pompası kullanılarak, RPMI ortam maddesi ile akış odası yıkayın. Odasının içindeki hava kabarcıkları veya nötrofil giriş hattı olmadığından emin olun. </li><li> Eğer arzu edilirse, nötrofiller, 10 dakika boyunca, düşük dozda (10 -8 M) fMLP ile hazırlanmış olabilir. Bu, farklı vericilerden 14 arasında nötrofil aktivasyonunun bazal seviyesi bir eşleşme için izin verir. </li><li> Belirlenen hızlarda akış odasına (Bu çalışmada kullanılan / cm 2 1,5 dynes bir kesme stresi eşittir 350 | il / dk &#39;lık bir hız) nötrofiller enjekte etmek için şırınga pompası kullanın. Video kaydedin. Nötrofil yapışma hızla meydana gelebileceğinden, 4-5 dakikalık bir uzunluğu olan bir görüntü analiz için yapışma olayları miktarını belirlemek için yeterlidir. </li><li> Bir yapışkan hücre az bir hücre çapı hareket eden bir hücre olarak tanımlanmaktadırHUVEC veya ligand kaplı yüzey 15,16 on 5 saniye içinde. Bu kural kullanılarak kaydedilen video alanında mevcut olan yapışkan hücrelerin toplam sayısı. Farklı bağış nötrofil ile benzer uzunlukta video kaydı tarafından, biri farklı bağışçılar arasındaki yapışma özelliklerini karşılaştırmak için yapışık hücre / dk hesaplayabilirsiniz. </li></ol>

<ol><li>Harley, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+scan+in+women+with+systemic+lupus+erythematosus+identifies+susceptibility+variants%5BTitle%5D)+AND+%22in+ITGAM%2C+PXK%2C+KIAA1542+and+other%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants.</a> in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+ICAM1-ICAM4-ICAM5+Locus+Is+Associated+with+Systemic+Lupus+Erythematosus+Susceptibility+in+Multiple+Ancestry+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rheum.+Diseases%22%5BJournal%5D)">Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations.</a> Ann. Rheum. Diseases. 71 (11), 1809-1814 (2012).</li>
<li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+leukocyte+recruitment+in+the+inflammatory+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process.</a> Cardiovasc. Res. 32 (4), 733-742 (1996).</li>
<li>Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+neutrophil-endothelial+cell+adhesion+in+inflammatory+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Crit.+Care%22%5BJournal%5D)">Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders.</a> J. Crit. Care. 9 (1), 47-71 (1994).</li>
<li>Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+molecules+and+inflammatory+injury%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion molecules and inflammatory injury.</a> FASEB J. 8 (8), 504-512 (1994).</li>
<li>Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+interactions+of+LFA-1+and+Mac-1+with+intercellular+adhesion+molecule-1+in+facilitating+adherence+and+transendothelial+migration+of+human+neutrophils+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro.</a> J. Clin. Invest. 83 (6), 2008-2017 (1989).</li>
<li>Marlin, S. D., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+intercellular+adhesion+molecule-1+%28ICAM-1%29+is+a+ligand+for+lymphocyte+function-associated+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen.</a> Cell. 51 (5), 813-819 (1987).</li>
<li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocytes+roll+on+a+selectin+at+physiologic+flow+rates%3A+Distinction+from+and+prerequisite+for+adhesion+through+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins.</a> Cell. 65 (5), 859-873 (1991).</li>
<li>Smith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+steps+involved+in+the+transition+to+stationary+adhesion+of+rolling+neutrophils%3A+A+brief+review%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review.</a> Microcirculation. 7, 385-394 (2000).</li>
<li>Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+construction+of+a+linear+shear+stress+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Design and construction of a linear shear stress flow chamber.</a> Ann. Biomed. Eng. 21 (1), 77-83 (1993).</li>
<li>van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+use+of+a+parallel-plate+flow+chamber+for+studying+cellular+adhesion+to+solid+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces.</a> J. Biomed. Mater. Res. 26 (6), 725-738 (1992).</li>
<li>Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+flow+in+the+parallel+plate+flow+chamber%3A+Implications+for+cell+capture+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies.</a> Biophys. J. 67, 889-895 (1994).</li>
<li>Kucik, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Adhesion+Under+Flow+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of Adhesion Under Flow Conditions.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 9.6.1-9.6.10 (2003).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Lupus+Associated+ITGAM+Variants+Alter+Mac-1+Function+on+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis.+Rheum%22%5BJournal%5D)">Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils.</a> Arthritis. Rheum. , (2013).</li>
<li>Bacabac, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+shear+stress+in+parallel-plate+flow+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers.</a> J. Biomech. 38 (1), 159-167 (2005).</li>
<li>Kucik, D. F., Wu, C. Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., C,, Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. 36 (36), (2010).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> J Vis Exp. (17), 745(2008).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+variations+in+absolute+wall+shear+stress+levels+within+one+species+and+between+species%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species.</a> Atherosclerosis. 195 (2), 225-235 (2007).</li>
<li>Nagaoka, T., Yoshida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+evaluation+of+wall+shear+stress+on+retinal+microcirculation+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1113-1119 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol, saf, gerilimli şartlar altında, nötrofil yapışmasının ölçümü için dikkatli bir minimal aktifleştirilmiş nötrofillerin ayrılmasını ve izole yönlendirir. Nötrofil yapışma inflamasyonda önemli bir işlemdir. Bu işlemde çok sayıda molekülün genetik varyantları, otoimmün hastalık 1,2 gelişmesi için temel oluşturabilir için gösterilmiştir için, nicel olarak insan nötrofil sağlam yapışmasını değerlendirmek yeteneğine sahip bir test sistemi gereklidir. Bu protokolde tarif edildiği gibi bir yöntem şeffaf stres altında kontrollü bir ortamda in vitro nötrofil firma yapışkan potansiyelinin dikkatli ve kantitatif belirlenmesi için olanak sağlar. Bu nedenle bu yöntem genotyped bireyler arasındaki nicel nötrofil yapışma direkt karşılaştırılması yapışma molekülleri 14 genetik varyasyonun önemini belirlemek için izin verir. Bu yöntemde çeşitli adımlar achiev önemsenmesi hake yüksek kantitatif ve tekrarlanabilir sonuçlar. HUVEC hazırlanmasında, akış odası içinde kullanmadan önce% 100 hücre izdiham elde etmek için kritiktir. Saflaştırılmış ligand ile kaplanmış yüzeyler kullanmak için, alt tabaka kaplama alanı ligandı denatüre önlemek için kurumasına asla izin verilmemeli. Buna ek olarak, insan nötrofilleri hazırlanması Deneyin başarısı için çok önemlidir. Kan nötrofilleri de izole önemli hususlar yavaşça izole edilmesini ve deney, aktivasyonunu önlemek için en aza indirmek vorteks (kan, oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir buz ve santrifüj adımları saklanmamalıdır örneğin), oda sıcaklığında hücreleri tutmak ve tamamlayarak işleme dahil mümkün olduğu zaman en az miktarda. Ayrıca, bu tahliller 17,18 için hücrelerin hazırlanması için kullanılabilen ek nötrofil izolasyon yöntemleri vardır. Taze izole edilmiş insan nötrofil kullanarak pratik bir bakış açısı, yapışma tahlilleri kaynaktan<html> katılımcı phlebotomy sonra 3-6 saat içinde yapılması gerekir. Nötrofiller kullanım için son derece hassas olduğu, kan çizmek ve kullanımı arasında uzun süreli kez tahlil sonuçlarını etkileyebilir. Önce, akış odası tahlile nötrofil hücre konsantrasyonunun belirlenmesi dikkatli doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için gereklidir. Akış odası Deney sırasında, bu akım hızı tutarlıdır ve deney uzunluğu boyunca herhangi bir türbülans olduğundan emin olmak için dikkatle video kayıt izlemek için önemlidir. Akış hızları değişimler veya türbülans varlığı deney tekrar edilmesi gerekli olacaktır. Deneyden sonra, o nötrofil topaklanma emin olmak için mikroskobik olarak kalan nötrofiller değerlendirmek için de önemlidir. Bu noktada, topaklanma nötrofiller önemli ölçüde deney sırasında nötrofil yoğunluğu değiştirebilir ki aktif hale gelmiş olduğunu işaret eder. içeriği &quot;&gt; akım odası, bir Q = akış oranı odası içinde homojen yakın dik stres (τ = 6Qμ / (WH 2), μ = dinamik viskozite ve akış odasının W = genişlik &#39;, h = yükseklik yaratır ) haznesi 15 akar. Çalışmalarımızda olarak, / cm 2 1,5 dynes dik bir stres yaratır nötrofil yapışması için 350 ul / dk &#39;lık bir akış hızı, kullanılan (w = 0.25 cm, h = 0.01 inç su, viskozite 37 ° C&#39;de (0.007 poise)) Kan numuneleri ortamın viskozitesinin bir yaklaşım olarak kullanılmıştır. özel bir akış odası için, bir başka fizyolojik koşulları taklit etmek için saf stres seviyelerinin elde edilmesi için farklı akış hızını değiştirebilir. tipik fizyolojik kesme stresi İnsan kan damarlarında 0.5-5.0 din / cm 13,16 arasında değişmektedir. diğer kan damarlarında stres Kayma ve diğer hayvanlar Tablo 1 113,16,19 20&#39;de listelenmiştir. Bizim yöntem, insan neutrophi yapışmasının çalışmaya odaklanmış olsa dals, bu yöntem, nötrofiller ile sınırlı değildir ve kolay bir şekilde yapışması ya da basit değişikliklerle, başka hücre tipleri haddeleme çalışmalarında uygulanabilir. Ayrıca, bu yöntemde, alt-tabakalar, farklı amaçlar için değiştirilebilir. Bu protokol, farklı çalışmalarda kolayca adapte olmasına rağmen, bazı sınırlamalar vardır. Burada uygulandığı gibi protokol analizi için, birincil hücre sayıda gerektirir. Bu küçük hayvanlardan birincil hücre analizi engelleyebilir. Buna ek olarak, uygun bir / etken konformasyonda saflaştırılmış yapışma ligandlar hareketsiz hale getirmek için ihtiyaç ligandların aralığı sınırlayabilir. Fc-füzyon proteinlerinin kullanımı büyük ölçüde plaka yüzeyi üzerinde uygun bir ligand konformasyon elde etme şansını arttırır. Bununla birlikte, bizim yöntem yapışma olayların kantitatif analiz izin önemli esnekliğe sahiptir. Bu çalışmalar büyük ölçüde yapışma reseptör-ligand çiftleri anlayış ve genetik varyantlar potansiyel fonksiyonu önemini artıracakBu protein, insan hastalıklarının patojenezinde.

Her iki β 2 integrins ve ICAM ligandlardaki genetik varyantlar şimdi otoimmün hastalık 1,2 gelişimi ile ilişkili olduğu kabul edilmektedir. Bu varyantların olan bireylerden türetilen hücrelerde, bu varyantların işlevsel sonuçları belirlenmesi, bu varyantlar, otoimmün hastalık patojenezine katkıda kadar daha iyi anlaşılması için gereklidir. Bu gibi fonksiyonel çalışmalar, doğal olarak oluşan genetik varyantları sağlık ve hastalık hem de bağışıklık tepkisini şekillendiren hangi mekanizmaların belirlenmesine izin verir. SLE Spesifik bir örnek olarak, şimdi bu ITGAM (CD11b) varyantları bilmek ve ligand, ICAM-1, 1,2 güçlü bir hastalığın gelişimi ile ilişkilendirir. Nötrofiller inflamatuvar yanıtları kritik olduğundan, nötrofil yapışma kantitatif çalışma ITGAM / ICAM genetik varyantlar iltihabı nasıl değiştirdiğini içine mekanistik anlayışlar sağlayabilir. Neutrophücreleri (EC) endotelial sıkı bir yapışmaya hIL oldukça düzenli bir süreçtir ve enflamatuar yanıtları 3,4 in önemli bir rol oynar. Nötrofil sağlam yapışma EC ilk nötrofil haddeleme ve ele geçirmesi ve sonuçta in vivo göçüne neden olabilir. Bu işlemler, ICAM-1 de dahil olmak üzere yapışma moleküllerinin çok farklı, ICAM-2, P-selektin, E-selektin, endotel hücrelerinde ve nötrofil 5-9 2 integrinler β içerir. Bu nedenle, yapışma moleküllerinin farklı alelik varyantları olan donörlerden nötrofil yapışmasının dikkatli bir miktar, bu genetik varyantları fonksiyonel ve patolojik sonuçlara yol anlaşılması için önemli olacaktır. Bir akış odasının Deneysel in vivo kullanımı 10-12 kan damarı ortamda gözlenene benzer akışkan kesme stresi ile in vitro bir ortam oluşturabilir. Gerçekten de, bir akım odası deney insan umbili ile birleştiğindecal damarı endotel hücre (HUVEC) bir kan damarının in vivo ortamı taklit edebilir. Bu yöntemi kullanarak, bir endotel hücreye doğru genel hücresel yapıştırıcı özelliklerini incelemek olabilir. Buna ek olarak, akış odacığının son derece kontrollü bir ortam da hücrenin değerlendirilmesi örneğin ICAM-1 spesifik reseptör-ligand etkileşiminin çalışma kolaylaştıracak şekilde saflaştırılmış yapışma ligandlarına bağlanmasını sağlar. Burada HUVEC ve saflaştırılmış ligand alt-tabakalar için, insan periferik kan nötrofillerinin yapışkan özelliklerini incelemek için bir akış odası yapışma deneyi sistemi kullanan bir yöntem sunuyoruz. Farklı yapışma molekülü alelik varyantlarını eksprese eden vericiden hücreler ile bu yöntemi kullanarak, bize bu genetik varyant insan nötrofil sıkı bir yapışmaya değiştirebilir nasıl tayin edilmesine olanak sağlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>% 0.25 Tripsin / EDTA</td><td>Fenol Kırmızısı</td><td>ile yaşam teknolojileri 25200-056</td><td></td></tr><tr><td>2x Tripsin inhibitörü</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>35 mm doku kültürü kabı</td><td>Corning Inc.</td><td>430165</td><td>Standart Doku Kültürü İşlem Görmüş Yüzey</td></tr><tr><td>75 cm2 doku kültürü şişesi</td><td>Corning Inc.</td><td>430641</td><td>Standart Doku Kültürü İşlem Görmüş Yüzey</td></tr><tr><td>CCD kamera</td><td>Dage-MTI</td><td>Model 300T-RC</td><td></td></tr><tr><td>Hücre dondurma kabı</td><td>Biyocision</td><td>BCS-045</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td>HUVEC büyüme bazal ortamı</td></tr><tr><td>EGM-2 Bulletkit</td><td>Lonza Inc</td><td>CC-4176</td><td>Bazal ortam için HUVEC büyüme faktörleri</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>10082-147</td><td>Sertifikalı, Sığır derisinden Isı ile Etkisiz</td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Fisher scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma</td><td>İnsan plazmasından</td> <td>F2006</td></tr><tr><td>Akış odası</td><td>Glyco Tech</td><td>31-001</td><td>35 mm bulaşıklar için dairesel akış odası</td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma</td><td>47729</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-11191</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Ağır Ficoll</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2517A</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>720-IC</td><td>Fc kimera</td></tr><tr><td>Lenfosit ayırma ortamı</td><td>Mediatech Inc.</td><td>25072CV</td><td>Işık Ficoll</td></tr><tr><td>Mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 orta</td><td></td><td>L-glutamin ve Fenol Kırmızı Protein</td>ile <td>11875</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>P6031</td><td>PBS</td></tr><tr><td>P-Selectin</td><td>R& D Sistemleri</td><td>137-PS</td><td>Fc kimera</td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>KD Scientific</td><td>KDS270</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&#945;</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>PHC3015</td><td>Rekombinant İnsan Proteini</td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözeltisi, %0.4Yaşam</td> <td>teknolojileri</td><td>15250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan nötrofil akış odası yapışma deneyi

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Endotel hücrelerine nötrofil sağlam yapışma sağlık ve hastalık hem enflamasyonda önemli bir rol oynar. Nötrofil sağlam yapışma süreci β 2 integrin ailesinin üyeleri ve ICAM ailesinin kontra reseptörleri de dahil olmak üzere birçok farklı yapışma moleküllerini içerir. Son zamanlarda, hem de doğal olarak oluşan genetik varyantları 2 integrinler β ICAMlann ve oto-bağışıklık hastalığı ile ilişkili olduğu bildirilmektedir. Bu nedenle, bu yapışma moleküllerinin değişik alelik formları ile bireylerden alınan nötrofil kantitatif yapışkan otoimmün kapasite gelişimi altında yatan mekanizmaları ile ilgili olarak çalışma için önemlidir. Akış bölme sistemlerinde Yapışma çalışmalar in vivo olarak kan damarı ortamda gözlenene benzer akışkan kesme stresi ile bir ortam oluşturabilir. Burada, insan periferal kan nötrofil kantitatif yapışkan özelliklerini incelemek için bir akış odası deney sistemi kullanılarak bir yöntem mevcuts insan göbek damarı endotel hücre (HUVEC) ve saflaştırılmış ligand substratlara. Bu yöntem ile, yapışma reseptörlerinin farklı alelik varyantları ile vericilerden, nötrofil yapışkan kapasitelerinin değerlendirilmesi ve karşılaştırılabilir. Bu yöntem, aynı zamanda birincil hücre tipleri veya hücre hatları yapışmasını değerlendirmek için modifiye edilebilir.

Nötrofil örnekleri arasında saflaştırılmış bir ligand (ICAM-1/P-Selectin) kaplanmış akım odası (Şekil 2) ya da bir HUVEC kaplanmış akım odası analizi (Şekil 3) bağlanabilen nötrofil bağlanmasını gösterilmiştir. Şekillerde gösterildiği gibi, nötrofiller sürekli akış koşulları altında kaplanmış yüzey veya HUVEC uyması / birikmeye devam etmektedir. Bizim tipik deney koşulları altında, sıkıca dört dakikalık bir kayıt dönemi sırasında, kaplanmış yüzey veya HUVEC yapışan 50-70 insan nötrofil gözlemleyebiliriz. Bununla birlikte, nötrofil yapışma molekülleri ya da alt-tabaka (saflaştırılmıştır ligand veya HUVEC) allelik varyantları alelik varyantlar, esas olarak nicel nötrofil yapışmasını 14 değiştirebilir. Biz de bizim çalışmalarda gözlenen nötrofil yapışma olayların zaman bağımlılığını değerlendirdik. Biz sabit akış koşulları muhafaza ederken, bu hücrelerin yapışkan özellikleri zamanla değişebilir mümkündür. However, bizim çalışmalarda nispeten kısa zamanlı kurslar içinde, biz zamanla yapışma oranı herhangi tutarlı farklılıkları gözlemek değil. Örneğin, 3-4 dakikalık bir zaman noktaları arasında gözlemlenen yapışma göre 1-2 dakika zaman noktalarında yapışmasını değerlendirmek sürekli olarak farklı değildir. Hücrelerin yapışma deney sırasında uyarılır ediliyor Tabii ki, o zamanla yapışkan özelliklerinde değişiklikler beklenebilir. Çalışmalarımızda olarak, kasıtlı olarak çalışma öncesinde, 10 dakika boyunca düşük doz fMLP (10 8 M) ile hücrelerin priming ile izolasyon neden olduğu nötrofil aktivasyonu için kontrol edilir. Endotel hücreleri (Çalışmalarımızda HUVEC), aynı zamanda en iyi şekilde yapışması için sağlam bir lökosit yapışma molekülü ekspresyonunu öncesinde aktivasyon gerektirir. Ön-muamele yokluğunda, endotel hücreleri (HUVECler) çok az, nötrofil yapışmasını destekleyecektir. Çalışmalarımızda olarak, 10 ng / ml, kullanımdan önce 4-6 saat boyunca TNFa tedavisinde kullanılır. IL-1β (10 ng / ml) ve<html> LPS (0.5-1 ug / ml), aynı zamanda endotel hücrelerinin ön-aktive etmek için kullanılabilir. Önemli bir şekilde, muamele edilmemiş HUVEC hücre yapışma spesifik (alıcı aracılı) nötrofil-endotel hücre etkileşimleri neden olduğundan emin olmak için negatif bir kontrol olarak kullanılabilir. Alternatif olarak, anti-reseptör antikorlar yapışma özelliğinin değerlendirilmesi özgü reseptörleri bloke etmek için kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1.jpg" /> Mikroskop sahnede Şekil 1.. Akış odası yapılandırma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> oad/51410/51410fig2.jpg &quot;/&gt; 0 zaman noktası, B: 1 dakika zaman noktası, C: 2 dk zaman noktası, ve D. Farklı zaman noktalarında (A kaplanacak yüzey ICAM-1/P-Selectin yapışan nötrofillerin örnek bir videodan Şekil 2 ekran görüntüleri: 4 dk zaman noktası). ICAM-1 konsantrasyonu 25 ug / ml &#39;dir ve P-Selektin 0.5 ug / ml&#39; dir. Nötrofil akış hızı 500,000 hücre / ml &#39;de nötrofil yoğunluğa sahip 350 ml / dk&#39; dır. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3.jpg" /> . Farklı zaman noktalarında (: 0 zaman noktası, B: 1 dakika zaman noktası, C: 2 dk zaman noktası, ve D: 4 dk zaman noktası A) HUVEC kaplanmış yüzeyine yapışan nötrofillerin örnek bir videodan Şekil 3 ekran görüntüleri.Nötrofil akış hızı 500,000 hücre / ml &#39;de nötrofil yoğunluğa sahip 350 ml ul / olup. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td> Tür </td><td > Yer </td><td > Kesme gerilmesi (din / cm 2) </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Ortak caroid arter </td><td> 11.6 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Brankiyal arter </td><td> 6.5 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Femoral arter </td><td> 4.3 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Böbreküstü aorta </td><td> 7.3 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Supraceliac aorta </td><td> 4.2 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Yüzeysel fermoral arter </td><td> 4.4 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Venüller </td><td> 0.5-5.0 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Retina ilk arteriyoller </td><td> 40.2 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Retina ikinci arteriyoller </td><td> 0.001 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Retina ilk venüller </td><td> 23.2 </td></tr><tr ><td> Insan </td><td> Retina ikinci venüller </td><td> 0.43 </td></tr><tr ><td> Köpek </td><td> Ortak caroid arter </td><td> 15.8 </td></tr><tr ><td> Tavşan </td><td> Ortak caroid arter </td><td> 23.3 </td></tr><tr ><td> Sıçan </td><td> Ortak caroid arter </td><td> 46.6 </td></tr><tr ><td> Fare </td><td> Ortak caroid arter </td><td> 64.8 </td></tr><tr ><td> Köpek </td><td> Femoral arter </td><td> 9.8 </td></tr><tr ><td> Tavşan </td><td> Femoral arter </td><td> 156.8 </td></tr><tr ><td> Sıçan </td><td> Femoral arter </td><td> 65.9 </td></tr></tbody></table> Farklı organ ve farklı türler Tablo 1.. Numune kesme gerilmesi. * Referanslar 13, 16, 19, ve 20 özetlenmiştir.

Nötrofil yapışmasını ölçülmesi için bir yöntem rapor edilir. Bu yöntem, bir kan damarı karşılaşılan edilene benzer bir dinamik akış ortam oluşturur. Bu izin saflaştırılmış yapışma molekülleri (ligand) veya saf stres ile in vivo ortama benzer bir bağlamda endotel hücre alt-tabaka (HUVEC) ya da, nötrofil adhezyonunun araştırılması.

İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Bu prosedürün genel amacı, kayma gerilimi varlığında insan nötrofil adezyonuna olanak tanıyan bir akış odası deneyi kullanarak nötrofil sıkı adezyonunu ölçmektir. Bu işlem, öncelikle saflaştırılmış adezyon moleküllerinden oluşan bir substrat veya insan göbek veni endotel hücreleri gibi bir endotel hücre yüzeyinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, iki katmanlı PHI santrifüj yöntemi kullanılarak insan periferik kanından nötrofillerin ayrılmasıdır.Ardından, izole edilmiş insan nötrofillerin shear stress altında adezyon ligandlarının veya ve'nin bulunduğu substrata enjekte edilmesini sağlamak için akış odası monte edilir. Son adım, akış odasındaki nötrofil adezyon olaylarının kaydedilmesi ve ardından sıkı adezyonun dikkatli bir şekilde nicellenmesidir. Nihayetinde, akış odası testi, nötrofillerin saflaştırılmış adezyon moleküllerine ve bir HX yüzeyine karşı gösterdiği sıkı adezyonu göstermek için kullanılır.Bu yöntem, otoimmünite gelişimiyle ilişkili olduğu bilinen doku moleküllerindeki genetik varyasyonların fonksiyonel önemi gibi otoimmünite alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Sistemik lupus eritemozus hastalarıyla yapılan genetik çalışmalar, nötrofillerin sıkı yapışmasında rol oynayan bir protein olan beta 2 integrin varyantları ile güçlü bir ilişki olduğunu göstermiştir. Mac-1 olarak adlandırılan bu beta 2 integrindeki genetik varyasyonun sıkı yapışma üzerindeki fonksiyonel sonuçlarını değerlendirmek için bu analiz sistemini geliştirdik. Akış odasında kullanılmak üzere kültür kaplarını hazırlamak için.Her bir 35 milimetrelik doku kültürü tabağına bir mililitre fibrin ve jelatin çözeltisi ekleyin ve tüm plaka yüzeyinin kaplandığından emin olmak için birkaç kez pipetleyin. Fazla fibronektin ve jelatin çözeltisini uzaklaştırın ve plakaları en az 30 dakika boyunca havada kurutun. Protein matrisi oluşumunu optimize etmek için, %80 ila %90 konfluense ulaşana kadar kültüre edilmiş insan göbek ven endotel hücrelerini veya qve'leri tripsin EDTA kullanarak hasat edin ve kaplanmış her bir doku kültürü tabağına 500.000 hücre ekleyin.Her bir kaba iki mililitre büyüme ortamı ekleyin ve 37 °C'de %5 CO2 ortamında inkübe edin. Hücreler günlük olarak görsel olarak kontrol edilmeli ve her iki günde bir ortam değişimi yapılmalıdır. Hücrelerin %80 ila %90 konfluense ulaşmasını bekleyin.Bu prosedüre başlamak için, 35 milimetrelik bir doku kültürü kabının merkezine bir marker veya kalem kullanarak 0.5 santimetre çapında bir daire çizin. İşaretli alana, 20 µg/mL protein A çözeltisinden 20 µL ekleyin. Protein A çözeltisini 0.5 santimetre çapındaki dairenin içindeki tüm alanı kaplayacak şekilde yaymak için pipet ucunu kullanın.Kapların yüzeyine dokunmamak veya bunları çizmemek önemlidir. Doku kültürü kaplarını 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, protein kaplanmış her bir plakayı 1 mL PBS ile üç kez yıkayın.Üçüncü yıkama plakasındaki PBS uzaklaştırıldıktan sonra, plakadaki spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için işaretli alana 50 µL %1 BSA ekleyin. Dört °C'de iki saat inkübe edin. İki saat sonra.Bloke edilmiş plakayı üç kez 1 mL PBS ile yıkayın. Kaplama ve bu deney için FC adhezyon reseptör ligand kimera protein çözeltilerini hazırlayın; 25 µg/mL konsantrasyonda ICAM-1 FC Kyra ve 0,5 µg/mL konsantrasyonda P-selektin FC Kyra kullanılacaktır. İşaretli alanı 50 µL substrat ile kaplayın ve doku kültürü kaplarını 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.Kaplar iki gün içinde kullanılmalı ve kaplanmış alanın kurumasına izin verilmemelidir. Gerekirse, plaka üzerindeki 50 µL çözeltiyi korumak için PBS ekleyin.Bu çalışma için nötrofiller, yazılı bilgilendirilmiş onam vermiş katılımcıların kanından izole edilir. Kanı flebotomi yoluyla bir antikoagülanlı kan toplama tüpüne veya vakutainer'a topladıktan sonra, kanı PBS ile bire bir oranında seyreltin ve bu prosedürdeki tüm adımları gerçekleştirin. Oda sıcaklığında, 50 mililitrelik santrifüj tüplerinde periferik kan mononükleer hücrelerini (pBMC'ler) ve nötrofilleri ayırmak için iki katmanlı bir fizyolojik çözelti hazırlayın.İlk olarak, 15 mililitre ağır PHI call ekleyin ve ardından 10 mililitre hafif fi call'u ağır fi call'un üzerine dikkatlice katmanlandırın. Hafif fi call ve ağır fi call katmanları arasında belirgin bir sınır olmalıdır. Son olarak, PHI'yi bozmadan, seyreltilmiş kan örneğinin 25 mililitresini hafif fi call'un üzerine dikkatlice katmanlandırın.Tüpleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca santrifüj edin; santrifüj sonrası birden fazla tabaka oluşmuş olmalıdır. Az miktarda eritrosit içeren nötrofil tabakası, hafif ve ağır fazlar arasında yer alır. Bir transfer pipeti kullanarak nötrofil tabakasını toplayın, yeni bir 50 mL'lik tüpe aktarın ve son hacim 50 mL olacak şekilde PBS ekleyin.225 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası oda sıcaklığında, nötrofillerle karışmış kırmızı kan hücreleri hâlâ bulunabilir. Süpernatantı 10 mililitre seviyesine kadar aspire edin.Yeniden süspande edin. Nötrofil eritrosit peletini düşük hızda kısa süreli vorteksleyerek süspande edin ve ardından 50 mililitre PBS ile tekrar yıkayın; kontamine eritrositleri uzaklaştırmak için süpernatantı aspire edin. Peletlenen hücreleri, kısa süreli düşük hızlı bir vorteks işlemiyle kalıntı PBS içinde yeniden süspande edin.25 mililitre su ekleyin ve 10 saniye boyunca hafifçe vorteksleyin. Eritrositleri lize etmek için 25 mililitre %1,8 sodyum klorür ekleyin ve hemen 225 ×g kuvvetinde 10 dakika boyunca santrifüjleyerek karıştırın.Kontamine kırmızı kan hücreleri şimdi liz edilmeli ve geriye beyaz bir nötrofil hücresi peleti bırakılmalıdır. Nötrofil hücresi peletini PBS ile yıkayın, süpernatantı atın ve izole edilen nötrofilleri %10 FBS içeren RPMI mediumu içinde yeniden süspande edin. Hücre konsantrasyonunu bir ışık mikroskobu ve hemositometre ile belirledikten sonra, hücre yoğunluğunu %10 FBS içeren komple RPMI mediumu ile mililitre başına 500.000 hücreye ayarlayın.Akış odası adezyon deneyi başlatılmadan önce, adezyon molekülleri ekspresyonunu yukarı regüle etmek ve stimüle etmek için VE'leri 20 nanograms per milliliter insan TNF alpha ile dört ila altı saat boyunca prime edin. VE'ler hazır olduğunda akış odasını monte edin. Konfluen VE içeren 35 millimeter kabı mikroskop tablasına yerleştirin.Bu videonun amaçları doğrultusunda, yalnızca nötrofillerin VE'ye adezyonu incelenecektir; ancak aynı prosedür, nötrofillerin saflaştırılmış adezyon moleküllerine olan adezyonunun çalışılması için de geçerlidir. Paralel plak akış odasını şırınga pompası ve vakum sistemi ile bağlayın ve nötrofil girişi için bir hattı açık bırakın. Akış odasını plağın üzerine yerleştirin ve akış odası düzeneğini sabitleyin. Mikroskoba bağlı bilgisayarda video kayıt programını başlatın.Tam gelişmiş VE'lerin bulunduğu net bir alan görünene kadar mikroskobun görüş alanını ve odağını ayarlayın. Şırınga pompasını kullanarak akış odasını RPMI besiyeri ile durulayın. Oda içerisinde veya nötrofil giriş hattında hava kabarcığı kalmadığından emin olun.Nötrofilleri belirlenen hızlarda akış hücresine enjekte etmek için şırınga pompası kullanın. Nötrofil adhezyonu hızla gerçekleşebileceği için videoyu kaydedin; adhezyon olaylarını analiz için nicelendirmek amacıyla genellikle dört ila beş dakikalık bir video yeterlidir. Bu video klibi, nötrofillerin HU E kaplı bir akış hücresine bağlanmasına dair bir örnek göstermektedir.Adherent hücre, HU e kaplı yüzey üzerinde beş saniye içinde bir hücre çapından daha az hareket eden hücre olarak tanımlanır. Burada, nötrofillerin ICAM one P selektin kaplı veya bir uve kaplı yüzeye tutunmasını gösteren örnek videolardan farklı zaman noktalarına ait ekran görüntüleri yer almaktadır.Her iki deneyde de nötrofil akış hızı dakikada 350 microliters, nötrofil yoğunluğu ise mililitre başına 500, 000 hücredir. Tipik koşullar altında, dört dakikalık bir kayıt süresi boyunca 50 ila 70 insan nötrofilinin ligand veya VE kaplı yüzeye sıkıca yapıştığı gözlemlenmiştir. Bununla birlikte, farklı donörlerle benzer uzunlukta videolar kaydedildiğinde, nötrofil adezyon moleküllerinin alelik varyantlarının veya substrattaki alelik varyantların kantitatif nötrofil adezyonunu önemli ölçüde değiştirebileceği görülmüştür.Nötrofiller için, farklı donörler arasındaki adezyon özelliklerini karşılaştırmak amacıyla dakika başına yapışan hücre sayısı hesaplanabilir. Bu prosedürü uygularken, izolasyon kaynaklı hücre aktivasyonunun neden olduğu hücre kümelenmelerini nötrofillerde görsel olarak kontrol etmeyi hatırlamak önemlidir. Ayrıca, hücrelerin aktivasyon durumunun donörler ve deneyler arasında eşleştiğinden emin olmak için paralel akış sitometrik hücre aktivasyon değerlendirmesi yapılabilir.Bu teknik, otoimmünite alanındaki araştırmacıların, beta iki integrin MAC-1'in CD 11 B zincirinin farklı kodlama bölgesi alellerine sahip genotipik donörlerden alınan primer insan hücrelerinde hücre adhezyonunu incelemelerinin önünü açmıştır. Bu çalışmalar, söz konusu allelik varyantların insan sistemindeki fonksiyonel etkisinin dikkatli ve kantitatif bir şekilde değerlendirilmesine olanak sağlamıştır.

human-neutrophil-flow-chamber-adhesion-assay

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Hem molekülleri etkileşen hücrelerin yüzeylerinde demirlemiş olan reseptör-ligand etkileşimi kinetiği ölçmek için bir yapışma frekans tahlil açıklanmıştır. Bu mekanik tabanlı test mikropipet basınçlı bir insan adezyon sensörü olarak kırmızı kan hücresi ve integrin αLβ2 ve hücrelerarası adezyon molekülü-1 reseptörleri ve ligandlar etkileşim olarak kullanarak örneklenir.

Yapışma için Frekans Testi Yerinde</emHücre-Hücre Arayüz Çapraz Junctional Moleküler Etkileşimler> Kinetik Analizi

Bu makale ilk umblikal damarlar, insan endotel hücreleri izole etmek için bir yordam açıklanır ve sonra akış koşullarında nötrofil göçü incelemek için bu hücreleri nasıl kullanılacağını gösterir. Camın optik karakteristikler ile bir polimer elde edilen bir düşük hacimli akış odası kullanılarak, nadir hücre popülasyonlarının canlı-hücre flüoresan görüntüleme da mümkündür.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Bu video, hepsi çip üzerinde bir yöntem kullanılarak nötrofil kemotaksisi testini göstermektedir. Yöntem, immünomanyetik negatif seçim ve ardından bir mikroakışkan çip üzerinde kemotaksis testi ile nötrofillerin tam kandan doğrudan izolasyonuna izin verir.

Tam Kan Kullanılarak Hızlı Nötrofil Kemotaksisi Analizi için Mikroakışkan Çip Tabanlı Bir Yöntem

Bu video, lökositlerin ve endotel hücreleri gibi hücresel ortakların etkileşimini karakterize etmek için laminer akış tabanlı bir testi göstermektedir. Bu yöntem, sağlam ve birleşik bir vasküler hücre tabakası üzerine perfüze edildiğinde lökositlerin yapışması, adezyonu ve transmigrasyonu hakkında dinamik bilgiler sağlar.

Lökositler ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için laminer akış tabanlı bir test

Video, stromal hücrelerin lökosit alımı üzerindeki etkisini araştırmak için bir yöntem göstermektedir. Paralel bir plaka akış odası modelinde, pro-inflamatuar sitokinler, endotel hücreleri tarafından adezyon reseptörlerinin ekspresyonunu indükleyerek nötrofil alımını ve göçünü kolaylaştırır. Stromal hücreler ve endotel hücreleri arasındaki çapraz konuşma, endotel hücrelerine nötrofil alımını azaltır.

Stromal Hücrelerin Lökosit Alımı Üzerindeki Etkisinin İn Vitro Flow Araştırması

Enfeksiyon bölgelerinde aktif endotele nötrofil bağlılık konağın inflamatuvar yanıt ayrılmaz bir bileşenidir. Için izin veren bir nötrofil bağlayıcı bir testtir Bu raporda...

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

Bu protokol, sağlam tekrarlanabilirlik ile, bütün haldeki kan, bir damla, insan nötrofil kemotaksisi ölçmek için tasarlanmış bir tahlil göstermektedir. Bu yaklaşım, nötrofil ayrılması için ihtiyaç dışı eden ve deney hazırlama zaman sadece birkaç dakika gerektirir. Mikroakışkan çip bebeklerde veya örnek hacmi sınırlıdır küçük memeliler, zamanla nötrofil kemotaksisinin tekrarlanan ölçü sağlar.

İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu

Karaciğer lökosit işe özgü karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri ile kaplı olan hepatik sinüzoidler özel kanallar içinde gerçekleşir. Fizyolojik kesme stresi koşulları altında, insan karaciğer sinüzoidal endotelyumda lökosit işe faz kontrast mikroskopisi bu işlemi altında yatan moleküler mekanizmaların açıklanması kolaylaştırabilir.

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Lökositler paraselüler veya transselüler yolu kullanarak endotel tek tabaka çapraz. Biz endojen junctional dağıtım VE-kaderin ve PECAM-1 lökosit transendotelyal göç sırasında fizyolojik akış altında iki âlemden yolları arasında ayrım için takip basit bir deney geliştirildi.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Bu makale, tam kandan alınan çipte nötrofil izolasyonunu ve kemotaks testini tek bir mikroakışkan yonga üzerine entegre ederek hızlı bir nötrofıl kemotaksis tahlilini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır.

Hızla Nötrofil Kemotaksis Analizinde Doğrudan Bir Damla Kan Alınacak Bütünleşik Çip Yöntemi

Lökosit heyecanla damar hücreleri ve trombositlerin damar duvar yaralanma sonra veya enflamasyon sırasında etkileşim. Burada, lökosit ve hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmek için basit bir laminar akış tabanlı tahlil açıklayın.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

Öğrenin insan nötrofillerinin akış odası yapışma deneyiyle kesme gerilmesi altında yapışmasını ölçme yöntemini. Bu teknik, otoimmün hastalıklarda yapışma moleküllerinin işlevsel rollerini araştırmak için değerlidir.

İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Daha fazla video keşfet