İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Nötrofil yapışmasını ölçülmesi için bir yöntem rapor edilir. Bu yöntem, bir kan damarı karşılaşılan edilene benzer bir dinamik akış ortam oluşturur. Bu izin saflaştırılmış yapışma molekülleri (ligand) veya saf stres ile in vivo ortama benzer bir bağlamda endotel hücre alt-tabaka (HUVEC) ya da, nötrofil adhezyonunun araştırılması.

Bu prosedürün genel amacı, kesme gerilimi varlığında insan nötrofil yapışmasına izin veren bir akış odası tahlili kullanarak nötrofil firma yapışmasını ölçmektir. Bu, önce saflaştırılmış adezyon moleküllerinden oluşan bir substrat veya insan göbek damarı, endotel hücreleri veya ve gibi bir endotel hücre yüzeyi hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım, iki katmanlı bir PHI çağrı santrifüjleme yöntemi kullanarak nötrofilleri insan periferik kanından ayırmaktır.

Daha sonra, akış odası, izole edilmiş insan nötrofillerinin kesme gerilimi altında yapışma, ligandlar veya ve'nin substratı üzerine enjeksiyonuna izin verecek şekilde monte edilir. Son adım, akış odasındaki nötrofil yapışma olaylarını kaydetmek ve ardından sıkı yapışmanın dikkatli bir şekilde ölçülmesidir. Sonuç olarak, akış odası deneyi, nötrofillerin saflaştırılmış yapışma moleküllerine ve bir HX yüzeyine sıkı bir şekilde yapıştığını göstermek için kullanılır.

Bu yöntem, otoimmünite gelişimi ile ilişkili olduğu bilinen bir doku molekülündeki genetik varyasyonların işlevsel önemi gibi otoimmün alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Sistemik lupus eritema pitozisi olan hastalarda yapılan genetik çalışmalar, varyantlar ve nötrofil firma yapışmasında rol oynayan bir protein olan Abeta iki integrin ile güçlü bir ilişki göstermiştir. Bu tahlil sistemini, bu betadaki genetik varyasyonun fonksiyonel sonuçlarını değerlendirmek için geliştirdik, Mac adı verilen iki endokrin, biri sıkı yapışma üzerine, Akış odasında kullanılmak üzere kültür kaplarını hazırlamak için.

Her 35 milimetrelik doku kültürü kabına bir mililitre fibrin ve jelatin çözeltisi ekleyin ve tüm plaka yüzeyinin kaplandığından emin olmak için birkaç kez pipetleyin. Fazla fibronektin ve jelatin solüsyonunu çıkarın ve plakaları en az 30 dakika havayla kurutun. Protein matrisi oluşumunu optimize etmek için, her bir kaplanmış doku kültürü kabına tripsin EDTA tohumu 500.000 hücre kullanılarak% 80 ila 90 birleşmeye kadar kültürlenmiş insan göbek veni endotel hücrelerini veya qve'yi hasat edin.

Her yemeğe iki mililitre büyüme ortamı ekleyin ve 37 santigrat derecede inkübe edin. % 5 CO2 hücreleri, her iki günde bir orta değişikliklerle günlük olarak görsel olarak incelenmelidir. Hücrelerin %80 ila %90 oranında büyümesine izin verin.

Bu işleme başlamak için, 35 milimetrelik bir doku kültürü kabı plakasının ortasına 0,5 santimetre çapında bir daire çizmek için bir işaretleyici veya kalem kullanın. Mililitre başına 20 mikrogram proteinin 20 mikrolitresi, işaretli alanda bir çözelti. Proteini yaymak için pipet ucunu kullanın, 0,5 santimetre çapındaki daire içindeki tüm alanı kaplayacak bir çözelti.

Yemeğin yüzeyine dokunmamak veya çizmemek önemlidir. Doku kültürü kaplarını 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Daha sonra, her proteini bir mililitre PBS ile üç kez kaplanmış bir plakayı yıkayın.

PBS'yi üçüncü yıkama plakasından çıkardıktan sonra, plaka üzerinde spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için işaretli alana 50 mikrolitre% 1 BSA püskürtün. Dört santigrat derecede iki saat inkübe edin. İki saat sonra.

Tıkalı plakayı bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Kaplama için FC yapışma reseptörü ligand kimerik protein çözeltilerini hazırlayın ve bu deney ve mililitre başına 25 mikrogramda ICAM bir FC Kyra ve mililitre başına 0.5 mikrogramda bir P selectin FC Kyra kullanılacaktır. İşaretli alanı 50 mikrolitre substrat ile kaplayın, doku kültürü kaplarını gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Bulaşıklar iki gün içinde kullanılmalı ve kaplanan alanın kurumasına izin verilmemelidir. Gerektiğinde. Plakadaki 50 mikrolitre çözeltiyi korumak için PBS ekleyin.

Bu çalışma için nötrofiller, yazılı bilgilendirilmiş onam veren katılımcıların kanından izole edilmiştir. Flebotomi ile kanı antikoagülan bir kan alma tüpüne veya vakütainere aldıktan sonra, kanı PBS ile bire bir seyreltin ve bu prosedürdeki tüm adımları gerçekleştirin. Oda sıcaklığında, 50 mililitrelik santrifüj tüplerinde periferik kan mononükleer hücrelerini veya p BMC'leri ve nötrofilleri ayırmak için iki katmanlı bir phy çağrısı hazırlayın.

Önce 15 mililitre ağır PHI çağrısı ekleyin ve ardından ağır fi aramasının üzerine 10 mililitre hafif fi aramasını dikkatlice katmanlayın. Hafif fi çağrısı ile ağır fi çağrısı katmanları arasında keskin bir sınır olmalıdır. Son olarak, seyreltilmiş kan örneğinin 25 mililitresini PHI'yı rahatsız etmeden hafif fi çağrısının üzerine dikkatlice yerleştirin.

Çağrı katmanı: Santrifüjlemeden sonra tüpleri oda sıcaklığında 30 dakika santrifüjleyin, birden fazla katman bulunmalıdır. Az sayıda kırmızı kan hücresi içeren nötrofil tabakası, hafif ve ağır phi arasındadır. Bir transfer pipeti hasadı kullanarak arayın ve nötrofil tabakasını 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve PBS'yi 50 mililitrelik son hacme ekleyin.

10 dakika boyunca 225 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra oda sıcaklığında, nötrofillerle karıştırılmış kırmızı kan hücreleri hala olabilir. Süpernatanı 10 mililitreye kadar aspire edin.

Resus'u işaretle. Nötrofil kırmızı kan hücresi peletini kısa bir süreliğine askıya alın, düşük hızda girdap yapın ve daha sonra kirletici kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için süpernatanı 50 mililitre PBS aspire ederek tekrar yıkayın. Artık PBS'deki peletlenmiş hücreleri kısa bir düşük hızlı girdap ile yeniden süspanse edin.

25 mililitre su ekleyin ve 10 saniye boyunca hafifçe girdap yapın. Bitlere kadar. Kırmızı kan hücreleri 25 mililitre% 1.8 sodyum klorür ekler ve hemen 10 dakika boyunca 225 kez G'de santrifüjleme ile karıştırılır.

Kirletici kırmızı kan hücreleri şimdi beyaz bir nötrofil hücre peleti bırakarak yatmalıdır. Nötrofil hücre peletini PBS ile yıkayın, süpernatanı atın ve izole edilen nötrofilleri RPMI ortamında% 10 FBS ile yeniden süspanse edin. Hücre konsantrasyonunu bir hemo sitometre ile ışık mikroskobu altında belirledikten sonra, hücre yoğunluğunu tam RPMI% 10 FBS ortamı ile mililitrede 500.000 hücreye ayarlayın.

Akış odası yapışma testine başlamadan önce, yapışma molekülü ekspresyonunu yukarı regüle etmek ve uyarmak için VE'yi mililitre insan TNF alfa başına 20 nanogram ile dört ila altı saat boyunca astarlayın. VE hazır olduğunda, akış odasını monte edin. Birleşen VE'yi içeren 35 milimetrelik çanağı mikroskop tablasının üzerine yerleştirin.

Bu videonun amaçları doğrultusunda, sadece VE'ye nötrofil yapışması incelenecektir, ancak aynı prosedür, saflaştırılmış yapışma moleküllerine nötrofil yapışmasının incelenmesi için de geçerlidir: paralel plaka akış odasını şırınga pompası ve vakum sistemi ile bağlayın ve nötrofil girişi için bir hattı açık bırakın. Akış odasını plakanın üstüne yerleştirin ve akış odası tertibatını sabitleyin. Mikroskoba bağlı bilgisayarda video kayıt programını başlatın.

Mikroskobun alanını ve odağını, tamamen büyümüş VE'ye sahip net bir alan görünene kadar ayarlayın. Şırınga pompasını kullanarak akış odasını RPMI ortamı ile durulayın. Hazne veya nötrofil giriş hattı içinde hava kabarcığı olmadığından emin olun.

Nötrofilleri tanımlanmış hızlarda akış odasına enjekte etmek için şırınga pompasını kullanın. Videoyu kaydedin Nötrofil yapışması hızlı bir şekilde gerçekleşebileceğinden, analiz için yapışma olaylarını ölçmek için genellikle dört ila beş dakikalık bir video yeterlidir. Bu video klip, HU E kaplı bir akış odasına bağlanan nötrofillerin bir örneğini göstermektedir.

Yapışık bir hücre, beş saniye içinde bir hücre çapından daha az hareket eden bir hücre olarak tanımlanır. HU e kaplı yüzeyde. Burada, bir ICAM one P selectin kaplı yüzeye veya uve kaplı bir yüzeye yapışan nötrofillerin örnek videolarından farklı zaman noktalarında ekran görüntüleri gösterilmektedir.

Her iki deneyde de, nötrofil akış hızı dakikada 350 mikrolitredir ve nötrofil yoğunluğu mililitre başına 500.000 hücredir. Tipik koşullar altında, 50 ila 70 insan nötrofilinin, dört dakikalık bir kayıt süresi boyunca ligand veya VE kaplı yüzeye sıkıca yapıştığı gözlendi. Bununla birlikte, nötrofil adezyon moleküllerinin alelik varyantları veya substrattaki alelik varyantlar, farklı donörlerle benzer uzunlukta videolar kaydederek kantitatif nötrofil adezyonunu önemli ölçüde değiştirebilir.

Nötrofiller, farklı donörler arasındaki yapışma özelliklerini karşılaştırmak için dakikadaki yapışma hücrelerinin sayısı hesaplanabilir. Bu prosedürü denerken, izolasyonun neden olduğu hücre aktivasyonunun neden olduğu hücre klemplenmesi için nötrofilleri görsel olarak kontrol etmeyi unutmamak önemlidir. Ek olarak, hücrelerin aktivasyon durumunun donörler arasında ve deneyler arasında eşleşmesini sağlamak için hücre aktivasyonunun paralel akış sitometrik değerlendirmesi yapılabilir.

Bu teknik, otoimmünite alanındaki araştırmacıların, beta iki integrin, MAC bir'in CD 11 B zincirinin farklı kodlama bölgesi alellerine sahip genotip donörlerinden birincil insan hücrelerinde hücre yapışmasını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu çalışmalar, bu alelik varyantların insan sistemindeki işlevsel etkisinin dikkatli ve nicel bir değerlendirmesine izin vermiştir.