İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Bu prosedürün genel amacı, kayma gerilimi varlığında insan nötrofil adezyonuna olanak tanıyan bir akış odası deneyi kullanarak nötrofil sıkı adezyonunu ölçmektir. Bu işlem, öncelikle saflaştırılmış adezyon moleküllerinden oluşan bir substrat veya insan göbek veni endotel hücreleri gibi bir endotel hücre yüzeyinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, iki katmanlı PHI santrifüj yöntemi kullanılarak insan periferik kanından nötrofillerin ayrılmasıdır.

Ardından, izole edilmiş insan nötrofillerin shear stress altında adezyon ligandlarının veya ve'nin bulunduğu substrata enjekte edilmesini sağlamak için akış odası monte edilir. Son adım, akış odasındaki nötrofil adezyon olaylarının kaydedilmesi ve ardından sıkı adezyonun dikkatli bir şekilde nicellenmesidir. Nihayetinde, akış odası testi, nötrofillerin saflaştırılmış adezyon moleküllerine ve bir HX yüzeyine karşı gösterdiği sıkı adezyonu göstermek için kullanılır.

Bu yöntem, otoimmünite gelişimiyle ilişkili olduğu bilinen doku moleküllerindeki genetik varyasyonların fonksiyonel önemi gibi otoimmünite alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Sistemik lupus eritemozus hastalarıyla yapılan genetik çalışmalar, nötrofillerin sıkı yapışmasında rol oynayan bir protein olan beta 2 integrin varyantları ile güçlü bir ilişki olduğunu göstermiştir. Mac-1 olarak adlandırılan bu beta 2 integrindeki genetik varyasyonun sıkı yapışma üzerindeki fonksiyonel sonuçlarını değerlendirmek için bu analiz sistemini geliştirdik. Akış odasında kullanılmak üzere kültür kaplarını hazırlamak için.

Her bir 35 milimetrelik doku kültürü tabağına bir mililitre fibrin ve jelatin çözeltisi ekleyin ve tüm plaka yüzeyinin kaplandığından emin olmak için birkaç kez pipetleyin. Fazla fibronektin ve jelatin çözeltisini uzaklaştırın ve plakaları en az 30 dakika boyunca havada kurutun. Protein matrisi oluşumunu optimize etmek için, %80 ila %90 konfluense ulaşana kadar kültüre edilmiş insan göbek ven endotel hücrelerini veya qve'leri tripsin EDTA kullanarak hasat edin ve kaplanmış her bir doku kültürü tabağına 500.000 hücre ekleyin.

Her bir kaba iki mililitre büyüme ortamı ekleyin ve 37 °C'de %5 CO2 ortamında inkübe edin. Hücreler günlük olarak görsel olarak kontrol edilmeli ve her iki günde bir ortam değişimi yapılmalıdır. Hücrelerin %80 ila %90 konfluense ulaşmasını bekleyin.

Bu prosedüre başlamak için, 35 milimetrelik bir doku kültürü kabının merkezine bir marker veya kalem kullanarak 0.5 santimetre çapında bir daire çizin. İşaretli alana, 20 µg/mL protein A çözeltisinden 20 µL ekleyin. Protein A çözeltisini 0.5 santimetre çapındaki dairenin içindeki tüm alanı kaplayacak şekilde yaymak için pipet ucunu kullanın.

Kapların yüzeyine dokunmamak veya bunları çizmemek önemlidir. Doku kültürü kaplarını 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, protein kaplanmış her bir plakayı 1 mL PBS ile üç kez yıkayın.

Üçüncü yıkama plakasındaki PBS uzaklaştırıldıktan sonra, plakadaki spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için işaretli alana 50 µL %1 BSA ekleyin. Dört °C'de iki saat inkübe edin. İki saat sonra.

Bloke edilmiş plakayı üç kez 1 mL PBS ile yıkayın. Kaplama ve bu deney için FC adhezyon reseptör ligand kimera protein çözeltilerini hazırlayın; 25 µg/mL konsantrasyonda ICAM-1 FC Kyra ve 0,5 µg/mL konsantrasyonda P-selektin FC Kyra kullanılacaktır. İşaretli alanı 50 µL substrat ile kaplayın ve doku kültürü kaplarını 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Kaplar iki gün içinde kullanılmalı ve kaplanmış alanın kurumasına izin verilmemelidir. Gerekirse, plaka üzerindeki 50 µL çözeltiyi korumak için PBS ekleyin.

Bu çalışma için nötrofiller, yazılı bilgilendirilmiş onam vermiş katılımcıların kanından izole edilir. Kanı flebotomi yoluyla bir antikoagülanlı kan toplama tüpüne veya vakutainer'a topladıktan sonra, kanı PBS ile bire bir oranında seyreltin ve bu prosedürdeki tüm adımları gerçekleştirin. Oda sıcaklığında, 50 mililitrelik santrifüj tüplerinde periferik kan mononükleer hücrelerini (pBMC'ler) ve nötrofilleri ayırmak için iki katmanlı bir fizyolojik çözelti hazırlayın.

İlk olarak, 15 mililitre ağır PHI call ekleyin ve ardından 10 mililitre hafif fi call'u ağır fi call'un üzerine dikkatlice katmanlandırın. Hafif fi call ve ağır fi call katmanları arasında belirgin bir sınır olmalıdır. Son olarak, PHI'yi bozmadan, seyreltilmiş kan örneğinin 25 mililitresini hafif fi call'un üzerine dikkatlice katmanlandırın.

Tüpleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca santrifüj edin; santrifüj sonrası birden fazla tabaka oluşmuş olmalıdır. Az miktarda eritrosit içeren nötrofil tabakası, hafif ve ağır fazlar arasında yer alır. Bir transfer pipeti kullanarak nötrofil tabakasını toplayın, yeni bir 50 mL'lik tüpe aktarın ve son hacim 50 mL olacak şekilde PBS ekleyin.

225 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası oda sıcaklığında, nötrofillerle karışmış kırmızı kan hücreleri hâlâ bulunabilir. Süpernatantı 10 mililitre seviyesine kadar aspire edin.

Yeniden süspande edin. Nötrofil eritrosit peletini düşük hızda kısa süreli vorteksleyerek süspande edin ve ardından 50 mililitre PBS ile tekrar yıkayın; kontamine eritrositleri uzaklaştırmak için süpernatantı aspire edin. Peletlenen hücreleri, kısa süreli düşük hızlı bir vorteks işlemiyle kalıntı PBS içinde yeniden süspande edin.

25 mililitre su ekleyin ve 10 saniye boyunca hafifçe vorteksleyin. Eritrositleri lize etmek için 25 mililitre %1,8 sodyum klorür ekleyin ve hemen 225 ×g kuvvetinde 10 dakika boyunca santrifüjleyerek karıştırın.

Kontamine kırmızı kan hücreleri şimdi liz edilmeli ve geriye beyaz bir nötrofil hücresi peleti bırakılmalıdır. Nötrofil hücresi peletini PBS ile yıkayın, süpernatantı atın ve izole edilen nötrofilleri %10 FBS içeren RPMI mediumu içinde yeniden süspande edin. Hücre konsantrasyonunu bir ışık mikroskobu ve hemositometre ile belirledikten sonra, hücre yoğunluğunu %10 FBS içeren komple RPMI mediumu ile mililitre başına 500.000 hücreye ayarlayın.

Akış odası adezyon deneyi başlatılmadan önce, adezyon molekülleri ekspresyonunu yukarı regüle etmek ve stimüle etmek için VE'leri 20 nanograms per milliliter insan TNF alpha ile dört ila altı saat boyunca prime edin. VE'ler hazır olduğunda akış odasını monte edin. Konfluen VE içeren 35 millimeter kabı mikroskop tablasına yerleştirin.

Bu videonun amaçları doğrultusunda, yalnızca nötrofillerin VE'ye adezyonu incelenecektir; ancak aynı prosedür, nötrofillerin saflaştırılmış adezyon moleküllerine olan adezyonunun çalışılması için de geçerlidir. Paralel plak akış odasını şırınga pompası ve vakum sistemi ile bağlayın ve nötrofil girişi için bir hattı açık bırakın. Akış odasını plağın üzerine yerleştirin ve akış odası düzeneğini sabitleyin. Mikroskoba bağlı bilgisayarda video kayıt programını başlatın.

Tam gelişmiş VE'lerin bulunduğu net bir alan görünene kadar mikroskobun görüş alanını ve odağını ayarlayın. Şırınga pompasını kullanarak akış odasını RPMI besiyeri ile durulayın. Oda içerisinde veya nötrofil giriş hattında hava kabarcığı kalmadığından emin olun.

Nötrofilleri belirlenen hızlarda akış hücresine enjekte etmek için şırınga pompası kullanın. Nötrofil adhezyonu hızla gerçekleşebileceği için videoyu kaydedin; adhezyon olaylarını analiz için nicelendirmek amacıyla genellikle dört ila beş dakikalık bir video yeterlidir. Bu video klibi, nötrofillerin HU E kaplı bir akış hücresine bağlanmasına dair bir örnek göstermektedir.

Adherent hücre, HU e kaplı yüzey üzerinde beş saniye içinde bir hücre çapından daha az hareket eden hücre olarak tanımlanır. Burada, nötrofillerin ICAM one P selektin kaplı veya bir uve kaplı yüzeye tutunmasını gösteren örnek videolardan farklı zaman noktalarına ait ekran görüntüleri yer almaktadır.

Her iki deneyde de nötrofil akış hızı dakikada 350 microliters, nötrofil yoğunluğu ise mililitre başına 500, 000 hücredir. Tipik koşullar altında, dört dakikalık bir kayıt süresi boyunca 50 ila 70 insan nötrofilinin ligand veya VE kaplı yüzeye sıkıca yapıştığı gözlemlenmiştir. Bununla birlikte, farklı donörlerle benzer uzunlukta videolar kaydedildiğinde, nötrofil adezyon moleküllerinin alelik varyantlarının veya substrattaki alelik varyantların kantitatif nötrofil adezyonunu önemli ölçüde değiştirebileceği görülmüştür.

Nötrofiller için, farklı donörler arasındaki adezyon özelliklerini karşılaştırmak amacıyla dakika başına yapışan hücre sayısı hesaplanabilir. Bu prosedürü uygularken, izolasyon kaynaklı hücre aktivasyonunun neden olduğu hücre kümelenmelerini nötrofillerde görsel olarak kontrol etmeyi hatırlamak önemlidir. Ayrıca, hücrelerin aktivasyon durumunun donörler ve deneyler arasında eşleştiğinden emin olmak için paralel akış sitometrik hücre aktivasyon değerlendirmesi yapılabilir.

Bu teknik, otoimmünite alanındaki araştırmacıların, beta iki integrin MAC-1'in CD 11 B zincirinin farklı kodlama bölgesi alellerine sahip genotipik donörlerden alınan primer insan hücrelerinde hücre adhezyonunu incelemelerinin önünü açmıştır. Bu çalışmalar, söz konusu allelik varyantların insan sistemindeki fonksiyonel etkisinin dikkatli ve kantitatif bir şekilde değerlendirilmesine olanak sağlamıştır.