Antiviral Pattern Recognition reseptörler Rig-I Ve PKR By Limited Proteaz Sindirim ve Yerli PAGE izlenmesi aktivasyonu

Viral enfeksiyonlara karşı doğuştan gelen savunmalar, örüntü tanıma reseptörleri veya PRR'ler tarafından tetiklenir. Bunlar, bir enfeksiyon sırasında doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücrelerinde bulunur. Sitoplazmik PRR'ler olan RIG-I ve PKR, viral imza RNA'larına bağlanır, konformasyon değiştirir, oligomerize olur ve antiviral sinyallemeyi aktive eder. RIG-I ve PKR konformasyonel değişikliklerini ve oligomerizasyonunu izlemek için, in vitro insan A549 hücreleri Rift Vadisi ateşi virüsü ile enfekte edilir.

PRR aktivasyonunu stimüle etmek için Klon 13 kullanılır. Ardından, RIG-I ve PKR konformasyonel değişikliklerini analiz etmek amacıyla kontrol ve enfekte hücrelerin hücre lizatları hazırlanır. Sınırlı bir tripsin sindirimi gerçekleştirilir.

Protein yapısında konformasyonel değişiklikler meydana gelmişse, protein sindirime karşı daha dirençli hale gelir ve tüm oligomerizasyon oluşumunu analiz etmek için yapılan native PAGE işlemini takiben uygulanan Western blotting analizi ile bantlar görülür. Eğer tam ligasyon gerçekleşmişse, daha yüksek ağırlıklı oligomerler ve PKR kompleksleri görülür. Sınırlı proteaz sindirimi ve native PAGE yöntemlerinin temel avantajı, bu tekniklerin RIG-I ve PKR aktivasyonunun doğrudan ölçülmesini kolaylaştırmasıdır.

Bu yöntemler, RIG-I ve PKR aktivasyonu için ilgili olan RNA türlerinin tam doğası ve kökeni gibi doğal bağışıklık alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemler, RIG-I ve PKR agonistleri hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca, laboratuvarımdan doktora öğrencisi Mila Viva'nın bu prosedürü başlatmadan önce göstereceği üzere, MDA5 gibi diğer sitoplazmik sensör proteinlerine de uygulanabilirler.

Lütfen bundan sonra CL 13 olarak anılacak olan Rift Valley Ateşi virüsü klon 13'ün, Almanya'da BSL iki koşulları altında işlem görmesi gereken atenüe bir virüs mutantı olduğunu unutmayın. PBS serumsuz ortamı ve %5 FCS içeren hücre kültürü ortamını önceden ısıtın. Bunları 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde su banyosuna yerleştirin. 2,5 x 10⁶ hücreyi enfekte etmek için serumsuz ortamda mililitre başına 1,25 x 10⁷ PFU olacak şekilde CL 13 hazırlayın.

Beşlik bir enfeksiyon çokluğu veya MOI ile A 5 49 hücreleri için, pipetleme hatalarını hesaba katarak ihtiyaç duyulandan yaklaşık %10 daha fazla hazırlayın. A 5 49 hücrelerini inkübatörden çıkarın, besiyerini aspire edin ve 10 milliliters PBS ekleyin; hücreleri yıkamak için kültür flaskını çalkalayın veya eğin ve ardından PBS'yi uzaklaştırın. Ardından, seyreltilmiş CL 13'ten bir milliliter veya enfekte edilmemiş kontrol veya yalancı enfeksiyon (mock infection) için ilgili çözeltiyi ekleyin.

Bir mililitre serumsuz ortam ekleyin ve her 15 dakikada bir olacak şekilde bir saat boyunca inkübe edin. Ortamın eşit dağıldığından emin olmak için flaskı dikkatlice eğin. Bir saatlik enfeksiyondan sonra, inokülumu uzaklaştırın.

%5 FCS içeren ön ısıtılmış hücre kültür ortamından beş mililitre ekleyin ve beş saat boyunca inkübe edin. %0,5 tritton X 100 içeren PBS hazırlayın ve dört santigrat derecede bekletin. Suriye proteaz inhibitörleri eklemeyin.

Ardından, hücreleri soğuk PBS ile yıkayın ve 10 mililitre taze PBS ekleyin. Daha sonra, bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri kaptan ayırın. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında, 800 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüj sonrası süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini 0,5% Triton X 100 içeren 30 µL PBS içinde yeniden süspande edin. Lizatı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın ve buz üzerinde en az 10 dakika inkübe edin. Lizatı 4 °C'de 10 dakika boyunca 10.000 ×g hızda santrifüjleyin.

Santrifüj işleminden sonra, berraklaştırılmış hücre lizatını yeni bir tüpe aktarın. Berraklaştırılmış hücre lizatındaki protein konsantrasyonunu belirlemek için bir Bradford testi gerçekleştirin. Minus 20 degrees Celsius'ta saklayın veya protein yapısal değişikliklerini test etmek için hemen tripsin sindirimi veya native PAGE aşamasına geçin. Öncelikle L1'i, PBS içerisinde nihai çalışma konsantrasyonu 2 µg/mL olacak şekilde chloro, methyl ketone işlem görmüş veya TPCK tripsin ile seyreltin. Her durum için iki yeni tüpte, CL 13 ve enfekte olmamış kontrol protein lizatlarının nihai protein konsantrasyonunu, PBS ile 9 µL nihai hacimde 25 µg'a ayarlayın; lizat setlerinden biri girdi kontrolü olarak kullanılacak, diğeri ise TPCK tripsin ile işleme tabi tutulacaktır. İşlem görmemiş kontrol tüplerinin geri kalan ikisine 1 µL PBS ekleyin.

Final konsantrasyonu 0,2 µg/µL'ye getirmek için, 2 µg/µL TPCK tripsinden bir mikrolitre ekleyin. Reaksiyonları pipetleme yoluyla karıştırın. Lizatları 37 °C'de 25 dakika boyunca inkübe edin.

Beş x denatüre örnek tamponu ekleyerek ve ardından 95 °C'de beş dakika boyunca kaynatarak reaksiyonu durdurun. Tripsin inkübasyon süresini uzatmamak önemlidir. Eğer dirençli proteinler tespit edilemezse veya çok fazla tespit edilirse, arka plan gürültüsü olmadan dirençli fragmanların saptanması için tripsin sindirim süresinin hassas zamanlamasının kritik olduğunu unutmayın ve sindirim süresini buna göre ayarlayın.

Kaynatma işleminden sonra örnekleri -20 °C'de saklayın veya örnekleri, %12'lik ayırıcı jel üzerinde %5'lik yığma jelden oluşan iki sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jele yükleyin. Bromofenol mavisi tamamen ilerleyene kadar proteinleri jel başına 25 mA akımda ayırın.

Jeller çalıştırıldıktan sonra, proteinleri bir jelden polivinil florür membrana aktarın ve RIG-I ile PKR'ye yönelik antikorlar kullanarak western blotting ile analiz edin; diğer jeli Coomassie Brilliant Blue G-250 ile boyayın. Ardından jeli %25 etanol, %8 asetik asit ve %4 gliserol içeren solüsyonda 4 °C'de saklayın veya görüntüleme ve analiz aşamasına geçin. Örüntü tanıma reseptörlerinin oligomerik durumlarını analiz etmek için, PBS ile 10 µL son hacimde 50 µg hücre lizatı hazırlayın ve son konsantrasyonu 1x olacak şekilde 5x örnek tamponu ekleyin.

Numuneleri, %5 yığma (stacking) ve %8 ayırma (resolving) jeline sahip bir doğal poliakrilamid jele hemen yükleyin. Herhangi bir gecikme, doğal komplekslerin kaybına yol açacaktır. Jeli, dört santigrat derecede, jel başına 20 miliamperde çalıştırın.

Bromofenol mavisi bandı jelden ayrıldıktan 45 dakika sonra, toplamda yaklaşık 1,5 ila iki saatin ardından elektroforezi durdurun ve ardından konformasyonel değişimi değerlendirmek için beraberindeki dokümanda açıklandığı şekilde rig-I ve PKR'ye karşı yöneltilmiş antikorları kullanarak Western blotting gerçekleştirin. Bir viral agonistinin rig-I veya PKR tarafından tanınmasıyla tetiklenen oligo üretimi için sınırlı proteaz sindirimi ve native page, bu videoda açıklandığı şekilde gerçekleştirilmiştir; mock enfekte hücre lizatlarının tripsin sindirimi rig-I'in hızlı yıkımıyla sonuçlanırken, clone 13 enfeksiyonu 30 kilodaltonluk dirençli bir rig-I fragmanının oluşmasına yol açmıştır. PKR da enfekte örneklerde tripsin sindirimine karşı kısmi direnç göstermektedir ve bu durum fosforilasyonu ile örtüşmektedir. Tripsin sindiriminin verimliliğini ve özgünlüğünü izlemek için jeller kumasi brilliant blue G 250 ile boyanmıştır. İşlem görmemiş örnekler eşit miktarda yüklenmiş proteinler göstermektedir; mock ve C 13 hücre lizatlarının tripsin sindirimine tabi tutulması, global protein miktarlarında benzer bir azalmaya yol açar.

Bu durum, tripsinle işlemenin enfekte edilmemiş hücrelerde hem mock hem de CL 13 enfekte örnekler için aynı verimliliğe sahip olduğunu göstermektedir. Ek bir kontrol olarak yalnızca R EYE ve PKR monomerleri tespit edilmiştir. Monomer formda bulunan ancak R Eye aracılığıyla aktivasyon sonrası dimerize olduğu bilinen transkripsiyon faktörü IRF three de dahil edilmiştir.

Klon 13 enfeksiyonu, bir yayma şeklinde güçlü bir RIG-I oligomerik kompleks birikimine ve tanımlanmış bir protein bandı olarak PKR ve IRF3 dimerleri veya oligomerlerine yol açar. Bu sonuçlar, sınırlı tripzin sindirimi ve doğal PAGE'in, enfeksiyon sonrası RIG-I ve PKR'nin konformasyonel değişikliklerini ve oligo oluşumunu izlemek için yararlı araçlar olduğunu göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, RIG-I ve PKR konformasyonel geçişlerini ve oligomerizasyonunu nasıl izleyeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu teknik, şu prosedür takip edilerek iki gün içinde tamamlanabilir. Geliştirme aşamasından sonra uyarıcı ligandla stabil bir etkileşim olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için pro assay gibi yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, doğuştan gelen bağışıklık alanı araştırmacılarının, viral uyarılmış hücrelerdeki örüntü tanıma reseptörlerinin aktivasyon durumunu keşfetmelerine yol açmıştır.