Antiviral Pattern Recognition reseptörler Rig-I Ve PKR By Limited Proteaz Sindirim ve Yerli PAGE izlenmesi aktivasyonu

Viral enfeksiyonlara karşı doğuştan gelen savunmalar, örüntü tanıma reseptörleri veya prr'ler tarafından tetiklenir. Bir enfeksiyon sırasında doğuştan gelen bağışıklık sisteminin hücrelerinde bulunur. Sitoplazmik PRRS, rig göz ve PKR, viral imza RNA'larına bağlanır, tüm liga gözlerinin onayını değiştirir ve rig eye ve PKR onay değişikliklerini izlemek için antiviral sinyali aktive eder ve tüm ligamentizasyon in vitro insan A 5 49 hücreleri Rift Valley ateşi virüsü ile enfekte olur.

PRR aktivasyonunu uyarmak için klon 13. Kontrol ve enfekte hücrelerin hücre lizatları daha sonra teçhizat gözü ve PKR onay değişikliklerini analiz etmek için hazırlanır. Sınırlı bir sindirim denemesi yapılır.

Protein yapısında doğrulayıcı değişiklikler meydana gelmişse, protein sindirime karşı daha dirençlidir ve Western blotting ile bantlar görülecektir. Allgas native sayfasının oluşumunu analiz etmek için analiz analizi yapılır ve ardından western blotting analizi yapılır. Tüm ligamentizasyon daha yüksek gerçekleşmişse, tüm liga rig göz ve PKR kompleksleri görülür. Sınırlı proteaz sindiriminin ve yerel sayfanın ana avantajı, bu tekniklerin rega ve PKR aktivasyonunun doğrudan ölçümünü kolaylaştırmasıdır.

Bu yöntemler, doğuştan gelen bağışıklık alanında, rig eye ve PKR aktivasyonu ile ilgili RNA türlerinin tam doğası ve kökeni gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemler, rig eye ve PKR agonistleri hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca, MDA beş gibi diğer sitoplazmik sensör proteinlerine de uygulanabilirler, bu da prosedürün bu işleme başlamadan önce laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Mila Viva olacağını gösterir.

Bundan sonra CL 13 olarak anılacak olan Rift Valley Fever virüs klonu 13'ün, Almanya'da PBS serum içermeyen ortamı ve %5 FCS içeren hücre kültürü ortamını önceden ısıtmak için BSL iki koşulu altında ele alınması gereken zayıflatılmış bir virüs mutantı olduğunu lütfen unutmayın. Onları 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde bir su banyosuna yerleştirin. Serum serbest ortamda CL 13'ün mililitresi başına 10 ila yedinci PFU'yu 1.25 kez 10 ila altıncı kez enfekte etmek için 2.5 kez 10 ila altıncı kez hazırlayın.

Çok sayıda enfeksiyona veya MOI'ye sahip 5.49 hücre, pipetleme hatalarını hesaba katmak için gerekenden yaklaşık %10 daha fazla hazırlık yapar. A 5 49 hücrelerini inkübatörden çıkarın, ortamı aspire edin ve 10 mililitre PBS girdabı ekleyin veya hücreleri yıkamak için kültür şişesini eğin ve ardından PBS'yi çıkarın. Daha sonra, seyreltilmiş CL 13'ten bir mililitre veya enfekte olmamış kontrol veya sahte enfeksiyon için ekleyin.

Bir mililitre serumsuz ortam ekleyin ve her 15 dakikada bir bir saat inkübe edin. Ortamın eşit dağılımını sağlamak için şişeyi dikkatlice eğin. Bir saatlik enfeksiyondan sonra, inoküler çıkarın.

% 5 FCS ile beş mililitre ön ısıtma hücre kültürü ortamı ekleyin ve beş saat inkübe edin. PBS'yi %0,5 tritton X 100 ile hazırlayın ve dört santigrat dereceye yerleştirin. Suriye proteaz inhibitörleri eklemeyin.

Daha sonra, hücreleri soğuk PBS ile yıkayın ve 10 mililitre taze PBS ekleyin. Daha sonra bir hücre kazıyıcı kullanarak, hücreleri tabaktan ayırın. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 800 kez G'de santrifüjleyin.

Döndürmeden sonra, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini %0,5 Triton X 100 ile 30 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Lizatı 1,5 mililitrelik taze bir tüpe aktarın ve buz üzerinde en az 10 dakika inkübe edin. Lizatı dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, arıtılmış hücre lizatını yeni bir tüpe aktarın. Eksi 20 santigrat derecede arıtılmış hücre lizat Deposundaki protein konsantrasyonunu belirlemek için bir Bradford testi yapın veya hemen denemeye ve sindirmeye devam edin veya örüntü tanıma reseptörlerinin onaylayıcı değişikliklerini test etmek için yerel sayfa önce L'yi seyreltin bir tosto kloro, metil keton muamele edilmiş veya TPCK tripsin PBS'de her koşul için iki yeni tüpte mililitre başına iki mikrogramlık bir nihai çalışma konsantrasyonuna kadar, CL 13 ve enfekte olmayan kontrol proteini lizatlarının nihai protein konsantrasyonunu, PBS ile dokuz mikrolitrelik bir son hacimde 25 mikrograma ayarlayın, bir lizat seti bir giriş kontrolü olarak kullanılacak ve diğeri tedavi edilmemiş kontrol tüplerine TPCK tripsin ile muamele edilecektir. Kalan iki tüpe bir mikrolitre PBS ekleyin.

Nihai konsantrasyonu mikrolitre başına 0.2 mikrograma getirmek için mikrolitre başına iki mikrogram TPCK tripsin ekleyin. Reaksiyonları pipetleme ile karıştırın. Lizatları 37 santigrat derecede 25 dakika inkübe edin.

Beş x denatüre edici numune tamponu ekleyerek ve ardından 95 santigrat derecede beş dakika kaynatarak reaksiyonu durdurun. Tripsin inkübasyon süresini uzatmamak önemlidir. Tripsin sindiriminin kesin zamanlamasının, dirençli proteinler tespit edilmezse veya çok fazla tespit edilirse, ayarlanmış sindirim süresi varsa, herhangi bir arka plan olmadan dirençli fragmanların tespiti için kritik öneme sahip olduğunu unutmayın. Buna göre.

Kaynattıktan sonra numuneleri eksi 20 santigrat derecede saklayın veya numuneleri iki sodyum uysal sülfat üzerine yükleyin. %12 çözünen jel üzerine %5 istifleme jelinden oluşan poli akrilamid jeller. Bromo fenol mavisi bitene kadar proteinleri jel başına 25 miliamperde ayırın.

Jelleri çalıştırdıktan sonra, proteinleri bir jelden bir poli asma florür membranına aktarın ve rig eye karşı yönlendirilmiş antikorlarla western blotlama ile analiz edin ve diğer jeli kumasi brilliant blue G two 50 ile PKR boyayın. Daha sonra jeli %25 etanol, %8 asetik asit ve %4 gliserol içinde dört santigrat derecede saklayın veya görüntüleme ve analiz yapmaya devam edin. Örüntü tanıma reseptörlerinin oligomerik durumlarını analiz etmek için, PBS ile 10 mikrolitrelik bir son hacimde 50 mikrogram hücre lizatı hazırlayın ve bir x'lik bir nihai konsantrasyona beş x numune tamponu ekleyin.

Numuneleri hemen %5 istifleme ve %8 çözünen jel içeren doğal bir poli akrilamid jel üzerine yükleyin. Herhangi bir gecikme, yerel komplekslerin kaybına neden olacaktır. Jeli dört santigrat derecede jel başına 20 miliamperde çalıştırın.

Bromo fenol mavi bandı jeli terk ettikten 45 dakika sonra elektroforezi durdurun, her seferinde yaklaşık 1.5 ila iki saat sonra, ekteki belgede açıklandığı gibi rig eye ve PKR'ye yönelik antikorlar kullanılarak Western blotlama, bir viral agonistin rig eye veya PKR ile tanınmasıyla indüklenen oligo ve sınırlı proteaz sindirimi ve yerel sayfa bu videoda anlatıldığı gibi gerçekleştirildi, Sahte enfekte hücre lizatlarının tripsin sindirimi, rig gözünün hızlı bir şekilde bozulmasına neden olurken, klon 13 enfeksiyonu, 30 kilodaltonluk dirençli bir rig göz parçasının üretilmesine yol açtı. PKR ayrıca, enfekte olmuş örneklerde tripsin sindirimine karşı kısmi direnç gösterir, bu da tripsin sindiriminin verimliliğini ve özgüllüğünü izlemek için fosforilasyonu ile çakışır, jeller kumasi brilliant blue G two 50 ile boyanmıştır. İşlenmemiş numuneler, eşit miktarda yüklü protein gösterir, sahte ve C 13 hücre lizatlarını tripsin sindirimine tabi tutarak, küresel protein miktarlarında karşılaştırılabilir bir azalmaya yol açar.

Bu, tripsin tedavisinin, enfekte olmayan hücrelerde sahte ve CL 13 ile enfekte olmuş örnekler için aynı etkinliğe sahip olduğunu göstermektedir. Ek bir kontrol olarak sadece R EYE ve PKR monomerleri tespit edildi. Bir monomer olarak mevcut olan, ancak R Eye yoluyla aktivasyon üzerine dimerize olduğu bilinen transkripsiyon faktörü IRF üç dahil edildi.

Klon 13 enfeksiyonu, bir smear şeklinde rig göz oligomerik komplekslerinin ve tanımlanmış bir protein bandı olarak PKR ve IRF üç dimer veya oligomerlerin güçlü bir birikimine yol açar. Bu sonuçlar, sindirim ve yerel sayfadaki sınırlı yolculukların, enfeksiyon üzerine rig göz ve PKR'nin doğrulayıcı değişikliklerini ve oligo oluşumunu izlemek için yararlı araçlar olduğunu göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, ustalaştıktan sonra WIC gözü ve PKR onay değiştirme ve izasyonu nasıl izleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Bu teknik, bu işlemi takip eden iki gün içinde yapılabilir. Bir yöntem olarak, pro gibi bir yöntem olarak, geliştirilmesinden sonra uyarıcı ligand ile stabil bir etkileşim olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için testler yapılabilir. Bu teknik, doğuştan gelen bağışıklık alanındaki araştırmacıların, viral uyarılmış hücrelerde örüntü tanıma reseptörlerinin aktivasyon durumunu keşfetmelerinin yolunu açtı.