Hücre ve Doku mechanobiology Applications A Novel Germe Platformu

Bu prosedürün genel amacı, karmaşık mekanik deformasyona tek hücre tepkilerini araştırmak ve biyolojik dokuların mekanik özelliklerini ölçmek için kullanılabilecek bir izotropik germe platformunun yeniliğini göstermektir. Bu, önce esnek membranın imal edilmesi ve bu membranın bir dizi kelepçe üzerine monte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, gece boyunca zar üzerinde C iki C 12 hücresi kültürlemek ve ertesi gün kelepçeleri germe platformuna monte etmektir.

Daha sonra, ikinci bir deney setinde, torasik aort dokuları bir fare modelinden reddedilir ve herhangi bir bağ dokusundan temizlenir. Daha sonra aort dokusu, farklı bir kelepçe seti kullanılarak germe platformuna monte edilir. Sonuç olarak, germe platformu, ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak ölçülebilen iki ortogonal yön boyunca hücrelerde bir deformasyonu indüklemek için kullanılır.

Veya alternatif olarak, doku sertliğini ölçmek için germe cihazına bir kuvvet dönüştürücü entegre edilir. Bu tekniğin, tek gerçek veya çift eksenli hücre germe gibi mevcut tekniklere göre en büyük avantajı, hücrelerin bağlı olduğu şeffaf bir zarda iki ortogonal yöndeki deformasyonu bağımsız olarak kontrol etmemize ve dolayısıyla canlı hücre görüntülemeye izin vermesidir. Mikroskopi ayrıca farklı bir kelepçe setinin dikkatli bir şekilde tasarlanması.

Dört telli bir kullanıcının platforma entegrasyonu ile, mekanik özelliklerinin nicelleştirilmesi için biyolojik doku üzerinde 10 hücre testi yapmamıza olanak tanır. Bu video, hücresel düzeyde substrat deformasyonunun etkisini araştırmak ve biyolojik dokular üzerinde çekme testleri yapmak için kullanılabilecek özel yapım bir aparat olan Çift Eksenli Germe platformunu sunmaktadır. Çift eksenli germe platformunun tasarımı ve özellikleri, tek hücrelerin mekanik deformasyonunun etkisini araştırmak için ekteki el yazmasında detaylandırılmıştır, önce hücrelerin yapışabileceği esnek ve şeffaf bir substrat üretilmelidir.

Bu işleme başlamak için, 500 mikrolitre floresan mikroküre çözeltisini 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin ve 16, 200 Gs'de santrifüjleyin 10 dakika boyunca, süpernatı atın ve 500 mikrolitre izopropanol ekleyin, ardından beş dakikalık girdaplama yapın. Ertesi sabah herhangi bir büyük partikül agregasının tortulaşmasına izin vermek için şişeyi gece boyunca karanlıkta bir kenara koyun, SNAT'ı dikkatlice temiz bir mikro santrifüj şişesine aktarın. Bu boncuk çözeltisi, beşten fazla alt tabakayı imal etmek için kullanılabilir, çünkü boncuk çözeltisi önümüzdeki üç gün boyunca tortulaşmaya devam edecektir.

Resus'un peleti askıya almasını önlemek önemlidir. PDMS kiti ile birlikte verilen 0,5 gram kürleme maddesini 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj şişesine dökün. 15 mikrolitre floresan boncuk ekleyin ve bir dakika boyunca girdap yapın.

Toplam 90 mikrolitre boncuk eklemek için bunu beş kez daha tekrarlayın Bir kenara koyun. 10 gram PDMS tartın, floresan boncuklarla desteklenmiş 0.5 gram kürleme maddesi ekleyin ve en az 12 dakika karıştırın. Daha sonra, boncuklarla birlikte dört miligram PDMS'yi daha önce standart fotolitografi teknikleri kullanılarak üretilmiş SUH 2050 çapraz şekilli bir kalıba aktarmak için transfer pipetini kullanın.

Küf 320 mikrometre yüksekliğe ve 13.4 santimetre kare alana sahiptir ve 428 mikrolitre veya 440 miligram PDMS içerebilir, PDMS'yi 80 santigrat derecede iki saat boyunca iyileştirir. Sertleştikten sonra, alt tabakayı kalıptan soyun, alt tabaka, önemli değişiklikler ve mekanik özellikleri göstermeden iki hafta boyunca oda sıcaklığında bir Petri kabında tutulabilir. Son boyutu yaklaşık dört milimetre çapında bir Petri kabına PDMS damlacıklarını dökün, 80 santigrat derecede iki saat boyunca baş aşağı sertleştirin, kürleme işlemi sırasında damlaların düzleşmesini önlemek için çanak baş aşağı tutulmalıdır.

Bu ankraj özellikleri haftalarca bir Petri kabında saklanabilir. Hava plazması, alt tabakayı ve sekiz ankraj özelliğini işler, alt tabakanın her iki ucundaki özellikleri, zarı kelepçelere monte etmek için alt tabaka üzerinde bulunan kare şeklindeki girintiden dört milimetre mesafede bağlar. Alt tabakanın her iki ucunu kelepçelerin oluk silindirik kısmının etrafına sarın ve üstten iki ayar vidasıyla yerine sabitleyin.

Dört kelepçeyi kelepçe tutucusuna vidalayın. Ardından, alt tabaka ile kelepçelerin yivli kısmı arasındaki arayüze PDMS'yi dökün. Kürlenmemiş PDMS'yi 1.5 milimetrelik bir altıgen anahtar kullanarak yivli silindirik parçanın etrafına yayın.

PDMS'yi kılcal hareketle tamamen dolana kadar oluklara dökün ve zar üzerindeki hücreleri tohumlamadan önce düzeneği iki saat boyunca 80 santigrat derecede sertleştirin. Hava plazması. Kollajen kaplamaya izin vermek için alt tabakayı sterilize etmek ve işlevsel hale getirmek için tüm düzeneği işlemden geçirin.

Hücrelerin bir saat boyunca oda sıcaklığında mililitre başına 0.02 mikrogram sıçan kuyruğu kollajeni ile desteklenmiş bir mililitre 16 molar asetik asit ile tohumlanacağı substrat alanını işlevselleştirin. İstenen nihai kollajen yoğunluğu santimetre kare başına beş mikrogramdır Bir saat sonra, substratı fosfat tamponu ile üç kez durulayın ve oda sıcaklığında en az 10 dakika kurumaya bırakın. % 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin ile desteklenmiş 40 mikrolitre kültür ortamı ekleyin.

Bir santimetre karelik bir alanı kaplamak için substratın orta kısmında 2000 hücre içeren streptomisin. Bu örnekte, hücre yoğunluğu santimetre kare başına 20 hücredir. Bununla birlikte, hücre yoğunluğu deneysel gereksinimlere göre değiştirilebilir.

Tüm düzeneği, üzerinde hücre içeren kültür ortamı damlası ile substrat yukarı bakacak şekilde standart bir hücre kültürü inkübatörüne koyun. Düzenek, buharlaşmayı önlemek için hücrelerin ona sıkıca yapışmasını sağlamak için alt tabaka yukarı bakacak şekilde en az üç saat tutulmalıdır. Alt tabaka üzerindeki damlaya 30 mikrolitre ılık kültür ortamı eklenir.

Üç saat sonra her 45 dakikada bir, hücrelerin ertesi gün çoğalmasına izin vermek için substratı gece boyunca inkübe etmek için tüm düzeneği taze kültür ortamıyla dolu bir Petri kabına çevirin. Kurulumu ters faz kontrastı veya floresan mikroskobu üzerine monte edin. Kelepçe alt tabaka tertibatını iki eksenli germe platformuna monte edin ve motorlar, Petri kabı ısıtıcısının içindeki Petri kabını yeni hazırlanmış bir HEP tamponlu tuz çözeltisi ile doldurur.

Bu fizyolojik çözüm, normal doku kan ortamını taklit ederek hücreleri mikroskop aşamasında tutmak için kullanılır. Aynı iki eksenli germe platformu, küçük doku örneklerinin sertliğini ölçmek için de kullanılabilir. Bu gösteride izole fare aortları kullanılacaktır.

Dokuya zarar verme riskini en aza indirmek için diyaframı, göğüs kafesini ve akciğer loblarını ötenazi uygulanmış fareden çıkarın. Kalbi aorta bağlı tutun ve damara doğrudan dokunmaktan kaçının, ancak manipüle edin. Kalbi kullanmak.

Dokunun iç yapısını sağlam tutmak için damar ve omurga arasında nazikçe keserek kalbi, aort kökünü ve torasik aortu çıkarın. Kesi sırasında damarda herhangi bir uzamaya neden olmamaya dikkat edin. Kalbi ve aortu hemen günlük olarak hazırlanan ve deneyler sırasında 37 santigrat derecede tutulan Krebs solüsyonuna daldırın ve saklayın.

Cerrahi diseksiyon mikroskobu altında çalışan kan pıhtılarını gidermek için aortu Krebs solüsyonunda kesin ve dikkatlice yıkayın. Mikro makas ve cımbız kullanarak bağ dokusunu çıkarın. Damar oryantasyonunu belirlemek için tüm damar uzunluğunu korumak ve aort kökünü kullanmak önemlidir.

Boşaltılan gemi boyutları, geminin sertliğini belirlemek için gereklidir. Yaklaşık iki milimetre uzunluğunda bir aort halkası kesin ve kalibre edilmiş bir mikroskop ayarı kullanarak uzunluğunu hassas bir şekilde ölçün. Kreb'in çözümünde bu segmenti bir kenara koyun.

Daha sonra, iki milimetrelik segmentin çıkarılmasından sonra kalan aort bölümlerinden iki küçük aort halkası kesin. İki milimetrelik segmentten önceki aort bölümünden bir halka ve aort bölümünden başka bir halka. İki milimetrelik segmentten sonra, her iki aort halkasını lümen yukarı bakacak şekilde bir mikroskop cam lamına yerleştirin ve kalibre edilmiş bir mikroskop ayarı kullanarak duvar kalınlığını ölçün.

Aort duvar kalınlığı bu iki halka kullanılarak ölçülür ve ortalaması alınır. Çift eksenli germe platformundaki Petri kabını Krebs solüsyonu ile doldurun ve iki milimetrelik aort halkası segmentini çekme pimlerine yerleştirin. Bu protokolde, %25 yer değiştirme deformasyonuna maruz kalan tek fare miyoblast hücrelerinde çekirdeğin mekanik tepkisini araştırmak için Çift eksenli germe platformu kullanıldı.

Standart ve saf tek eksenel gerdirme performansından elde edilen ilişkiler bu temsili sonuçlarda gösterilmiştir. Floresan boncuklar videonun ilk karesinde manuel olarak seçilir ve yatay ve dikey yönler boyunca maksimum esnemeye ulaşılana kadar bir kareden diğerine izlenir. Bir MATLAB komut dosyası, her çerçeve için yeşil gerinim tensörünün bileşenlerini otomatik olarak hesaplar ve motor yer değiştirmesine göre gerinimin bir kalibrasyon eğrisini üretir.

Bu grafiklerde, mavi ve kırmızı çizgiler, sırasıyla yatay ve dikey yönler boyunca yeşil gergin heer bileşenine karşılık gelir. Bu sonuçlar, Çift Eksenli germe platformunun, alt tabakada iki ortogonal yön boyunca bir deformasyona neden olma yeteneklerini göstermektedir. EQU Çift eksenli gerinim alanlarının standart tek eksenel yapısına ek olarak, çift eksenli gerinim platformu, alt tabakada karmaşık gerinim alanlarını indükleyebilir.

Panel G, aynı alt tabakanın x ekseni boyunca dört milimetre gerilmesinin ve Y ekseni boyunca kırmızıyla vurgulanan 1,5 milimetre hafifçe gerilmesinin, alt tabakada basınç deformasyonu olmayan saf bir tek eksenli alan ürettiğini göstermektedir. Panel, H, alt tabakanın x ekseni boyunca 3,5 milimetre gerilmesinin, alt tabakanın dikey eksen boyunca uçları sabitlendiğinde %25'lik bir deformasyon ve %7'lik bir basınç deformasyonu ürettiğini gösterir, kırmızı ile vurgulanmıştır Germe sırasında canlı hücre mikroskobu görüntüleme yapabilme özelliği ile çekirdekler, DNA'yı bağlayan canlı hücre floresan boyası ile boyandı ve daha sonra her bir ortogonal germe ekseni boyunca %25 oranında gerildi. Burada gösterildiği gibi, her bir gerilme döngüsü aşaması arasında, şekillenmemiş ve deforme olmuş çekirdeğin kontrast görüntüleri ve epi floresan görüntüleri elde edildi. Biçimlendirilmemiş durum boyunca ve çekirdeğin ana ve küçük ekseni boyunca sırayla gerildiği zaman büyük ve küçük nükleer eksenin uzunlukları, bir görüntü J eklentisi kullanılarak belirlendi ve uzunluktaki nispi değişimi hesaplamak için kullanıldı.

Bu çubuk grafikteki her eksen boyunca, X veya ana eksen mavi renkle gösterilir ve y veya küçük eksen kırmızı ile gösterilir. Çekirdeğin deformasyon kabiliyeti, ana eksenine kıyasla, minör ekseni boyunca önemli ölçüde daha yüksek bir deformasyon kabiliyeti gösterdiği için mekanik bir anizotropi sergiler, aktin ve mikrotübüllerin hücre iskeletinin nükleer deformasyon kabiliyetini düzenlemedeki rolü, aktin filamentlerinin veya mikrotübüllerin seçici olarak sito D ve neol depolimerize edilerek depolimerize edilmesiyle incelenmiştir. Aktin filamentlerinin veya mikrotübüllerin, çekirdeğin anizotropik de şekillendirilebilirliğinde bir kayba neden olduğu bulundu.

Bu sonuçlar, hücre iskeleti bileşenlerinin substrattan çekirdeğe kuvvet ilettiği ve ayrıca çekirdeğin doğal mekanik davranışını korumak için gerekli olduğu bulgularını desteklemektedir. Deformasyon sırasında, ısı şoku proteini 27 veya HP 27'nin kronik aşırı ekspresyonunun damar sertliği HSP aşırı ekspresyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için iki eksenli germe platformu da kullanıldı. Ateroskleroza eğilimli bir fare modelinde, bir POE homozigot negatif, intimal düz kas hücrelerini ve kollajen içeriğini artırarak ateroskleroz lezyonlarının histolojik bileşimini değiştirir.

Bu histolojik yeniden şekillenmenin damar mekanik özellikleri üzerindeki etkisini belirlemek için, aort sertliğini ölçmek için germe platformu kullanıldı. Bu grafik, bir aort damarının gerilmesinden elde edilen tipik bir gerilme eğrisini gösterirken, sertlik gerilmenin %30'unda hesaplanır. Sertlik, kırmızı çizgi ile gösterilen teğetin eğriye olan eğimidir.

HSP 27'nin aort segmentlerinin eksprese eden farelere göre sertliğinin, kontrol faresi modeline kıyasla %41 oranında önemli ölçüde arttığı bulundu. Birlikte ele alındığında, damar ve plak histolojisi ile birlikte yapılan mekanik değerlendirme, HSP 27'nin aşırı ekspresyonunun artmış damar sertliği ve kollajen düz kas hücresi içeriği ile karakterize olduğunu gösterdi. Bu sonuçlar, HSP 27'nin aterosklerotik lezyonların stabilitesini potansiyel olarak artırabileceğini ve dolayısıyla geliştikten sonra plak rüptürü riskini azaltabileceğini düşündürmektedir.

Bu teknik, biyomühendislik alanındaki araştırmacıların, mekanik biyolojideki uygulamalar için karmaşık ve inotropik mekanik deformasyona hücre tepkisini keşfetmesi ve aynı zamanda hastalıkta biyolojik doku mekaniğini izlemesi için yeni bir yol sunar.