Name: Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-20T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Öğrenin, akut hipokampal kesitler ve konfokal mikroskopi kullanarak astrositik GPCR sinyalindeki uzun süreli değişiklikleri nasıl indükleyeceğinizi. Bu yöntem, sinirbilim araştırmalarında astrosit plastisitesini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar ölçekleme protokolleri ve veri değerli tartışma için glial-Nöronal Etkileşimleri UC Riverside Merkezi&#39;ni kabul etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca, yaptıkları işin yayın sponsor Abcam&#39;dan için samimi ederiz size vermek istiyorum.

<ol><li>Araque, A., Martin, E. D., Perea, G., Arellano, J. I., Buno, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+acetylcholine+evokes+Ca2%2B+elevations+in+astrocytes+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptically released acetylcholine evokes Ca2+ elevations in astrocytes in hippocampal slices.</a> J. Neurosci. 22, 2443-2450 (2002).</li>
<li>Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+mediate+neuron-astrocyte+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids mediate neuron-astrocyte communication.</a> Neuron. 57, 883-893 (2008).</li>
<li>Bekar, L. K., He, W., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus+coeruleus+alpha-adrenergic-mediated+activation+of+cortical+astrocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">Locus coeruleus alpha-adrenergic-mediated activation of cortical astrocytes in vivo.</a> Cereb. Cortex. 18, 2789-2795 (2008).</li>
<li>Hertz, L., Lovatt, D., Goldman, S. A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenoceptors+in+brain%3A+cellular+gene+expression+and+effects+on+astrocytic+metabolism+and+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem.+Int%22%5BJournal%5D)">Adrenoceptors in brain: cellular gene expression and effects on astrocytic metabolism and Ca2.</a> Neurochem. Int. 57, 411-420 (2010).</li>
<li>Porter, J. T., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+astrocytes+in+situ+respond+to+glutamate+released+from+synaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hippocampal astrocytes in situ respond to glutamate released from synaptic terminals.</a> J. Neurosci. 16, 5073-5081 (1996).</li>
<li>Bernardinelli, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+display+complex+and+localized+calcium+responses+to+single-neuron+stimulation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes display complex and localized calcium responses to single-neuron stimulation in the hippocampus.</a> J. Neurosci. 31, 8905-8919 (2011).</li>
<li>Panatier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+are+endogenous+regulators+of+basal+transmission+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses.</a> Cell. 146, 785-798 (2011).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+Ca2%2B+signaling+evoked+by+sensory+stimulation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo.</a> Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).</li>
<li>Fiacco, T. A., Agulhon, C., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+out+astrocyte+physiology+from+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Sorting out astrocyte physiology from pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 49, 151-174 (2009).</li>
<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Signaling+and+Gliotransmission+in+Normal+vs+Reactive+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Calcium Signaling and Gliotransmission in Normal vs Reactive Astrocytes.</a> Front. Pharmacol. 3, 139 (2012).</li>
<li>Nedergaard, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifact+versus+reality--how+astrocytes+contribute+to+synaptic+events%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events.</a> Glia. 60, 1013-1023 (2012).</li>
<li>Nizar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+stimulus-induced+vasodilation+occurs+without+IP3+receptor+activation+and+may+precede+astrocytic+calcium+increase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo stimulus-induced vasodilation occurs without IP3 receptor activation and may precede astrocytic calcium increase.</a> J. Neurosci. 33, 8411-8422 (2013).</li>
<li>Sutton, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniature+neurotransmission+stabilizes+synaptic+function+via+tonic+suppression+of+local+dendritic+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Miniature neurotransmission stabilizes synaptic function via tonic suppression of local dendritic protein synthesis.</a> Cell. 125, 785-799 (2006).</li>
<li>Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+synaptic+scaling+induced+by+changes+in+postsynaptic+firing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing.</a> Neuron. 57, 819-826 (2008).</li>
<li>Xie, A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+scaling+of+astrocytic+metabotropic+glutamate+receptor+signaling+following+long-term+changes+in+neuronal+firing+rates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Bidirectional scaling of astrocytic metabotropic glutamate receptor signaling following long-term changes in neuronal firing rates.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiol. Rev. 79, 1089-1125 (1999).</li>
<li>Petravicz, J., Fiacco, T. A., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+IP3+receptor-dependent+Ca2%2B+increases+in+hippocampal+astrocytes+does+not+affect+baseline+CA1+pyramidal+neuron+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of IP3 receptor-dependent Ca2+ increases in hippocampal astrocytes does not affect baseline CA1 pyramidal neuron synaptic activity.</a> J. Neurosci. 28, 4967-4973 (2008).</li>
<li>Nett, W. J., Oloff, S. H., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+astrocytes+in+situ+exhibit+calcium+oscillations+that+occur+independent+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal astrocytes in situ exhibit calcium oscillations that occur independent of neuronal activity.</a> J. Neurophysiol. 87, 528-537 (2002).</li>
<li>Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1, 380-386 (2006).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+101+as+a+specific+marker+of+astroglia+in+the+neocortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo.</a> Nat. Methods. 1, 31-37 (2004).</li>
<li>Prezeau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+carboxyl-terminal+domain+of+metabotropic+glutamate+receptor+1+by+alternative+splicing+generate+receptors+with+differing+agonist-independent+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Changes in the carboxyl-terminal domain of metabotropic glutamate receptor 1 by alternative splicing generate receptors with differing agonist-independent activity.</a> Mol. Pharmacol. 49, 422-429 (1996).</li>
<li>Shao, Y., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+relationship+between+alpha+1-adrenergic+receptor+density+and+the+receptor-mediated+calcium+response+in+individual+astroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Quantitative relationship between alpha 1-adrenergic receptor density and the receptor-mediated calcium response in individual astroglial cells.</a> Mol. Pharmacol. 44, 247-254 (1993).</li>
<li>Wang, S. S., Thompson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+changes+in+functional+muscarinic+acetylcholine+receptor+density+in+single+neuroblastoma+cells+using+calcium+release+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Measurement of changes in functional muscarinic acetylcholine receptor density in single neuroblastoma cells using calcium release kinetics.</a> Cell Calcium. 15, 483-496 (1994).</li>
<li>Ostasov, P., Krusek, J., Durchankova, D., Svoboda, P., Novotny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+responses+to+thyrotropin-releasing+hormone+and+angiotensin+II%3A+the+role+of+plasma+membrane+integrity+and+effect+of+G11alpha+protein+overexpression+on+homologous+and+heterologous+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem.+Funct%22%5BJournal%5D)">Ca2+ responses to thyrotropin-releasing hormone and angiotensin II: the role of plasma membrane integrity and effect of G11alpha protein overexpression on homologous and heterologous desensitization.</a> Cell Biochem. Funct. 26, 264-274 (2008).</li>
<li>Shelton, M. K., McCarthy, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+astrocytes+exhibit+Ca2%2B-elevating+muscarinic+cholinergic+and+histaminergic+receptors+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Hippocampal astrocytes exhibit Ca2+-elevating muscarinic cholinergic and histaminergic receptors in situ.</a> J. Neurochem. 74, 555-563 (2000).</li>
<li>Hermans, E., Challiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+signalling+and+regulatory+properties+of+the+group+I+metabotropic+glutamate+receptors%3A+prototypic+family+C+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Structural signalling and regulatory properties of the group I metabotropic glutamate receptors: prototypic family C G-protein-coupled receptors.</a> Biochem. J. 359, 465-484 (2001).</li>
<li>Zur Nieden, R., Deitmer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Metabotropic+Glutamate+Receptors+for+the+Generation+of+Calcium+Oscillations+in+Rat+Hippocampal+Astrocytes+In+Situ%5BTitle%5D)+AND+%22Cortex%22%5BJournal%5D)">The Role of Metabotropic Glutamate Receptors for the Generation of Calcium Oscillations in Rat Hippocampal Astrocytes In Situ.</a> Cortex. 16 (5), 676-687 (2005).</li>
<li>de Ligt, R. A., Kourounakis, A. P., AP, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+agonism+at+G+protein-coupled+receptors%3A+%28patho%29physiological+relevance+and+implications+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inverse agonism at G protein-coupled receptors: (patho)physiological relevance and implications for drug discovery.</a> Br. J. Pharmacol. 130, 1-12 (2000).</li>
<li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+101+induces+long-term+potentiation+of+intrinsic+excitability+and+synaptic+efficacy+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine 101 induces long-term potentiation of intrinsic excitability and synaptic efficacy in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuroscience. 169, 1601-1609 (2010).</li>
<li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li>
<li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J. Gen. Physiol. 141, 633-647 (2013).</li>
<li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat. Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li>
<li>Fiacco, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+stimulation+of+astrocyte+calcium+in+situ+does+not+affect+neuronal+excitatory+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Selective stimulation of astrocyte calcium in situ does not affect neuronal excitatory synaptic activity.</a> Neuron. 54, 611-626 (2007).</li>
<li>Echegoyen, J., Neu, A., Graber, K. D., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+plasticity+studied+using+in+vivo+hippocampal+activity-blockade%3A+synaptic+scaling%2C+intrinsic+plasticity+and+age-dependence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Homeostatic plasticity studied using in vivo hippocampal activity-blockade: synaptic scaling, intrinsic plasticity and age-dependence.</a> PLoS One. 2, (2007).</li>
<li>Aguado, F., Espinosa-Parrilla, J. F., Carmona, M. A., Soriano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+correlated+network+properties+of+spontaneous+calcium+transients+in+astrocytes+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates correlated network properties of spontaneous calcium transients in astrocytes in situ.</a> J. Neurosci. 22, 9430-9444 (2002).</li>
<li>Takata, N., Hirase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+layer+1+and+layer+2%2F3+astrocytes+exhibit+distinct+calcium+dynamics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cortical layer 1 and layer 2/3 astrocytes exhibit distinct calcium dynamics in vivo.</a> PLoS ONE. 3, e2525 (2008).</li>
<li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRET+biosensors+to+study+GPCR+biology%2C+pharmacology%2C+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">BRET biosensors to study GPCR biology, pharmacology, and signal transduction.</a> Front. Endocrinol. 3 (105), (2012).</li>
<li>Di Castro, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Ca2%2B+detection+and+modulation+of+synaptic+release+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes.</a> Nat. Neurosci. 14, 1276-1284 (2011).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-dependent+neuroglial+calcium+signaling+differs+between+young+and+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glutamate-dependent neuroglial calcium signaling differs between young and adult.</a> Science. 339, 197-200 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar, bu çalışmalarda kullanılmış olan tetrodoksin Abcam&#39;dan temin satın olduğunu ifşa istiyoruz. Abcam hipotezler, tasarım ya da veri toplama ile hiçbir ilgisi yoktu. Akran değerlendirme süreci tamamlandıktan sonra Abcam&#39;dan tarafından işin sponsorluğunda ilişkin tüm iletişim oluştu.

Tarif ölçeklendirme modelleri Astrositik grup mGluR&#39;lerinin uzun vadeli plastisite araştırmak için pratik yöntemleri temsil eder. Görüntüleme spontan ve uyarılmış Ca 2 + olaylar, sağlam kanıtlar astrosit Ca 2 + yükselmeler Gq GPCR&#39;dir aktivasyon 10 mansap IP 3 R-duyarlı mağazalardan salıverilmesinin ardından meydana tespit edildiği gibi, Astrositik Gq GPCR&#39;dir aktivite değişiklikleri ölçmek için hassas bir tahlil sağlar 12, 17, 18. Nüfus astrositlerin yüzdesi grup I mGluR agonisti ve bu Ca2 + tepkilerinin desen yanıt astrositler tarafından Grup I mGluR&#39;leri değişiklikleri rapor etmektedir. Ca 2 + göstergesi ile astrositler yüklemek için kullanılan özel teknik, astrositik Gq GPCR aktivitedeki değişiklikler için deney tasarımında önemli bir husustur. Bolus-yükleme veya toplu yükleme birden astrositleri, veya pBireysel astrositlerin atch klemp yükleme astrositlerde görüntü Ca 2 + geçici için kullanılabilir. Her yaklaşımın bazı avantajları ve dezavantajları bulunmaktadır. Doğrudan yama kelepçe ile Ca 2 + göstergeli astrositler doldurma gibi SR-101 gibi sekonder bir marker için gerek kalmadan bir astrosit olarak hücrenin açık belirlenmesini sağlar. Göstergenin Patch-kelepçe teslimat da hücreler sağlıklı dilim ve sinapsların (mevcut lazer gücüne bağlı olarak) daha sağlam etkileşimler ile potansiyel derin gür ince süreçlerin, dahil olmak üzere küçük Astrositik bölmelerden Ca 2 + aktivite kayıt sağlar. Veriler her seferinde bir hücre toplanır Ancak, patch-clamp yükleme düşük verim uğrar. Bulk-yükleme, aksine, astrositlerin, çok sayıda Ca 2 + göstergesi ile yüklenir ve aynı anda görüntülü sağlar. Ancak, astrositler yüzeye yakın dilimin (&lt;20 um) bağlı bir endişe ile yüklenirhücre sağlığı ve sağlam sinapsların hakkında s. Burada sunulan backpressureyi bolus yükleme protokolü nispeten yüksek verim ve dilim (40-75 mikron) içindeki derin Ca 2 + etkinliğini izlemek için yeteneği ile, bir orta yol sunuyor. Bolus yükleme tekniği kullanılarak kendiliğinden aktif astrositlerin yüzdesinde önemli bir artış ve nöronal sinapsların, astrositik proseslerde arasındaki bağlantı 15 daha eksiksiz olduğunu düşündürmektedir, kütle-yük ile karşılaştırıldığında görülmektedir. Iyi bir yükleme ile, sık sık 2-foton mikroskopi kullanılarak astrositler (veriler gösterilmemiştir) veya potansiyel olarak daha da küçük bölmelerin ana işlemlerinde Ca 2 + etkinliğini izlemek için. Ancak, bakım sınırları spesifik olmayan arka plan boyama içine karıştırmak gibi, belirli bir astrosit için küçük süreçleri atama icra edilmesi gerekir. Kütle-yük ya da yükleme bolus prosedürlerin kullanılması ile ek bir sorun, bir ikinci mar için ihtiyaçastrosit tanımlanması için ker. Bu, tercihen astrositler Ca 2 + göstergeleri AM ester almak birçok yıldan beri bilinmektedir olsa da, ikinci işaretleyici SR-101, genellikle astrositler olarak yüklenmiş hücreler doğrulamak için kullanılır. SR-101 kendi nöronların 29&#39;un iç heyecanlanma değiştirebilir. SR-101 kullanımı sinirsel uyarıların mümkün SR-101 etkilerini sınırlamak için ttx tüm astrocyte Ca 2 + ölçümleri gerçekleştirmek için ihtiyaç corroborates. Kontrol ve deney grubu hem de SR-101 dahil olduğu varsayılarak, tek başına markör nöronal aksiyon potansiyellerinin, uzun süreli manipülasyona aşağıdaki astrosit Ca 2 + sinyal gözlenen etkilerin hesaba olmamalıdır. O 2,5 mM K + vs arasındaki farkı azaltabilir olarak SR-101, ancak, yüksek K + deneylerde bir endişe daha fazla olabilir 5.0 mM K + bazal ateşleme hızı orantılı değilse. Ca 2 + sunmak için çok umut verici bir yaklaşım </sup&gt; Astrositlere gösterge Ca 2 + boyalar kullanarak daha geleneksel yaklaşımlara cazip bir alternatif sunduğu son zamanlarda ortaya çıkmıştır. Önemli gelişmeler astrositlere 30-32 hedeflenen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GeCIS) ile son yıllarda yapılmıştır. GeCIS hipokampus gibi ilgi konusu bir beyin bölgesine adeno-ilişkili viral vektörler in vivo mikroenjeksiyon ile astrositler teslim edilebilir. GeCIS ekspresyonu viral enfeksiyon 32 takip eden yaklaşık iki hafta sonra elde edilir. Astrositlerde GeCIS kullanılmasıyla sunulan pek çok avantajı vardır. İlk olarak, vektör, bir astrosit-özgü promoteri kullanılarak astrositleri hedef, bu etiketlenmiş hücrelerin astrosit 32 vardır. İkincisi, sinyal-gürültü ama şimdi hücrede 32 bir yama pipet geçirdiğine invaziflik olmadan, boya yama kelepçe teslim kullanılarak elde edilebilir ne karşılaştırılabilir görünüyor. Üçüncü olarak, göstergeler del olabilirivered ve toplu yükleme dağıtım yöntemlerini kullanarak sorunlu yetişkin doku olarak ifade edilmiştir. Ayrıca, ifade birden astrositlere arasında ayrım yeteneği sunan mozaik olduğunu. Aynı zamanda soma ve ince branchlets kayıt Böylece, çeşitli potansiyel olarak astrositler, eş zamanlı olarak görüntülenebilir. Bu nedenle, potansiyel olarak tek bir tekniği büyük ölçüde verimliliği artırarak, astrositik Gq GPCRs ölçekleme aktivitesini kaydetmek için üç ayrı teknikler (toplu yükleme, bolus-yükleme ve patch-kelepçe yükleme) yerine kullanılabilir. Astrositlere Ca 2 + göstergelerin viral aracılı teslim kullanarak bir potansiyel dezavantajı dilim sağlık 32 olası etkisidir. GeCIS sunmak için kullanılan adeno-ilişkili viral vektörler astrositlerin 33 arasında reaktif gliozis neden olduğu daha önce gösterilmiştir. Genel olarak beyin dilimleri hazırlanması muhtemel enf sürümü de dahil olmak üzere patoloji erken aşamalarında başlatırlammatory 10 molekülleri. Bu nedenle, GeCIS kullanımı viral vektörler kullanılarak teslim astrositik reseptörlerinin ölçekleme indüklemek için gerekli olan uzun inkübasyon süreleri, deney ile birlikte bu tür dilim sağlık bağlamında ek dikkate almak gerekir. Bu protokolü kullanarak, bu bir yanıt üretmek için agonist için uygulama süresi reseptör durumu bir fonksiyonu olarak değişir akılda tutmak önemlidir. Agonistin, belirli bir konsantrasyonu için, uygulama süresi reseptörleri küçültülmüş ve daha kısa olması durumunda reseptörlerin bir Ca 2 + üretmek için yeterli reseptörleri aktif hale getirmek için yeterli bir doku konsantrasyonu elde etmek üzere, ilaç için, yukarı ölçeklenmiş daha uzun olması gerekir yanıtı. Bu nedenle, ilaç uygulama süreleri ve potansiyel konsantrasyonları, ölçekleme amaçlanan yönüne bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Örneğin, agonist konsantrasyonu c düşürülebilir gerekebilirTTX ve ase yanıtları doyurarak önlemek, ve hatta bir yanıt görmek için yüksek K + dilimleri beklettikten sonra artmış. Özel olarak, DHPG konsantrasyonu 5-15 uM genellikle güvenilir yanıtları üretmek için çok düşük olduğu gibi, Ca2 + cevabı desen çalışması için 5.0 mM K + tedavi sonrası 30-50 uM TTX tedavi sonrası 5-15 uM kaymıştır grup mGluR&#39;lerinin küçültmeden sonra astrositlere. Astrosit Ca 2 + faaliyet kaydı plazma zarına veya ikinci reseptör ekleme ya da interne etme doğrudan bir kanıt sağlar. Ancak, Gq GPCR&#39;dir ifade seviyeleri ve spontan arasında doğrudan bir ilişki incelenmiş ve Ca 2 + geçişlerini 21-24, Ca 2 + değişikliklerin en mantıklı yorumunu uyarılmış vitro önceki çalışmalarından elde edilen veriler ile veri olağanüstü benzerliğe göre sinyal astrosit yüzey reseptör ekspresyon seviyeleri olmasıdırdeğiştirdi. Bir Ca 2 + aktivitesi üzerindeki etkisi mahaline hakkında ek delil sağlamak istiyorsa bir tamamlayıcı bir yaklaşım önemli bir husus olabilir. Biz kullanılan bir strateji Astrositik MrgA1R farelerin hipokampal dilimleri TTX inkübasyon etkisini araştırmaktır. Bu transgenik fareler, sadece astrositlerde yabancı Gq GPCR (MrgA1R) ifade eder. Bu reseptör beyne yerel olduğu için, aktivitesi düzeylerini değiştirmek için mevcut herhangi bir endojen nörotransmiter yoktur. Önceki çalışmalar bu reseptör aynı astrositler 34 endojen Grup I mGluR&#39;leri olarak sinyal molekülleri ile aynı hücre içi angaje önerdi. TTX in MrgA1R farelerden dilimlerinin sonra uzun süreli inkübasyon, yavru kontrole kıyasla agonist ile uyarılan MrgA1R yanıtlarında bir fark, dilimler astrosit üzerindeki etkisi Ca 2 + aktivitesi yüzey reseptörüne lokalize değişiklikler nedeniyle olduğuna dair kanıt sağlayacak kuluçkalanmıştır Özellikle grup I mGluR&#39;daki cevapları hala anlaml iseicantly aynı astrositler geliştirilmiştir. Alternatif bir, belki daha fazla yer strateji sürece bir membran fraksiyonu yüzey reseptör ekspresyon seviyelerindeki değişiklikler için analiz edilebilir olarak, Western blot analizi için kesitlerden izole astrositler olacaktır bile. Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) veya akım sitometri burada yararlı olabilir. Nöronların çalışma için bu tekniğin olası uygulamaları, astrositler ve astrosit-nöronal etkileşimleri çoktur. Deneylerde, sadece DHPG uyarılmış grup I astrositik Ca2 + tepkileri çocuk farelerden izole, akut hipokampal dilimlerde, mGluR çalışıldı. Bu hazırlık, sağlam afferentleri (Schaffer kollateral), ama aynı zamanda onları (CA3 piramidal hücreler) doğuran nöronlar vardır mümkün postsinaptik hücreleri (CA1 piramidal hücreleri) üzerine bu Glutamaterjik nöronların ateşleme oranlarını manipüle yapma ve sadece olan işlemler associat stratum radiatum astrositlerBu sinapsların ile e. Akut hipokampal nöronlarının dilim diğer tip ateşleme oranlarını değiştirmek için en iyi preparat olabilir, bununla birlikte, pek çok afferentler onlara yol nöronların koparılır. Bununla birlikte, diğer astrositik Gq GPCR alt tiplerinin plastisite gözlemlemek için bazı slice preparatlarda mümkün olabilir. Örneğin, dilim sağlam hipokampta bazal ön beyin kolinerjik nöronlarının ve projeksiyonları ile hazırlanabilir. TTX veya yüksek K +, bu dilimlerin Kuluçka kolinerjik giriş 1 önemli bir kısmını almak stratum Oriens&#39;in astrositlerde, içinde mAChRs&#39;sini ölçeklendirilmesidir açan, kolinerjik nöronlar bazal ateşleme oranlarını etkileyecektir. Alternatif bir ölçekleme oluşur, TTX bir salıverilme plast implantasyonu ile elde edilir bir in vivo model kullanmak olabilir bozulmamış tüm bağlantıları ile beynin belirli bir alanda astrositik reseptör ölçekleme, çalışma henüz denenmemiş bir yaklaşımic polimer Elvax 40W ilgi 35 bölge üzerindedir. Bu yaklaşım nöronal ölçekleme bir çalışmada daha önceden kullanılmış olan ama aynı zamanda Astrositik ölçekleme için geçerli olmalıdır. Son olarak, uygun okuma ile, gelecekteki çalışmalarda G ler ya da G i GPCRs değişiklikler dahil olmak üzere diğer GPCR&#39;dir aileleri, incelemek olabilir. Bir i GPCR&#39;ler lokal olarak herhangi bir dilim hazırlık içinde GABA internöronlardan projelendirme ateş engellenmesi aşağıdaki etkilenecek Astrositik GABA B G tahmin olabilir. Böyle ikinci haberci cAMP bir gerçek zamanlı gösterge olarak diğer sinyal molekülleri hedefleyen yeni göstergeler geliştirilmesi, nöron-to-astrosit reseptör iletişim araştırma tamamen yeni bir alan açmak istiyorum. Bazal nöron atış oranları manipülasyonu ile astrositik mGluR&#39;lerin Çift yönlü ölçekleme nörotransmitter AP-aracılı serbest bırakmak için astrositlerin duyarlılık bir ölçüsünü sağlar. Astrositler görünüşte kendiliğinden APleri ve glutamat hissedebiliyorumekstrasellüler K + fizyolojik bir aralıkta olsa Schaffer kollateral-CA1 piramidal hücre sinapslarında te bırakma. TTX akut uygulama kendiliğinden astrosit sıklığını astrositik reseptörleri AP dedektörleri olduğuna dair kanıtlar temin Ca 2 + aktivitesi 18, 36, 37, 36 olur ilintisiz popülasyondaki astrositler arasındaki Ca 2 + aktivitesi, azaltmaz iken. Bu astrocytes hiçbir genel Ca 2 + aktivite üzerindeki etkisi ile spontan nöronal APleri anlamda düşündürmektedir. Bu yaygın IP 3 hücre içi konsantrasyonları tespit edilebilir bir Ca2 + yükselmesi yol açmak için yeterli IP 3 Rs teşvik etmek için bir eşik seviyesine ulaşmak için ihtiyaç olduğu kabul edilmektedir. Spontan nöronal AP ölçülebilir Ca 2 + yükselmeleri üretmeden Astrositik GPCR&#39;ler aktive misiniz? Gelecek çalışmalar Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) veya benzer bir techn kullanmak olabilir<html> alıcısına G protein bağlama (reseptör aktivasyonunun bir ölçütü) ve iç depolar Ca 2 + bırakılması arasındaki ilişkinin incelenmesi için (örneğin, BRET gibi) ique. Bu teknoloji, bozulmamış doku preparasyonlarda kullanıma hazır olmadan önce bir süre olabilir, ancak BRET, G protein-to-GPCR kuplajı 38, in vitro olarak tespit etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu Astrositik Gq GPCR&#39;ler çok daha sık mevcut Ca 2 + görüntüleme araçlarını kullanarak kaydedilebilir daha aktive ediliyor mümkündür. Aksiyon potansiyelleri algılama ek olarak, astrositik Gq GPCR&#39;ler da bir çalışmada 39 de belirtildiği gibi nörotransmiter minyatür quantal salınımını tespit etmek mümkün olabilir. Burada anlatılan iki yönlü ölçekleme yöntemi Astrositik Gq GPCR&#39;ler kuluçka protokolde bafilomisin A1 dahil ederek nörotransmiter quantal veziküler salınımını tespit ölçüde bir ölçü sağlamak için gelecekteki çalışmalarda kullanılabilir. Astrositik reseptör ölçekleme de yetişkin farelerden elde edilen doku kaynaklı olabilir eğer ntent &quot;&gt; Bugüne kadar, ölçeklendirme protokolleri sadece çocuk farelerin (p12-p18) hipokampal dilimleri kullanılmıştır. Dolayısıyla halen bilinmemektedir. bir zorlayıcı yeni bir çalışma astrositlerde grup I mGluR&#39;daki ifade çağın ilk haftadan sonra önemli ölçüde azalır ve yetişkin astrositlerde 40 reseptör ifadesi çok düşük seviyelerde, yetişkinliğe kadar azalmaya devam ediyor. Bu nedenle Astrositik mGluR&#39;ler aşağıdaki büyütmek olmadığını belirlemek için ilginç olacağını gösteriyor uzun genç farelerin astrositlerde görülen yaklaşan düzeylere yetişkin fare hipokampal dilimleri nöronal ateşleme süreli engellenmesi. Bu bulgu Astrositik reseptör ifadenin belirli bir yaşta statik değil, nöronal aktivitenin seviyelerine bağlı olarak hızla değişebilir öneririz. aksine yetişkin farelerde grup mGluR&#39;lerinin azaltılmış ifadesi, delil dahil &amp; # o adrenerjik reseptörleri ortaya çıkıyor945; 1A, 2A α ve β alt tipleri 1, ağırlıklı olarak, yetişkin beyin 3, 4 ve astrositler tarafından ifade edilmiştir. Α 1A adrenerjik Gq GPCR&#39;dir bu reseptörlerin adrenerjik nöron ateşleme hızlarındaki değişikliklere duyarlı olup olmadığı dahil nöron-to-astrosit iletişimin gelecekteki çalışmalar için çekici bir hedef olabilir.

Astrositler 2 + astrositik Gq GPCRs aktivasyonundan hemen hemen tamamen edilen Sitoplazmik Ca artışlar nöronlar ya da nöronal aksonlarının uyarılmasından saniye içinde yanıt verir. Örneğin muskarinik asetilkolin reseptörleri 1, kanabinoid reseptörleri 2, α 1A adrenerjik reseptörler, 3, 4, ve Grup I mGluR&#39;ler (aşağıya bakınız) akut nöron aktivitesi yanıt her astrositik Gq GPCR alt-tipleridir. Astrositik Grup I mGluR&#39;leri aktivasyonu (örneğin, akut hipokampal dilimler gibi) in situ nöronal glutamaterjik sinirlerin uyarılmasıyla 5-7, hem de in vivo olarak yetişkin fare korteksteki sensor uyarılması 8 takip ediyor, en yaygın olarak gösterilmiştir. Biyoloji ve astrositlerde, nöronlar, ya astrosit nöron etkileşimlerinin fizyolojisi üzerinde sinyalizasyon astrositik Gq GPCR&#39;nin aktivasyonu sonucu tartışma 9-12 meselesi olmuştur. Bu s olacaknöron-to-astrosit reseptör sinyalizasyon işlevi önce ome zaman tam olarak takdir edilmektedir. Bu nöronlar deneysel protokolleri kullanarak Astrositik reseptörleri aktive açıktır iken, yeterince anlaşılamamıştır kalması nöron-to-astrosit reseptör iletişim yönleri vardır. Birincisi, astrositik Gq GPCR&#39;ler etkinleştirmek için gerekli nöronal aktivitenin gerçek miktarı iyi tanımlanmış değildir, ve ikinci, kullanım-bağımlı plastisite sergilemek astrositik reseptörlerinin yeteneği az ilgi gördü. Bu soruları başlamak için, biz son zamanlarda nöronal hareket potansiyelinin uzun vadeli değişiklikler (AP)-bağımlı sinaptik aktivite cevaben Astrositik grubunda akut çocuk hipokampal dilimleri ben mGluR&#39;ler iki yönlü ölçekleme ikna etmek için bir protokol geliştirmiştir. I mGluR&#39;leri fo büyütmek nöronal iyonotropik glutamat reseptörlerinin, 13, 14, astrositik grubunun çift yönlü homeostatik plastisite için keşfedilmiştir ne benzerllowing nöronal hareket potansiyelinin abluka ve nöronal aksiyon potansiyeli frekansı 15 arttığında küçültün. Astrositik reseptörleri bu telafi edici değişiklikler kendiliğinden kaydederek ölçülür ve astrocyte Ca 2 + transientleri uyarılmış ve kontrol koşullarında astrositlerden olanlara bu olayların özelliklerini karşılaştırarak edilebilir. Bu yazıda, astrosit reseptör ölçekleme uyardığı akut hipokampal dilimleri, inkübasyon koşullarının hazırlanması da dahil olmak üzere, bu protokolün kullanımı için tam bir metodoloji tarif astrosit Ca 2 + göstergesi boya yükleme, Ca 2 + görüntüleme konfokal mikroskopi kullanılarak teknikleri ve beklenen etkiler astrocyte Gq GPCR aktivite. Astrosit üzerinde öngörülebilir etkileri Ca2 + sinyali özellikleri - Gq GPCRs farklı ekspresyon seviyeleri ile transfekte edilmiş kültürlenmiş hücrelerde daha önce kaydedilmiş eşleşen - olarak değişiklikler için tahlil sonraki çalışmalarda kullanılabilecek bir &quot;yol haritası&quot; sağlartrocytic GPCR ifade. Bu tekniğin kullanımı için etkileri ve potansiyel uygulamalar, sağlıklı ve hastalıklı beyin astrosit-nöronal etkileşimlerinin anlaşılmasına katkıda bulunacaktır.

<table><tbody><tr><td>Chamber Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brinkmann pipet saklama kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-491</td><td>Çekmece kısmını kuluçka odası olarak kullanın</td></tr><tr><td>Elektrikli matkap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esnek boru</td><td>Tygon</td><td>R-3603</td><td></td></tr><tr><td>Silikon dikiş dolgu macunu&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Akvaryum dikiş kapatıcı olarak da adlandırılır</td></tr><tr><td>Gaz tankı</td><td></td><td></td><td>% 95 oksijen,% 5 karbondioksit</td></tr><tr><td>Doğal eğimli pipet ucu</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1000</td><td>Oksijenat hatlarını bağlamak için uygun</td></tr> kesim <tr><td>Bir ila altı hat manifoldu</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0210 (MP-6)Mikro</td> <td>yükleyici-manifold aparatı için</td></tr><tr><td>Mikro yükleyici</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td>Mikro yükleyici-manifold aparatı için, cut-to-fit</td></tr><tr><td>Yüzer Kabarcık Rafı</td><td>Bel Art Scienceware</td><td>F18875-0400</td><td>Dilim tutucu</td></tr><tr><td>600 ve mikro için; m Sefar Nitex Naylon örgü</td><td>ELKO Filtreleme A.Ş.</td><td>06-600/51</td><td>Dilim tutucu için</td></tr><tr><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td><td>Dilim tutucu</td></tr> <tr><td>için <güçlü>Reaktifler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P333-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Fisher</td><td>Fisher</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)-6-Hidroksi-2,5,7,8-tetrametilroman-2-karboksilik asit (Trolox)</td><td>Acros Organics</td><td>53188-07-1</td><td></td></tr><tr><td>Askorbik asit</td><td>Acros Organics</td><td>401471000</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoksin sitrat (TTX)</td><td>Abcam</td><td>ab120055</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101 (SR-101)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>284912</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit (DMSO)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Pluronik Asit F-127</td><td>Invitrogen, Moleküler Problar</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 * hücre bazlı (özel ambalaj)</td> <td>Canlandırıcı, Moleküler Problar</td><td>O6807</td><td></td></tr> <tr><td>(RS) -3,5-DHPG</td><td>Abcam</td><td>ab120020</td><td></td></tr><tr><td>Histamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125</td><td></td></tr><tr><td>Karbamoilkolin klorür (Carbachol)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C4382</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5'-ATP disodyum (Na-ATP)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Diseksiyon Aletleri< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tek kenarlı tıraş bıçağı ve nbsp;</td><td>GEM</td><td>62-0161</td><td>Bisection için&nbsp;</td></tr><tr><td>Çift kenarlı tıraş bıçağı</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>121-6</td><td>Dilimleri kesmek için</td></tr><tr><td>Mayo Makas, süper kesim</td><td>WPI</td><td>14010-15</td><td>Kafa kesme için</td></tr><tr><td>İnce iris makası, düz</td><td>İnce Bilim Araçları</td><td>14094-11</td><td>Kafatasını kesmek için</td></tr><tr><td>İris forseps, kavisli</td><td>WPI</td><td>15915</td><td>Cildi ve kafatasını çıkarmak için</td></tr><tr><td>Küçük spatula</td><td></td><td></td><td>Beyni çıkarmak/aktarmak için</td></tr><tr><td>Dumostar Dumont #5 Biologie Uç forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11295-10</td><td>Hipokampus diseksiyonu için</td></tr><tr><td>Cam Pasteur pipeti</td><td>Fisher</td><td>13-678-20B</td><td>Beyin dilimlerini aktarmak için</td></tr><tr><td>Pasteur pipet kauçuk ampul</td><td>Fisher</td><td>03-448-22</td><td>Beyin dilimlerini aktarmak için</td></tr><tr><td>Polistiren 100 mm doku kültürü kapları</td><td>Corning</td><td>25020</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Leica</td><td>VT 1200S</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td></td><td>Fisher ISOTEMP 210</td><td>Sıcak inkübasyon için</td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>Bolus yükleme pipeti için</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Olympus</td><td>Olympus Fluoview 1000</td><td></td></tr><tr><td>PM-1 platformlu Düşük Profilli Açık Elmas Banyosu Görüntüleme Odası</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26GLP</td><td>düşük profilli elmas banyosu</td></tr><tr><td>Borosilikat cam pipet</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>TW150F-4</td><td>Bolus yüklemeli pipet</td></tr><tr><td>için Mikromanipülatör&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>ROE-200</td><td>Bolus yüklemeli pipet için</td></tr><tr><td>Spin-X santrifüj tüpü filtresi 0.22 & M Selüloz Asetat & nbsp;</td><td>Kuyruklu yıldız</td><td>8161</td><td></td></tr></tbody></table>

nöronal ateşleme oranlarının manipülasyon tarafından astrositik reseptörleri plastisite inducing

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Araştırmanın iki yıl yakın in situ ve in vivo olarak astrositleri nöronal serbest bırakılan verici tarafından teşvik edilebilir çok sayıda G protein-eşli reseptörü (GPCR&#39;ler) ifade eden oluşturmuştur. Ancak nöron aktivitesi değişikliklere yanıt olarak plastisite sergilemek astrositik reseptörlerinin yeteneği çok az dikkat çekmiştir. Burada küresel büyütmek veya Astrositik grup aşağı ben akut beyin dilimleri glutamat reseptörleri (mGluR&#39;ler) metabotropik için kullanılabilecek bir model sistemi tanımlar. Dahil çift yönlü floresan Ca 2 + göstergesi ile nöronal aksiyon potansiyeli frekansı, yük astrositleri ve astrocyte süreçlerini işlemek, uzun vadeli dilim inkübasyon için uygun odaları oluşturmak, parasagital hipokampal dilimleri hazırlamak ve kayıt ile Astrositik Gq GPCR&#39;dir aktivite değişikliklerini ölçmek için nasıl yöntemler konfokal mikroskopi kullanılarak spontan ve uyarılmış astrocyte Ca 2 + olaylar. Aslında, bir &quot;kalsiyum roadmap &quot;astrositik Gq GPCRs esnekliğini ölçmek için nasıl sağlanmaz. Astrositlerin çalışma için tekniğin uygulamaları tartışılmıştır. Astrositik reseptör sinyal nöronal aktivitedeki değişimlere etkilenir nasıl bir anlayış olması hem normal sinaptik fonksiyonu yanı sıra işlemler altta yatan nörolojik bozukluklar ve nörodejeneratif hastalık için önemli etkileri vardır.

Şekil 3 &#39;de temsil edici sonuçlar sr astrosit Ca 2 + aktivite 4-6 saat boyunca TTX akut fare hipokampal dilimler inkübasyon etkisini göstermektedir. Veri ACSF artı ttx vs kontrol ACSF kuluçkaya dilim kendiliğinden Ca 2 + transientleri ve DHPG-uyarılmış grup I mGluR&#39;daki Ca 2 + tepkilerini, hem de içerir. Temel karakteristik morfolojik özellikleri, stellate süreci montaj ve küçük soma boyutu (~ 10 mikron) dışında, astrositler seçici astrosit işaretleyici SR-101 19 20 ile (Ca 2 + göstergesi KGB-01:00 arasında yayılmasıyla sr tanımlanmıştır Şekil 3A). Astrosit hücre organları üzerinde numaralandırılmış kutular Şekil 3B&#39;de gösterildiği zaman izleri üzerinden numaralı flüoresans tekabül. Grup 1 mGluR agonisti (RS)-3.5-DHPG astrositlerde grup 1 mGluR&#39;leri üzerindeki spesifik ölçekleme etkilerini belirlemek için uygulanır. Fizik arasında ayırımcılıkDiğer Gq GPCRs karşı grup 1 mGluR&#39;lere ölçekleme etkisinin spesifikliği bakımından iology, agonistlerinin bir kokteyl her deney sonunda uygulanır. Burada histamin, karbamilkolin klorür (karbakol) ve adenozin 5&#39;-ATP disodyum (Na-ATP) agonistleri 10 uM Gq GPCR her kullanılır. Agonist kokteyl, aynı zamanda, bu belirli astrositler DHPG bir yanıt ortaya çıkarmak için, reseptörün yeterli miktarda ifade yoktur, çünkü muhtemelen hücreler, DHPG yanıt olmayan durumlarda uygulanabilir, duyarlı astrositler tanımlamak için bir pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir. Biz, astrositik Grup I mGluR&#39;leri değişiklikleri ortaya yardımcı olmak için 5 uM ve 15 uM (Şekil 3B) ve 30 uM ve 50 uM (Şekil 4A) de dahil olmak üzere DHPG farklı konsantrasyonlarda, kullanılır. Hücresel Ca2 + tepkileri ve Gq GPCR ekspresyon düzeyleri arasındaki ilişki, daha önce in vitro 21-24 incelenmiştir. İlk olarak,Belirli bir agonist konsantrasyon yanıt için eşik her bir hücre tarafından ifade reseptörlerinin yoğunluğuna bağlıdır. Bir hücre popülasyonunda, daha fazla hücreler hücre reseptörlerinin yüksek yoğunlukları ile transfekte edilir agonistin belirli bir konsantrasyona kadar bir Ca2 + yükselmesi ile yanıt verir. TTX dilimleri inkübasyondan sonra, popülasyondaki yüzde astrositlerin agonist artar sabit bir konsantrasyonunun (Şekiller 3B ve 3C) yanıt. Bu 30 ve 50 uM DHPG 5,0 mM K + &#39;e karşı kontrol tedavi edilen grup I mGluR cevapları karşılaştırmak için gerekli olan ise 5 uM ve 15 uM DHPG, kontrol ve tedavi edilen hücreler arasında TTX duyarlı astrositlerin yüzdesinde belirgin farklılıklar ortaya bulduk hücreleri (Şekil 4A). Astrositik Ca 2 + yanıtı desen ve agonist konsantrasyonu arasındaki ilişki de yerinde incelenmiştir. Agonist artırılmasıkonsantrasyonu, tek bir tepe noktası Ca 2 + 2 + yükseltiler yükseltiler 25-27 Ca multipeak ve yayla için ideal astrositlerde Ca 2 + tepkisinin desen kaydırır. Bu önceki bulgulara dayalı olarak, reseptör ekspresyon seviyesinde bir değişiklik olup olmadığını agonistinin tek bir konsantrasyonu için, yanıt modeli kayacak öngördü. Bu durumda, iki ölçekleme yöntemler (ki nöronal iltihaplanmayı önleyen veya artan) da kullanılmaktadır bağlı olarak, özel bir yanıt biçimine üretmek için gerekli agonist konsantrasyonu artırmak veya azalacaktır. Örneğin, TTX kuluçkaya astrositler daha plato-tipi Ca2 + yükselme için kendi DHPG uyarılmış Ca 2 + yanıt biçimine kayması ve astrositler (Şekil 3C) kontrol ile karşılaştırıldığında daha düşük agonist konsantrasyonu yanıt. Dikkate alarak daha önce yapılan çalışmalar, bu gözlemler, grup I mGluR astrositlerde reseptör ekspresyon seviyeleri artmış olduğunu göstermektedir. Ca 2 + yükselme süresi ve başlangıç ​​(gecikme) Rise doğrudan kültürlenmiş hücrelerde 22-24 Gq GPCR ekspresyon düzeylerinde değişikliklere ilişkili olduğu gösterilmiştir. Reseptör yoğunluğu azalma tersi bir etki üretir iken yüksek reseptör ekspresyon seviyeleri daha kısa tepki gecikmeleri ve hızlı yükselme zamanları neden. TTX, Ca kuluçkaya astrositlere için DHPG uygulaması ile uyarılmış 2 + transientler kontrol ACSF (Şekil 3D) kuluçkaya astrositlere karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha hızlı yükselmeye süreleri var. Agonist ile uyandırılmış Ca2 + tepkilerinin Daha önce de belirtildiği gibi, genlik bağımsız olarak agonist konsantrasyonu ya da ölçekleme modeli 15 (Şekil 3D) değişmeden kalır. Doğrudan aktive edici grubunu tarafından gözlenen değişikliklere ek olarak I mGluR&#39;leri DHPG ile, spontan astrosit Ca 2 + aktivitesi önemli ölçüde bu manipülasyon etkilenir. Biz gözlemlemekkontrolüne karşı TTX kuluçkaya kendiliğinden aktif astrositlerin yüzdesinde da 2.26 kat artış. Bu astrositler (Şekil 3E) kuluçkaya TTX 42,1% &#39;e soma spontan aktivite sergileyen kontrol astrositlerin sadece% 12,9&#39; den bir artıştır. Bilindiği için bu agonistin 21, 26, 28, yokluğu ve reseptör ekspresyon seviyelerinin arttırılması ile bu iç kaynaklı bir etkinlik düzeyi yükseldikçe, bu veriler, in GPCR&#39;ler sergi &quot;içsel&quot; ya da kurucu etkinlik bu astrositik Gq GPCR&#39;ler yoğunluğu arttıkça nöronal aksiyon potansiyeli ateş uzun vadeli azalma takip. Agonist ile uyarılan yanıtlar benzer şekilde, kendiliğinden Ca 2 + yükselmeler yükselişi zamanlar da (Şekil 3E) artmıştır. İkinci protokol, yüksek hücre dışı potasyum (5.0 mM) içinde inkübasyon kullanılarak Örnek veri, Fi gösterilmiştirGüre 4. Hücre dışı K + bazal CA3 nöron hareket potansiyeli frekansı 15 önemli bir artış olarak 2.5-5.0 mM sonuçlarından bir artış. DHPG (30 uM ve 50 uM) Daha yüksek konsantrasyonları yüksek potasyum (Şekil 4A ve 4B) içinde kuluçkalanmıştır astrositlerden Grup I mGluR Ca2 + tepkilerini uyarılması amacıyla gerekli bulunmaktadır. Bu nöronal aksiyon potansiyellerinin uzun süreli artış aşağıdaki astrositlerde Grup I mGluR yanıt azaltılmış bir seviyesi ile tutarlıdır. Buna ek olarak, DHPG bir sabit konsantrasyonuna karşı tepkisi model zayıf tek tepe tepkiler (Şekil 4B) plato-benzeri yanıtlardan geçer. İki potasyum koşullarda kendiliğinden aktif astrositlerin yüzdesini incelenmesi, yüksek K + kuluçkaya az astrositler kontrol koşulu (Şekil 4C) ile karşılaştırıldığında kendiliğinden etkin olduğunu ortaya koymaktadır. Bu etki, buna zıt olanSpontan Ca 2 + yükseltiler sergileyen astrositlerin yüzdesi artar edildiği TTX durumun e yönü. Son iki uyarılmış ve kendiliğinden olan Ca2 + yükselme kontrol koşulu (Şekil 4C ve 4D) karşı yüksek K + kuluçkaya astrositlerde yavaş bir yükselme süresine sahip. Genel olarak bu veriler, astrositik Gq GPCR ekspresyon seviyeleri iki-yönlü şekilde uzun bir süre boyunca hareket potansiyeli nöronal aktivitenin seviyesine bağlı olarak ölçeğe düşündürmektedir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. Dilim inkübasyon odası imalat ve ayarlayın. (A), hava geçirmez bir kapak ile birlikte bir Brinkmann pipet saklama kabının çekmece kısmı dilim inkübasyon odası oluşturmak için kullanılır. (B) Düst kabın yaklaşık 1 ¼ tarafında bir delik ve dere ¼ olarak taraftan. Esnek bir boru parça olarak monte edin. (C), esnek boru iç ucuna Microloader-manifold tertibatı bağlayın. Not cut-to-fit doğal 200 ul pipet ucu (beyaz ok). (D) Altı 20 ul Eppendorf microloaders cut-to-fit olan bir bir-altı satır manifolduna bir Microloader-kollektör cihazı oluşturmak için. (E) kapağı üzerinde iki küçük delik açın. (F) dilim tutucu yapmak için bir Yüzer Kabarcık Raf. (G) naylon örgü malzeme parçası tabanına yapıştırıldı, böylece kayan kabarcık rafın alt &quot;bacaklar&quot; kaldırılır. (H) ACSF yeterli bir miktarı ile inkübasyon odası doldurun dilim tutucu yüzer böylece. Microloaders uçları odasının katında bir köşesinde dinlenme böylece boru uzunluğunu ayarlayın. Inkübasyon odası yerleştirirkensu banyosu, banyo içindeki su seviyesi odası içindeki ACSF ile aynı seviyede olması gerekir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" target="_blank">büyük resim görüntülemek için.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2. Dilim sağlık Tahmini. (A) diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik kullanan sağlıklı görünümlü hipokampal dilim. Sağlıklı dilimler pürüzsüz, kadifemsi bir görünüm ve sağlıklı CA1 piramidal nöronlar yüksek bir yüzdesi var. Stratum radiatumunun merkezi içine çıkıntı apikal dendrit edin. Burada gösterilenler gibi bakmak nöronların Patch-kelepçe birkaç spontan aksiyon potansiyelleri ile standart 2.5 mM K + ACSF düşük istirahat membran potansiyeli (-61 -62 mV) ortaya koymaktadır. Membran potansiyeli ve ateşleme hızları eski bir fonksiyonu olarak değişirekstrasellüler K + (Xie et al. 15). Oklar varsayılan astrositlere etmektedir. Kısaltmalar: sr, stratum radiatum; s.py., stratum pyramidale. Ölçeği bar, 10 mikron. (B) Sağlıksız dilim kızarmış yumurta (beyaz oklar ölü nöronların çekirdekleri işaret - kızarmış yumurta &quot;yumurta sarısı&quot;) olarak görünüme sahip ölü CA1 piramidal nöronlar yüksek bir yüzdesi, sahip olacaktır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3,. Gq GPCR aktivitesi amplifiye edilmiş ve TTX kuluçkaya bırakılır, nöronal AP uzun süreli önlenmesi sonra uyarılmış Grup I mGluR Ca2 + tepkileri kayıt. (A) kayıt alanında hücre Örnek görsel c inkübeontrol Oregon Yeşil-BAPTA 01:00 Ca 2 + Gösterge boya (sol panel) ve SR-101 (orta panel) almış koşulları (üst panel) veya ttx (alt paneller) içinde. Ölçek çubuğu 10 mikron. Her iki sinyallerin Yerleşimi (&quot;birleştirme&quot;) Ca 2 + göstergesi olduğunu astrositlere yükü gösterir. Kutular astrositlerde Ca 2 + etkinliğini izlemek için yeşil kanal zamanla floresan yoğunluğu kaydetmek için bireysel astrocyte soma üzerine çizilir. Astrositlerde Ca 2 + aktivitesinin A kayıt kutularından (B) Örnek izleri). Yanıtın desen değişiklikler ile kanıtlandığı gibi TTX göstermek kuluçkaya Astrositler spontan aktivite artar ve daha sağlam bir uyarılmış grup I mGluR Ca2 + tepkileri. Tek bir tepe (daire), multipeak (dikdörtgen), ve plato (noktalı dikdörtgen) örnekleri Ca 2 + transientler gösterilmiştir. Cevap desenler (C) değişiklikler, farklı konsantrasyonu derişimi kullanılarak, özellikle belirgindirgrup I mGluR&#39;daki agonist DHPG rasyonlarına. Daha multipeak ve yayla yanıtları belirli bir agonist konsantrasyonu kontrol grubuna kıyasla TTX inkübasyondan sonra belirgindir. Genlikleri (alt panel) değişiklik yok iken (D) &quot;ya hep ya hiç&quot; yanıtı genliklerinin göstergesi, kontrol (üst panel) göre ttx kuluçkaya astrositlerde hızlı DHPG-uyarılmış Ca 2 + tepkilerin kez edilmektedir Rise kez cevap eşik ulaşıldı. (E) kendiliğinden astrosit süreleri Rise Ca 2 + geçici popülasyondaki astrositlerin yüzdesi kendiliğinden Gq GPCR Ca 2 + etkinliği artar (alt panel) sahip iken, astrositler (üst panel) kuluçkalanmıştır aynı zamanda daha hızlı olarak kontrol TTX genel kuluçkalanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 4," fo:content-wiDTH = &quot;6in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Şekil 4. Yüksek bir hücre dışı potasyum kuluçkaya bırakılır, nöronal AP için uzun süreli kayıt artarak azalan astrositik Gq GPCR aktivitesi ve uyarılmış Grup I mGluR Ca2 + tepkileri. (A) 5.0 mM K + ACSF kuluçkalanmıştır kesitlerden astrosit Ca 2 + kayıtların Örnek izleri nöronlar depolarize ve ACSF (2.5 mM K + ACSF) kontrol karşılaştırıldığında bazal atış oranını artırmak için. 5.0 mM K + ACSF sergi daha az spontan somatik Ca 2 + geçici ve zayıf DHPG ile kuluçkaya Astrositler kontrol ACSF kuluçkaya astrositlere göre tepkiler. (B) DHPG birden konsantrasyonlarda uyarılmış yanıtların kalıplarının karşılaştırılması nöronal AP uzun vadeli yükselişin ardından daha zayıf tepki türleri ortaya koymaktadır. Po astrositlerin yüzdesi olarak (C) bir azalmaspontan aktivite yükselmesi kat daha yavaş (alt panel) olmak ise kendiliğinden Ca 2 + aktivite sergileyen pulation, yüksek K uzun süreli kuluçkadan sonra gözlenen + ACSF (üst panel) kontrol etmek için karşılaştırılır. (D) DHPG değişik konsantrasyonlarda uyarılmış astrosit süreleri Ca 2 + tepkileri Rise kontrol ACSF kuluçkaya astrositlere kıyasla 5.0 mM K +, tedavi sonrasında daha yavaş olur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a>

Burada astrositik G-protein bağlı reseptörlerin plastisite çalışma için nöronlarda homeostatik plastisite indüklemek için kullanılan protokol bir uyarlama tarif eder. En son astrositik grubu çocuk farelerde I mGluR&#39;leri değişiklikleri incelemek için kullanılan yöntem, in situ ve in vivo olarak erişkin farelerden dokuda çeşitli astrositik GPCRs ölçekleme ölçülmesi ve astrositik reseptörlerinin duyarlılığının daha iyi takdir elde etmek için uygulanabilir nöronal aktivite değişikliklere.

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Bu prosedürün genel amacı, nöronal sinaptik transmisyondaki değişikliklere yanıt olarak astrosit GQG protein kenetli reseptör sinyalleşmesinde uzun süreli artış veya azalma sağlamaktır. Bu, öncelikle yabani tip farelerden akut hipokampal dilimler hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım, astrositleri işaretlemek için dilimlere sulur Rumine 1 0 1 uygulamaktır.Ardından, nöronal aksiyon potansiyellerini engellemek için akut hipokampal kesitler dört ila altı saat boyunca tetrodotoksin içeren ortamda veya düzenli yapay serebrospinal sıvıda inkübe edilir. Son adım, bir geri basınç yükleme protokolü kullanılarak kesitin stratum radiatum tabakasındaki astrositlerin kalsiyum indikatörü ile doldurulmasıdır. Nihayetinde, spontan ve uyarılmış astrosit kalsiyum geçişlerindeki değişiklikler kaydedilerek astrosit Gq GPCR sinyal aktivitesindeki değişimleri göstermek için konfokal mikroskopi kullanılır.Bu yöntem, astrosit reseptör plastisitesi ve TQG PCR sinyallezmesindeki ilişkili değişiklikler hakkında bilgi sağlar. Ayrıca nöronlardaki metabotropik reseptörlerin homeostatik plastisitesini ölçmek için de kullanılabilir. Bu prosedüre başlamak için vibratörü açın ve drenajın kapalı olduğundan emin olun.Ardından kesme odasını vibratomda sabitleyin ve kesme odasının etrafını buzla doldurun. Sonra, çift ağızlı tıraş bıçağını beş dakika boyunca %70 etanol içinde bekleterek ve ardından çift distile su ile durulayarak fabrika gresinden arındırın. Bıçağı dikkatlice ikiye bölün ve beyin kesiti hazırlama işlemi için bir yarısını kesme bloğuna monte edin.Daha fazla soğutma ve oksijenasyon için yüzey alanını artırmak amacıyla, soğutulmuş jiletle ikiye bölünmüş fare beyni bir Petri kabına alındı. Bölünmüş hemisferlerin, tamamen soğuması ve daha katı hale gelmesi için buz gibi soğuk dilimleme tamponunda iki ila üç dakika bekletilmesine izin verildi. Ardından, vibratom platformuna ince bir tabaka hızlı yapıştırıcı sürüldü ve her iki hemisfer platforma sabitlendi.Kesik yüzeyler aşağı, yan taraflar yukarı ve olfaktör bulb önüye bakacak şekilde platformu kesim odasına sabitleyin. Kesim odasını buz gibi, iyi oksijenlendirilmiş dilimleme tamponu ile doldurun. Vibratomu kullanarak 300 mikron kalınlığında parasajital dilimler hazırlarken kesim odasını oksijenlendirmeye devam edin. Dilimleme işleminden sonra, her bir parasajital dilimdeki hipokampüsü ve bitişik entorinal korteksi buz gibi, iyi oksijenlendirilmiş dilimleme tamponu içerisinde ayırın.Bir transfer pipeti hazırlamak için, cam bir pastör pipetinin uzun ucunu kırın ve kırılan kısmı bir pipet pompasıyla kapatın. Hipokampal dilimleri, 35 °C'lik su banyosundaki inkübasyon kamarasına tek tek aktarın. Görünürlüğü artırmak amacıyla, bu adımların inkübasyon kamaraları 35 °C'lik su banyosunun dışındayken gösterildiğini lütfen unutmayın.Hipokampal dilimleri, 35 °C'lik su banyosunda, düşük kalsiyumlu A CSF içinde seyreltilmiş 1 µM SR 1 0 1 içinde 20 dakika boyunca inkübe edin. Ardından dilimleri, SR 1 0 1 içermeyen düşük kalsiyumlu A CSF'ye aktarıp 10 dakika daha bekletin. Isıtarak geri kazandırın.Ardından, dilimleri sıcak inkübasyonun geri kalan 15 dakikası için kontrol veya deney A CSF'sine aktarın. 45 dakikalık toparlanma süresinin ardından, inkübasyon odalarını 35 °C'lik su banyosundan dikkatlice tezgaha taşıyın ve bolus yükleme protokolüne başlamadan önce dilimlerin oda sıcaklığında toplam üç saat boyunca inkübe olmaya devam etmesini sağlayın. Bu prosedürde, boya çözeltisiyle doldurulduğunda yaklaşık 1,3 MΩ dirence sahip olacak şekilde çekilmiş bir borosilikat cam kılcal tüpten bir pipet hazırlayın.Ardından, bir hipokampal kesiti bir kayıt odasına yerleştirin ve 1,5 mililitre/dakika hızında oksijenle zenginleştirilmiş A CSF ile sürekli olarak perfüze edin; yalnızca yüksek yüzdede sağlıklı CA1 piramidal hücrelere ve pürüzsüz görünümlü bir yüzeye sahip olan hipokampal kesitleri kullanın ve sağlıksız görünenleri atın. Diferansiyel girişim kontrast optiği kullanarak, kesit yüzeyinin 40 ila 70 mikron altında, stratum radiatum'da uygun bir astrosit alanı belirleyin. Daha sonra, D çözeltisi ile önceden doldurulmuş cam pipeti standart bir patch clamp mikroelektrot tutucuya yerleştirin.Pipeti kesit yüzeyindeyken, alanı kapsayacak şekilde kesit yüzeyine indirin. Boyanın çıkışını başlatmak için pipete pozitif basınç uygulayın. Bir mikromanipülatör kullanarak pipeti yavaşça kesit yüzeyinin yaklaşık 40 mikron altına indirin ve boyanın yaklaşık 45 ila 60 saniye boyunca çıkmasını sağlayın.Ardından pipeti 35 mikron daha aşağı indirin ve boyayı yaklaşık 45 ila 60 saniye boyunca boşaltın. Sonrasında, çok sayıda astrositin boyayı almasını sağlamak için pipet ucunu kesitten yavaşça geri çekin. Genellikle kısa bir mesafe öteye ikinci bir boya bolusu enjekte etmek faydalıdır.Bunu yapmak için, pipeti tekrar kesit yüzeyine geri çekin ve pipetin tıkalı olmadığından emin olun. Ardından pipeti stratum radium boyunca ilk enjeksiyon bölgesinden yaklaşık 80 ila 100 mikron uzağa taşıyın, bu bölgede bolus enjeksiyonu tekrarlayın ve astrositleri görüntülemeden önce konfokal mikroskobun görüntüleme için hazırlanması için 30 ila 45 dakika bekleyin. Kesitin lazer ışığına maruz kalmasını sınırlamak büyük önem taşımaktadır, çünkü yüksek maruziyet boya solmasına ve/veya fototoksisiteye yol açabilir.Her bir lazer için varsayılan değerleri yüksek bir fotomultiplier ayarına, bir x kazanca ve 0.5% lazer çıkış gücü saatine ayarlayın. Ardından, astrosit süreçlerinin daha iyi görüntülenmesi için 1.5 x zoom uygulayın. Daha sonra alan çözünürlüğünü 512 piksel x 512 piksel olarak ayarlayın.Ardından, tarama hızını tarama başına yaklaşık 1,2 saniye olan mümkün olan en yüksek hıza ayarlayın. Tek yönlü tarama modunu kullanarak, 488 nanometrelik lazer için 503 ila 548 nanometre, 559 nanometrelik lazer için ise 624 ila 724 nanometrelik bant geçiren filtrelerle emisyon spektrumlarını toplayın. Daha sonra, SR 1 0 1 ko-etiketlemesini görselleştirerek kalsiyum boyasıyla yüklenmiş hücrelerin astrosit olduğunu doğrulayın.Astrosit kalsiyum aktivitesini kaydetmek için 559 nanometrelik lazer kullanılır. İlk olarak, görüntüleme yazılımını kullanarak hücre içindeki ilgi bölgelerinin üzerine, bu durumda astrosit hücre gövdelerinin üzerine kutular çizin. Ardından, referans olarak arka planın üzerine bir kutu çizin.ROI'lerden spontan kalsiyum aktivitesinin 10 dakikalık baseline kayıtlarını alın. Ardından, olası reseptör desensitizasyonunu azaltmak için uygulamalar arasında minimum beş dakika bırakarak, seçilen bir agonisti ardışık olarak artan konsantrasyonlarda uygulayın. Kaydın sonunda, Inpact astrositik GQ GPCR sinyal yolakları için pozitif kontrol olarak diğer astrositik GQ, GPCR'ler için agonist kokteyli uygulayın.Kalsiyum kaydı tamamlandığında, astrosit kimliğinin ve ROI yerleşiminin daha sonra doğrulanması için 488 nanometre ve 559 nanometre lazerlerle durağan görüntüler alın. Burada, kontrol koşullarında veya TTX ile inkübe edilen, Oregon Green BAFTA 1:00 AM kalsiyum indikatör boyası ve SR 1 0 1 alan kayıt alanındaki hücrelerin temsili görüntüleri yer almaktadır. Her iki sinyalin üst üste bindirilmiş görüntüsü, kalsiyum indikatörü yüklü astrositleri göstermektedir; astrositlerdeki kalsiyum aktivitesini izlemek için yeşil kanalda zamanla floresan yoğunluğunu kaydetmek amacıyla bireysel astrosit somaları üzerine kutular çizilmiştir.Burada, astrositlerdeki kalsiyum aktivitesinin kayıt kutularından alınan örnek izler yer almaktadır; TTX ile inkübe edilen astrositler, yanıt paternindeki değişikliklerin kanıtladığı üzere, artmış spontan aktivite ve daha güçlü uyandırılmış grup bir MGL R kalsiyum yanıtları göstermektedir. Tek pikli, çok pikli ve plato tipi kalsiyum geçişlerine örnekler gösterilmiştir ve burada, nöronları depolarize etmek ve bazal ateşleme hızlarını 2,5 millimolar potasyum kontrol A CSF'sine kıyasla artırmak için 5,0 millimolar potasyum içeren A CSF'de inkübe edilen kesitlerden alınan astrosit kalsiyum kayıtlarının temsili izleri bulunmaktadır. 5,0 millimolar potasyum A CSF ile inkübe edilen astrositler, kontrol A CSF'de inkübe edilen astrositlere kıyasla daha az spontan somatik kalsiyum geçişi ve daha zayıf DHPG uyandırılmış yanıtlar sergilemektedir. Astrosit kalsiyum görüntüleme, G-proteini kenetli reseptör sinyalizasyonundaki değişikliklerin güzel bir fonksiyonel okumasını sağlar.Ancak, bu yöntem sinyal yolunun neresinde bu değişikliklerin meydana geldiğini tam olarak belirleyemez. Bu nedenle, tamamlayıcı bir yaklaşım olarak, yeşil floresan protein ekspres eden astrositler üzerinde floresan aktive hücre ayıklama veya akış sitometrisi kullanmak, ardından ilgili G-proteini kenetli reseptöre karşı bir antikor uygulamak ve sonrasında reseptör ekspresyon seviyelerindeki değişiklikleri incelemek için western blot analizleri gerçekleştirmek olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, astrositlerde spontan ve Agnos tarafından uyarılmış kalsiyum olaylarını kaydederek nöronal sinaptik iletimdeki değişiklikleri takip etmenin ardından, astrosit tqt PCR aktivitesinin ölçeklendirmesinin nasıl ölçüleceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

inducing-plasticity-astrocytic-receptors-manipulation-neuronal-firing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

İzole hipokampi akut beyin kesitleri, hem de astrosit ve nöronların eşzamanlı elektrofizyolojik...

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Striatumdaki astrosit hücre içi Ca2+ sinyallerinin özellikleri ve işlevleri tam olarak araştırılmamıştır. Striatal astrositlerde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini ifade etme yöntemlerini, adeno-ilişkili serotip 2/5 (AAV2/5) virüslerini ve ayrıca striatal astrositler içindeki Ca2+ sinyallerini yerinde güvenilir bir şekilde görüntüleme prosedürlerini açıklıyoruz.

Görüntüleme hücre içi Ca 2+ Genetik olarak kodlanmış Kalsiyum Göstergelerini Kullanma Yetişkin fareler ile Striatal Astrositler Sinyalleri

Bu makale, yetişkin farelerde ön beyin bıçak yaralanması oluşturmak için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Bıçak yaralanması, daha sonra standart immünohistokimya yöntemleriyle incelenebilen ciddi reaktif gliozis ve glial skar oluşumuna neden olur.

Reaktif gliozis Tetikleme<em&gt; In Vivo</em&gt; Bir Önbeyin Stab Yaralanma tarafından

Vagus sinir stimülasyonu (VNS) davranışları bir dizi değiştirmek için ön beyinde hedeflenen sinaptik plastisite ikna etmek için bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol korku söndürme bellek konsolidasyonu kolaylaştırmak için VNS uygulamak açıklamaktadır.

Aracı Olarak vagus sinir stimülasyonu Extinction Öğrenme İlgili Pathways Plastisitesi tetikleyebilecek

Bu iletişim kuralı bir en iyi duruma getirilmiş Nuygulanmasını gösteren-metil-D-glucamine (NMDG) koruyucu kurtarma yöntemi beyin dilim hazırlık. Bir tek medya formülasyon güvenilir bir şekilde sağlıklı beyin dilimleri her yaştan ve çeşitli deneysel uygulamalar için hayvanlardan elde etmek için kullanılır.

En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

Bu iletişim kuralı oksijen seviyesini geri dönüşümlü arabellek küçük bir hacim ve etkinlik bağımlı sinaptik plastisite batık akut Hipokampal dilimler halinde kayıt metodolojik açıdan istikrar açıklar.

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Burada astrositik ağlar organizasyonu değerlendirmek için bir protokol mevcut. Açıklanan yöntemi hücre sayısı, boyutu, alan ve bir çekirdek içinde pozisyon gibi bu ağların açıklayıcı ölçüleri sağlamak için önyargı en aza indirir. Anizotropi vektörel bir analizi ile değerlendirilir.

Boyut, şekil ve yön ağlar yönetim eşleşmiş Astrocytes analiz

Burada, uyanık, baş kısıtlı farelerde beyin hücrelerinin uzunlamasına görüntülenmesi için kronik bir kraniyal pencerenin implantasyonu için bir protokol sunulmaktadır.

Uyanık Farelerde Tekrarlanan In Vivo Görüntüleme için Kraniyal Pencerenin İmplantasyonu

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Burada, ex vivo beyin dilimlerinde tutulan dorsal lateral genikülat çekirdekten röle nöronlarında nöronal içsel uyarılabilirliğin uzun vadeli plastisitesini indüklemek için bir protokol açıklıyoruz.

Dorsal lateral genikülat çekirdeğin nöronlarında içsel nöronal uyarılabilirliğin uzun süreli plastisitesinin indüklenmesi

Bu protokol, birden fazla hafıza ile ilgili beyin bölgesinde nöronlardan ve astrositlerden gelen kalsiyum sinyallerinin eşzamanlı kaydı için kapsamlı bir yöntem tanımı sunar ve öğrenme ve hafıza davranışı paradigmasında uygulanmasını gösterir.

Öğrenme ve Hafıza Davranışları sırasında Astrosit-Nöron Aktivitesini Birden Fazla Beyin Bölgesinde KaydEtmek İçin İki Renkli Lif Fotometri Yöntemi

Öğrenin, akut hipokampal kesitler ve konfokal mikroskopi kullanarak astrositik GPCR sinyalindeki uzun süreli değişiklikleri nasıl indükleyeceğinizi. Bu yöntem, sinirbilim araştırmalarında astrosit plastisitesini incelemek için kullanılır.

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Daha fazla video keşfet