Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Bu prosedürün genel amacı, nöronal sinaptik iletimdeki değişikliklere yanıt olarak astrosit GQG proteinine bağlı reseptör sinyallemesinde uzun süreli artış veya azalmayı indüklemektir. Bu, önce vahşi tip farelerden akut hipokampal dilimler hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım, astrositleri etiketlemek için dilimlere sulur Rumine 1 0 1 uygulamaktır.

Daha sonra, akut hipokampal dilimler, nöronal aksiyon potansiyellerini bloke etmek için veya düzenli yapay beyin omurilik sıvısında dört ila altı saat tetrodatoksin inkübe edilir. Son adım, bir geri basınç yükleme protokolü kullanarak dilimin stratum radi atomundaki astrositleri kalsiyum indikatörü ile yüklemektir. Sonuç olarak, konfokal mikroskopi, spontan ve uyarılmış astrosit kalsiyum geçişindeki değişiklikleri kaydederek astrosit GQ GPCR sinyal aktivitesindeki değişiklikleri göstermek için kullanılır.

Bu yöntem, astrositlerin reseptör plastisitesi ve TQG PCR sinyallemesindeki ilişkili değişiklikler hakkında bilgi sağlar. Nöronlardaki metabotropik reseptörlerin homeostatik plastisitesini ölçmek için de kullanılabilir. Bu işleme başlamak için vibratoyu açın ve drenajın kapalı olduğundan emin olun.

Ardından kesme haznesini vibratoya sabitleyin ve kesme haznesinin etrafına buz sarın. Ardından, çift kenarlı tıraş bıçağından fabrika yağını beş dakika boyunca %70 etanol içinde bekleterek ve ardından çift damıtılmış suyla durulayarak çıkarın. Dikkatlice ikiye bölün ve beyin dilimi hazırlığı için bir yarısını kesme bloğuna monte edin.

Bir fare beyni elde ettikten sonra, soğutma ve oksijenasyon için daha fazla yüzey alanı sağlamak için bir Petri kabında soğutulmuş tıraş bıçağıyla ikiye bölünür. İkiye bölünmüş yarım kürelerin buz gibi dilimleme tamponunda iki ila üç dakika oturmasına izin verin ve tamamen serin ve daha katı hale gelin. Bundan sonra, vibrato yapıştırıcısının platformuna, her iki yarım küre de platforma ince bir çılgın yapıştırıcı tabakası uygulayın.

Kesik taraflar aşağı ve yan taraflar yukarı bakacak ve koku soğanı öne bakacak şekilde platformu kesme haznesine sabitleyin. Kesme haznesini buz gibi soğuk, iyi oksijenli dilimleme tamponu ile doldurun. Vibrato kullanarak 300 mikron kalınlığında para sagital dilimler hazırlarken kesme haznesini oksijenlendirmeye devam edin Dilimlemeden sonra, buz gibi soğuk iyi oksijenli dilimleme tamponunda her bir para sagital dilimden hipokampus ve bitişik endrin korteksini inceleyin.

Bir transfer pipeti yapmak için, bir cam mera pipetinin uzun ucunu kırın ve kırılan parçayı bir pipet ampulü ile doldurun. Hipokampal dilimleri birer birer 35 santigrat derece su banyosundaki kuluçka odasına aktarın. Görünürlük amacıyla, bu adımların 35 santigrat derece su banyosunun dışındaki kuluçka odaları ile gösterildiğini lütfen unutmayın.

Hipokampal dilimleri, 35 derecelik su banyosunda düşük kalsiyum A BOS ile seyreltilmiş bir mikromolar SR 1 0 1'de 20 dakika inkübe edin. Daha sonra bunları 10 dakika daha SR 1 0 1 içermeyen düşük kalsiyumlu A BOS'a aktarın. Sıcak iyileşme.

Daha sonra, ılık inkübasyonun kalan 15 dakikası boyunca dilimleri kontrol veya deneysel A BOS'a aktarın. 45 dakikalık toparlanmadan sonra, inkübasyon odalarını 35 santigrat derece su banyosundan tezgah üstüne dikkatlice taşıyın ve bolus yükleme protokolüne başlamadan önce dilimlerin toplam üç saat oda sıcaklığında inkübe etmeye devam etmesine izin verin. Bu prosedürde, boya çözeltisi ile doldurulduğunda yaklaşık 1.3 mega ohm'luk bir dirence çekilen bir boro silisik cam kılcaldan bir pipet hazırlayın.

Daha sonra, bir kayıt odasına bir hipokampal dilim yerleştirin ve dakikada 1,5 mililitre oksijenli A BOS ile sürekli perfüze edin, yalnızca yüksek oranda sağlıklı CA bir parametal hücresi ve pürüzsüz görünen bir yüzeye sahip bir hipokampal dilim kullanın ve sağlıksız görünüyorsa atın. Diferansiyel girişim kontrast optiklerini kullanarak, dilim yüzeyinin 40 ila 70 mikron altındaki stratum radyumunda uygun bir astrosit alanı bulun. Ardından, D çözeltisi ile önceden yüklenmiş cam pipeti standart bir yama kelepçeli mikro elektrot tutucusuna yerleştirin.

Pipet dilimin yüzeyinde olacak şekilde alanın üzerindeki dilimin yüzeyine indirin. Boyayı çıkarmaya başlamak için pipete pozitif basınç uygulayın. Bir mikro manipülatör kullanarak pipeti dilim yüzeyinin yaklaşık 40 mikron altına yavaşça indirin ve boyanın yaklaşık 45 ila 60 saniye dışarı çıkmasına izin verin.

Ardından pipeti 35 mikron daha indirin ve boyayı yaklaşık 45 ila 60 saniye boyunca çıkarın. Daha sonra, çok sayıda astrositin boyayı aldığından emin olmak için pipet ucunu dilimden yavaşça geri çekin. Kısa bir mesafe uzağa ikinci bir boya bolusu enjekte etmek genellikle yararlıdır.

Bunu yapmak için pipeti dilimin yüzeyine geri kaldırın ve pipetin tıkalı olmadığından emin olun. Daha sonra pipeti stratum radyum boyunca ilk enjeksiyon bölgesinden yaklaşık 80 ila 100 mikron uzağa hareket ettirin, bu bölgede bolus enjeksiyonunu tekrarlayın ve astrositleri görüntülemeden önce görüntüleme için konfokal mikroskobu kurmak için 30 ila 45 dakika bekleyin. Dilimin sınırlandırılması: Lazer ışığına maruz kalma son derece önemlidir, çünkü yüksek maruz kalma boya ağartmasına ve/veya fototoksisiteye yol açabilir.

Her lazer için varsayılan değerleri yüksek fotoğraf çarpanı ayarına, bir x kazanç ve %0,5 lazer çıkış gücü saatine ayarlayın. Ardından, astrosit süreçlerinin daha iyi görselleştirilmesi için 1,5 x yakınlaştırma uygulayın. Ardından alan çözünürlüğünü 512 piksele 512 piksel olarak ayarlayın.

Bundan sonra, tarama hızını mümkün olan en yüksek hıza ayarlayın, bu da tarama başına yaklaşık 1,2 saniyedir. Tek yönlü tarama modunu kullanarak, 488 nanometre lazer için 503 ila 548 nanometre ve 559 nanometre lazer için 624 ila 724 nanometre bant geçiren filtreler kullanarak emisyon spektrumlarını toplayın. Ardından, SR 1 0 1 ortak etiketlemesini görselleştirerek astrositler olarak kalsiyum boya yüklü hücrelerin kimliğini doğrulayın.

Astrosit kalsiyum aktivitesini kaydetmek için 559 nanometre lazeri kullanma. İlk olarak, bu durumda astrosit hücre gövdeleri üzerinde görüntü elde etme yazılımını kullanarak hücreleri hücre içindeki ilgi bölgelerinin üzerine çizin. Ardından referans olarak arka planın üzerine bir kutu çizin.

ROI'lerden spontan kalsiyum aktivitesinin 10 dakikalık temel kaydını elde edin. Daha sonra, sırayla artan konsantrasyonlarda bir ilgi agonisti uygulayın ve olası reseptör duyarsızlaşmasını azaltmak için uygulamalar arasında en az beş dakika bırakın. Kaydın sonunda, Inpact astrositik GQ GPCR sinyal yolları için pozitif bir kontrol olarak diğer astrositik GQ, GPCR için bir agonist kokteyli uygulayın.

Kalsiyum kaydının tamamlanmasının ardından, astrosit kimliğinin ve ROI yerleşiminin daha sonra doğrulanması için 488 nanometre ve 559 nanometre lazerlerle hareketsiz görüntüler çekin. İşte kayıt alanındaki, kontrol koşullarında veya TTX'te inkübe edilmiş, Oregon Green BAFTA 1:00 kalsiyum indikatör boyası ve SR 1 0 1 almış hücrelerin temsili görüntüleri. Her iki sinyalin üst üste binmesi, kalsiyum gösterge kutuları ile yüklenen astrositlerin, astrositlerdeki kalsiyum aktivitesini izlemek için yeşil kanalda zaman içinde floresan yoğunluğunu kaydetmek için tek tek astrositlerin somalarının üzerine çekildiğini gösterir.

İşte astrositlerdeki kalsiyum aktivitesinin kayıt kutularından alınan örnek izler: TTX'te inkübe edilen astrositler, yanıt modelindeki değişikliklerle kanıtlandığı gibi, artmış spontan aktivite ve daha sağlam uyarılmış birinci grup MGL R kalsiyum yanıtları gösterir. Tek tepe, çok tepe ve plato kalsiyum geçici örnekleri gösterilmiştir ve burada, nöronları depolarize etmek ve bazal ateşleme hızlarını artırmak için 5.0 milimolar potasyum A BOS içinde inkübe edilen dilimlerden astrosit kalsiyum kayıtlarının temsili izleri verilmiştir. 5.0 milimolar potasyum A ile inkübe edilmiş BOS astrositleri 5.0 milimolar potasyum A BOS sergiler, kontrolde inkübe edilen astrositlere kıyasla daha az spontan somatik kalsiyum geçişleri ve daha zayıf DHPG uyarılmış yanıtlar. Bir BOS Astrosit kalsiyum görüntülemesi, G-proteinine bağlı reseptör sinyallemesindeki değişikliklerin güzel bir fonksiyonel okumasını sağlar.

Ancak, bu değişikliklerin sinyalizasyon yolunun neresinde gerçekleştiğini tam olarak belirleyemiyor. Bu nedenle, tamamlayıcı bir yaklaşım, yeşil floresan proteini eksprese eden astrositler üzerinde floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması veya akış sitometrisi kullanmak, daha sonra ilgilenilen G-proteinine bağlı reseptöre bir antikor uygulamak ve daha sonra reseptör ekspresyon seviyelerindeki değişiklikleri aramak için western blotları çalıştırmak olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, spontan ve Agnes'in astrositlerdeki kalsiyum olaylarını uyararak nöronal sinaptik iletimdeki değişiklikleri takiben astrosit tqt PCR aktivitesinin ölçeklenmesini nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.