Nöbet gibi Aktivite Analizi ve Hareket için A Düşük maliyetli Yöntemi Drosophila

Bu prosedürün genel amacı, drosophila'da lokomotor veya nöbet davranışlarındaki değişiklikleri tanımlamaktır. Bu, önce sineklerin anestezi kullanılarak ayrı şişelere ayrılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, Sineklerin hareketini kaydetmek için basit bir web kamerası kullanılır.

Veriler daha sonra analize başlamak için Görüntü J'ye aktarılır. Son olarak, kayıt süresi boyunca hareketin mesafesini, hızını ve süresini belirlemek için özel yapım sinek analiz yazılımı kullanılır. Sonuç olarak, bu tahlil, genetik ve farmakolojik manipülasyonlarla ilişkili lokomotor veya nöbet davranışındaki değişiklikleri gösterebilir.

Şimdi, tarif edeceğimiz bu düşük maliyetli kayıt tekniği, meyve sineklerinde hem nöbet davranışını hem de hareketi analiz etmek için kullanılabilir. Özellikle, bu sineklerde nöbet davranışını değiştiren genetik ve farmakolojik manipülasyonları tanımlamak için kullandık. Ancak bugün, laboratuvarımda bir lisans araştırma görevlisi olan Chris Burner, lokomotor ve nöbet tahlilleri sırasında sinekleri kaydedecek web kamerasını kurmaya başlamak için bu tekniği gösterecek.

Kamera yerleştirildikten sonra, kullanışlı bir VI yazılım programını açın. Kayıt ayarlarını yapmak için, yakalama sekmesi altındaki hızlandırılmış görüntüler seçeneğini seçin ve yeni pencere açıldığında, yakalama cihazı olarak web kamerasını seçin. Çoğu deney için, altı 40 x dört 80'lik bir video kare boyutu yeterlidir Sıkıştırma seçeneği altında, Intel IUV codec bileşenini seçin ve tahlillere göre kare başına saniyeyi ayarlayın.

Gelişmiş sekmesi altında, her yakalama için bir bitmap görüntü dosyası oluşturun ve programın kaydedildikten sonra görüntü yığınını saklaması için bir klasör seçin. Sonra bir kağıda ölü bir sinek yerleştirin. Video ayarları kutusuna tıklayın ve cihaz ayarları sekmesi altında, parlak beyaz arka plan daha koyu sinekle net bir kontrast oluşturana kadar ayarları yapın.

Kayda başlamak için Başlat düğmesine tıklayın. Kayıt süresi bittiğinde, durdur düğmesine tıklayın. Görüntü yığını şimdi lokomotor aktivite testini başlatmak için seçilen klasörde olmalıdır.

Sinekleri, pamuklu bir tapa ile kapatılmış ayrı şişelere aktarın. Devam etmeden önce sineklerin 20 ila 30 dakika rahatsız edilmeden oturmasına izin verin. Bu sürenin sonunda, test edilecek sineği şişeden ve bir Petri kabı kapağının altına hafifçe vurun.

Kapak, hava akışına izin vermek için küçük yarıklar içermelidir, sineği daha önce ayarlanmış web kamerasının altına yerleştirin. Hazır olduğunuzda, lokomotor aktivitesini kaydetmeye başlamak için başlat düğmesine basın. Nöbet testinin ilk adımı, standart ortam veya test edilecek ilaçla karıştırılmış ortam olan iki günlük nöbete duyarlı sinekleri beslemektir.

İki günlük beslenmeden sonra, sinekleri tek tek boş şişelere hafifçe vurarak aktarın ve şişeleri pamuklu bir tıkaç ile kapatın. Gözlemden önce sineklerin 20 dakika boyunca rahatsız edilmeden oturmasına izin verin. Hazır olduğunuzda, bir laboratuvar girdabında veya 10 saniye boyunca en yüksek ayarları kullanarak bir şişeyi girdaplayın.

Hareketsiz hale getirilmiş sineği hemen web kamerasının hemen altındaki beyaz bir kağıda yerleştirin. Yerleştirildikten sonra kayda başlayın. Bu aktivite uçar.

Sinek, felç dönemleri ile serpiştirilmiş hızlı koordinasyonsuz hareketlere maruz kalacaktır. Sinek kendini düzelttiğinde kayıt sonlandırılır. Verileri analiz etmeye başlamak için, açıldıktan sonra ücretsiz görüntü işleme yazılımı image J'yi açın.

Önce dosya sekmesine tıklayarak ve ardından içe aktar'ı seçerek istediğiniz görüntü yığınını içe aktarın. Ve son olarak, görüntü dizisi. Görüntü yığınını içeren klasörü seçin ve bir görüntü açın.

Sıra seçenekleri iletişim kutusu açıldığında, adları sayısal olarak sırala'yı seçin ve ardından öğesini seçin. Tamam. Görüntü yığını şimdi Görüntü J'ye yüklenecektir.Ardından, görüntü sekmesini seçin ve değer türünü sekiz bit olarak ayarlayın. Görüntü sekmesine tekrar tıklayın ve ayarla seçeneğinin altında eşiği seçin.

Bu, tüm görüntülerdeki eşiği ayarlar, böylece her biri beyaz bir arka plandan oluşur ve sinek siyah bir noktaya dönüştürülür. Bu aynı zamanda kesme noktalarının ayarlanabileceği eşik iletişim kutusunu da açar. Herhangi birinin fazladan siyah nokta içerip içermediğini veya noktanın eksik olup olmadığını görmek için görüntüleri tarayın.

Gerekirse, herhangi bir sorunu hafifletmek için eşiği ayarlayın. Ayarlamalar yapıldıktan sonra, eşik iletişim kutusunda uygula'yı seçin. Maskeye dönüştür iletişim kutusu açıldığında, görüntü yığınının eşiğini almak için Tamam'ı tıklayın.

Sineğin hareketini piksel cinsinden ölçmek için, eklentiler sekmesi altındaki çoklu izleyici eklentisini seçin. Nesne izleyici iletişim kutusu göründüğünde, verilen seçeneklerin dördünü de tıklatın ve seçin. Tamam. Çoklu izleyici eklentisi daha sonra koordinatları siyaha ekleyecektir.

ve bunları Sonuçlar penceresinde ve piksel cinsinden toplam uzunluğu listeleyin. Yollar penceresi, sineğin izlediği yolun grafiksel görüntüsünü verir. Sonuçlar penceresinden X ve Y koordinat listesini kopyalayın ve verileri bir Excel elektronik tablosuna yapıştırın.

Yığındaki herhangi bir slaytta siyah yoksa, çoklu izleyici programı o slaytta duracaktır. Böyle bir durumda, sineğin siyah olarak kaydolduğundan emin olmak için yığını yeniden eşikleyin.

söz konusu slaytta. Yol uzunluklarını piksellerden santimetreye dönüştürmek için, boş beyaz bir kağıt parçası üzerinde bilinen bir mesafe aralıklı iki noktanın görüntüsünü alın. İki nokta için XY piksel koordinatlarını belirleyin ve daha doğru sonuçlar için bir santimetreye karşılık gelen piksel sayısını belirlemek için bu bilgileri kullanın.

XY koordinatlarını özel yapım bir sinek analiz programına aktararak görüntülerdeki gürültüyü giderin. Açıldıktan sonra, her genotipten veya tedaviden verileri ayrı elektronik tablolara aktarın. Ardından, özet sayfası sekmesini seçin ve beni tıkla düğmesine tıklayın.

Analiz türüne göre bir eşik değeri seçin, Tamam'a tıklayın, program hareketin hızını, süresini ve mesafesini hesaplayacaktır. Bu temsili yollar, metformin tedavisi olan ve olmayan mutant sineklerde nöbet benzeri aktivite gösterir. Test edilen iki mutantta tedavi ile nöbet aktivitesi azaldı.

Metformin, hem nöbet testi sırasında taşınan mesafeyi hem de nöbet benzeri aktivitenin toplam süresini önemli ölçüde azalttı. Buna karşılık, bu bireysel lokomotor yollarda ortalama hızda bir değişiklik olmadı. Vahşi tip CS sineğinin yolu, dairesel arenanın çevresi etrafındaki konsantrasyonu gösterir.

Mutant bir BSS sineğinin yolu aynı konsantrasyonu gösterirken, ancak genel olarak daha az hareket gösterir. Yeni bir ortamda hareket için test edildiğinde, BSS mutantları, CS sineklerine kıyasla yol uzunluğunda önemli bir azalma gösterdi. Test ayrıca, lokomotor test sırasında CS sineği keşfedilirken hareket hızındaki değişiklikleri de tespit etti.

BSS sineği, birkaç aktivite patlaması dışında, deneme boyunca nispeten hareketsiz kaldı. Bu teknikle bu davranışsal tahlillerden herhangi birini gerçekleştirirken akılda tutulması gereken en önemli şeylerden biri, kayıtları yapmadan önce sinekleri uyuşturmadığınızdan emin olmaktır. Anestezinin hem nöbet davranışını hem de lokomotif davranışını etkileyeceği ve sonuçlarınızı önemli ölçüde değiştirebileceği ortaya çıktı.