Odaklanmış iyon demeti Of Cryo-elektron Mikroskopi Numune Hazırlama By Means

Bu prosedürün genel amacı, kriyojenik olarak donmuş bir yığın numuneden odaklanmış bir iyon demeti lamelini çıkararak kriyo TEM için bir numune hazırlamaktır. Bu, ilk daldırma, numunenin sıvı nitrojen içinde dondurulması ve kriyo odaklı iyon ışını SEM'in içine monte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, iyon ışını ile ince bir LA Melo'yu kesmek ve soğutulmuş bir nano manipülatör vasıtasıyla bir TEM ızgarasına aktarmaktır.

Daha sonra, TEM ızgarası bir aktarma istasyonunda SEM tutucusundan TEM tutucusuna aktarılır. Son adım, daha fazla analiz için TEM tutucusunun kriyo TEM'e aktarılmasıdır. Sonuç olarak, kriyo TEM, çıkarılan lamelin yüksek çözünürlüklü görüntülerini, tomo Grahams'ı veya x-ışını haritalarını göstermek için kullanılır.

Bu teknik, ışık mikroskobu veya taramalı elektro mikroskopi gibi diğer mikroskopiler tarafından analiz yerini önceden seçerek transmisyon elektron mikroskobunda yumuşak maddeyi en üst düzeyde çözünürlükle analiz etmemizi sağlayacaktır. Bu tekniğin Mac kriyo Mikrotomi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, numunenin sıkıştırılması ve def oluşumu gibi hazırlık artefaktlarından kaçınılmasıdır. İlk olarak, odaklanmış iyon demeti numuneleri için iki TEM ızgarasını monte edin.

SEM transfer tutucusunda, ilgili vidaları bir tornavidayla sıkarak ızgaraları sabitleyin ve panjurları kapatın, numuneye uygun bir numune saplaması takın ve numunenin bir kısmını ekleyin. Örneğin, damlacıkları düz bir saplama üzerine bırakmak için bir pipet kullanın. Ardından SEM transfer tutucusunu vakum transfer cihazına veya VTD'ye monte edin.

Slushing istasyonuna sıvı nitrojen ekledikten ve aşağı pompaladıktan sonra, istasyonu açın ve kaynama tamamlanana ve rüşvet tekrar elde edilene kadar SEM transfer tutucu pompasını tekrar dondurun. Ardından, SEM transfer tutucusunu VTD'nin vakum odasına geri çekin ve kapatın. Boşaltma istasyonunu ve kriyo hazırlama odasını havalandırın Hava kilidi Dış hava kilidini havalandırın.

Ardından VTD contasını kriyo hazırlama odasının ve pompanın hava kilidiyle eşleştirin. İyi bir vakum seviyesine ulaşıldığında, VTD'nin contasını ve dış hava kilidini açmak için hava kilidi pimini ölçün. Ardından SEM transfer tutucusunu takın.

Bunu takiben, TEM ızgara yuvalarının koruyucu kapaklarını açmak için soğuk bir bıçak kullanın. Odaklanmış iyon ışını SEM üzerindeki yüksek gerilimi kapatın ve iç hava kilidini açın. Ardından, SEM tutucuyu numune odasına aktarmak için VTD'yi kullanın.

SEM tutucusu soğuk aşamaya geçtiğinde, iterek ve döndürerek VTD'yi devre dışı bırakın. VTD çubuğunu VTD vakum odasına tamamen geri çekin ve iç hava kilidini, dış hava kilidini ve VTD contasını kapatın. Bu noktada, öncü gazı 24 ila 26 santigrat dereceye ısıtın ve gaz enjeksiyon sistemini veya GIS iğnesini numune yüzeyinin yaklaşık bir milimetre üzerinde bir yüksekliğe yerleştirin.

Elektron ışını ile görüntüleme yaparken, gaz vanasını birkaç saniye açın. Ardından, düşük büyütmede 1000 pico ampire iyon ışını kullanarak ilgilenilen bölge üzerindeki tortuyu veya ROI'yi iyileştirin. Sertleştikten sonra, yüzey iyon ışınına dik olacak şekilde numuneyi 52 dereceye kadar eğin.

Öğütün. İki terörist siperi. ROI'nin her iki tarafında numuneyi sıfır dereceye kadar eğin ve lamelin yanlarını ve alt tarafını kesmek için iyon ışınını kullanın, böylece kesim işaretlerinin tüm lamelden geçtiğinden emin olun.

GIS iğnesi yerleştirildikten sonra, nano manipülatörü, ucu tercihen yan taraftaki lamel ile fiziksel temas edene kadar manevra yapın. GIS valfini birkaç saniye açın ve elektron ışını ile sürekli görüntüleme ile kriyo birikimini izleyin. Ek bir ila iki mikrometre platin tabakası kriyo biriktirildiğinde, platini yalnızca nano manipülatörün lamel ile temas halinde olduğu noktanın etrafındaki birkaç mikrometrede sertleştirdikten sonra valfi kapatın.

Ardından lamelleri serbest bırakmak için yüksek iyon ışını akımı kullanın. Lamelleri hendeklerden çıkarmak için nano manipülatörü dikkatlice hareket ettirin ve numune yüzeyinin en az 500 mikrometre üzerine hareket ettirin. İğneyi geri çektikten sonra, numune aşamasını birkaç milimetre indirin ve TEM ızgaralarından biri görünene kadar hareket ettirin.

Izgara üzerindeki bağlantı alanını çalışma konumuna getirin ve GIS iğnesini yerleştirin. Daha sonra, bağlı lamelleri TEM ızgarasındaki bağlantı alanıyla fiziksel temasa getirmek için nano manipülatörü dikkatlice manevra yapın, gaz vanasını birkaç saniye açın ve kriyo ile bir ila iki mikrometre platin tabakası daha biriktirin, platini sadece lamel ile TEM ızgarası arasındaki temas noktasının etrafındaki birkaç mikrometrede kürleyin. Ardından, lamelleri nano manipülatörden kurtarmak için yüksek bir iyon ışını akımı kullanın.

Numuneyi 52 dereceye kadar eğin ve elektron şeffaflığına kadar inceltmek için iyon ışınını kullanın. Kriyo transfer istasyonunu kuru nitrojen gazı ile yıkadıktan sonra, kriyo transfer TEM tutucusunu kriyo transfer istasyonunun uygun yuvasına yerleştirin ve sıvı nitrojen ile doldurun. Bunu takiben, uçlarını istenen sıcaklığa soğutmak için bir tornavidayı, TEM numune sıkıştırma aletini ve cımbızı sıvı nitrojenle doldurulmuş kriyojenik bir kaba daldırın.

VTD dış hava kilidiyle eşleştirildiğinde, soğuk aşamayı 16 milimetrelik transfer yüksekliğine getirin. Yüksek gerilimi kapattıktan sonra VTD contasını, dış hava kilidini ve iç hava kilidini açın. Ardından, saat yönünde iterek ve döndürerek SEM transfer tutucusuna kilitlemek için VTD çubuğunu kullanın.

Bu noktada, SEM transfer tutucusunu kriyo hazırlama odasına geri çekin. TEM ızgaralarının koruyucu kapaklarını kapatmak için soğuk bıçağı kullanın. Ardından, numuneyi VTD'nin vakum odasına taşımak için VTD çubuğunu kullanın, hava kilidini kapatın ve kapatın.

Ardından dış hava kilidini boşaltın ve VTD'yi çıkarın. VTD'yi kriyo transfer istasyonunun SEM bağlantı noktasıyla eşleştirin. Kuru nitrojenle yıkama yaparken, VTD'nin contasını açmak için istasyon üzerindeki pimi kullanın ve SEM transfer tutucusunu kriyo transfer istasyonunun doerine kaydırın.

Soğutulmuş tornavidayı kullanarak kapaklardan birini açın ve TEM ızgarasını yerinde tutarak ilgili vidayı gevşetin. Ardından TEM ızgarasını alın ve soğutulmuş cımbızı kullanarak TEM tutucusuna yerleştirin. Bunu takiben, TEM ızgarasını TEM tutucusuna sabitleyin.

Soğutulmuş altıgen halkayı kullanarak, kriyo transfer TEM tutucusunun kapağını kapatın ve kriyo transfer istasyonunu pompalama sisteminden ayırın. TEM tutucusunun istasyonunu ve ısıtıcı kontrol cihazını TEM'in yakınına taşıyın ve yeniden bağlayın. TEM örnek aşamasını eksi 70 derecelik bir eğime ayarlayın.

Ardından, kuru nitrojen gazı ile yalnızca bir temizleme döngüsü ile hava kilidi için en kısa pompalama süresini ayarlayın. TEM tutucuyu kriyo transfer istasyonundan çıkarın ve pompalama döngüsünü başlatacak olan eğimli gonyometrenin ilk aşamasına yerleştirin. Döngü tamamlandıktan sonra, açıölçeri açıölçer ile dönmemesi için TEM tutucuyu tutarken sıfır dereceye kadar eğilecek şekilde ayarlayın.

Ardından tutucuyu açıölçerden TEM'in içine tamamen yerleştirin. Son olarak, kriyo transfer TEM tutucu doer'ı sıvı nitrojen ile doldurun. Bu yöntemde, aspergillus Niger sporları ilk olarak ekstraksiyon bölgesini tanımlamak için SEM ile görüntülenir.

Herhangi bir sporun bir kesiti yeterlidir, ancak belirli bir hücreyi hücre zarından belirli bir mesafede dilimlemek için ROI'yi mikrometre altı hassasiyetle ekstraksiyon için konumlandırmak mümkündür. İlgilenilen özellik belirlendikten sonra, kriyo biriktirmenin ilk adımı uygulanır İyon öğütme sırasında numuneyi ışın hasarından korumak için, numune 52 dereceye kadar eğilir ve ardından melanın her iki tarafında iki hendek püskürtülür. Numune daha sonra geriye doğru eğilir ve daha fazla frezelenir, böylece onu kütleye bağlayan sadece iki küçük köprü kalır.

Soğutulmuş nano manipülatör, mella ile temas ettirilir ve platinin başka bir kriyo birikimi bunları birbirine lehimler. Küçük bağlantı köprüleri frezelenir ve nano manipülatör, lameli TEM sınıfı bağlantı alanının yakınına hareket ettirir ve burada son bir platin kriyo birikimi ile lehimlenir. Nano manipülatör daha sonra elektron şeffaflığına kadar ince olan lamelden ayrılır.

İyon demeti ile lamel, yüksek çözünürlüklü görüntüleme spektroskopisi, tomografi ve diğer tekniklerin kullanılabileceği TEM'e aktarılır. Bu yöntem, nöro problar veya kemik implantları gibi sistemlerde kalp yumuşak madde arayüzlerinin anlaşılmasına katkıda bulunacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, üçüncü artefakt olan ve bir böcek örneğinin belirli bir bölgesinden mikrometre altı hassasiyetle çıkarılabilen cryo TM örneklerinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.