Hastalar ve İnsan endotel hücrelerinden türetildiği Prostat dolaşımdaki tümör hücrelerinin arasında E-selektin aracılı Etkileşimleri gözlemleyin vitro Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, bir mikro slayt akış düzeneği kullanarak nadir prostat kanseri hücreleri ile E-selektin eksprese eden endotel hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemektir. Bu işlem, öncelikle bir mikro slaydın fibronektin ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, insan göbek veni endotel hücrelerinin (HUVEC) dar kanal genişliğine sahip bir mikro slayt üzerindeki dinamik akış sisteminde kültüre edilmesidir.

Ardından, prostat kanseri hücreleri, internalize olan anti prostat spesifik membran antijeni veya PSMA humanize monoklonal antikor ile işaretlenir. Son adım, anti PSMA işaretli prostat kanseri hücrelerinin e-selektin eksprese eden ve üzerinden perfüze edilmesidir. Son olarak, prostat kanseri hücreleri ile endotel hücreleri arasındaki etkileşimleri göstermek için video mikroskopi kullanılır.

Bu tekniğin, paralel plaka akış odası ve diğer dinamik düzenekler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu teknik sayesinde dolaşan tümör hücreleri gibi nadir prostat kanseri hücreleri ile kültürlenmiş endotel hücreleri arasındaki etkileşimleri dinamik bir akış sisteminde inceleyebilmenizdir. Bu yöntem, prostat tümör hücrelerinin kan damar sistemi yoluyla nasıl metastaz yaptığı ve lökositlerin göçü sırasında kullandıkları mekanizmanın aynısını kullanıp kullanmadıkları gibi metastaz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Genel olarak, bu tekniğe yeni başlayan kişiler, doku kültürü kabini altında, perfüzyon altındaki dar bir kanal içerisinde endotel hücrelerinden oluşan bir monotabaka kültüre etmeyi gerektirdiği için zorluk yaşayabilirler. Öncelikle, mikro slaydı fosfat tamponlu salin veya PBS ile durulayın. Ardından, bir mililitrelik lure lock şırınga kullanarak mikro slaydı 200 µL 50 µg/mL fibronectin ile nazikçe kaplayın.

Mikro slaytı kapakla kapatın ve 30 dakika boyunca doku kültürü kabininde bekletin. Ardından, mikro slayt üzerine 200 µL ılık qve büyüme ortamı perfüze edin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Sıvının mikro slayta yavaşça dağıtılması, kanalda kabarcık oluşumunu önler.

Perfüzyon sırasında, veks'i PBS ile durulayarak ve oda sıcaklığında bir ila iki dakika boyunca PBS içinde %0,1 kollagenaz ile %0,05 EDTA ekleyerek veks süspansiyonunu hazırlayın. hve'yi iki mililitre büyüme ortamı içinde 180 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, bir hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonunu ölçün ve 100 µL büyüme ortamı başına 10 milyon hücre hazırlayın.

Ardından, besiyerini mikro slayt girişinden dikkatlice uzaklaştırın. 200 µL'lik bir pipet ucu kullanarak mikro slaytı göz hizasına getirin ve 1 mL'lik bir luer lock şırınga yardımıyla, hazırlanan konsantrasyondaki vex'ten 200 µL'yi kanala nazikçe perfüze edin. Baloncuk oluşumunu önlemek için bu adımda dikkatli olunmalıdır; eğer baloncuklar oluşursa, baloncuklar çıkış kanalına girene kadar perfüzyona biraz daha uzun süre devam edin.

Ardından, mikro slaytın hem giriş hem de çıkış kısmına yaklaşık 80 µL hacminde eşit miktarda VE medyumunu pipetleyin. Bu işlem, hücrelerin her iki yöne doğru akışını önler. Slaytın üzerini kapatın ve 1,5 saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatörde bekletin.

Akış odası montajına başlamak için, ölü hacmi en aza indirmek amacıyla steril 20 mililitre şırınga, dişi ve erkek luer konnektörler, bir şırınga pompası ve boruları 15 dakika boyunca inkübatörde bekletin. İç çapı 0,04 inç olan borular kullanın. Daha küçük boru çapı kabarcık oluşumunu önler.

Ardından, 20 mililitrelik şırıngayı 12 mililitre ılık VE besiyeri ile doldurun. Şırıngadaki hava kabarcığını tamamen giderin. Mikro slaydın girişini VE besiyeri ile doldurun.

Bu düzeneği mikro slayta bağlayın. Çıkış konnektörünü mikro slayta nazikçe takın. Sistemi inkübatöre yerleştirin ve şırınga pompasına bağlayın.

Ardından, hücreleri 37 °C'deki inkübatörde gece boyunca bırakmadan önce pompayı dakikada 10 µL kayma hızına ayarlayın. Ertesi gün, mikro slaytın girişine bağlı olan konnektörü çıkararak düzeneği sökün. Daha sonra, endotel hücrelerde E-selektin ekspresyonunu artırmak için çıkış konnektörünü çıkarın.

İnterlökin 1 beta içeren taze büyüme besiyeri hazırlayın. Besiyerini 10 mililitrelik bir şırıngaya çekin. Lamın girişindeki kalıntı besiyerini uzaklaştırın, ardından girişi tamamen dolduracak şekilde taze besiyeri ekleyin.

Şırıngayı lamla bağlayın. Vex'in interleukin one beta inkübasyonu sırasında, şırınga pompasını inkübatörde dört saat boyunca dakikada 10 µL makaslama hızına ayarlayın ve anti PSMA Alexa 4 88 antikorla işaretlenmiş prostat kanseri hücrelerini hazırlayın. İlk olarak, MDA prostat kanseri hücrelerine %0,05 trypsin EDTA'yı bir dakika boyunca ekleyin.

Hücre yüzeyinde bulunan glikopeptitleri etkileyebileceği için hücreleri uzun süre tripsine maruz bırakmayın. Hücreleri 200 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, MDA hücre peletini bir mililitre Hank's Tamponu içinde yeniden süspande edin ve anti-PSMA antikoru ekleyip oda sıcaklığında, karanlık bir yerde 30 dakika inkübe edin; inkübasyon sırasında hücreleri yeniden süspande etmeye devam edin.

30 dakika sonra, hücre çözeltisini 800 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Üst fazı aspire edin ve peleti bir mililitre Hank's tamponunda yeniden süspanse edin. İşaretlenmiş MDA hücrelerini sayın ve final konsantrasyonu mililitre başına 1 milyon hücreye getirin.

Beş mililitrelik bir şırıngayı etiketli MDA hücreleri ile doldurun ve hava kabarcıklarını giderin. Ters mikroskobu açın ve 10x objektifte curling aydınlatmasını ayarlayın. Şırınga pompasını mikroskobun numune tablasıyla aynı seviyeye getirin ve santimetrekare başına bir dime kayma gerilimine ayarlayın.

Ardından, Zeiss Axio vision yazılımını açın. Bilgisayar ekranı üzerinden objektifi seçin. Yazılımdaki araçlar (tools) seçeneği altında yeni bir klasör oluşturun.

Axio vision'daki akıllı deneyler seçeneğini açın ve 30 dakika boyunca kısa 32 saniyelik videolar kaydetmek için ayarları düzenleyin. Canlı floresan video için görüntü seçeneklerini belirleyin. Bu parametreler, Zeiss MRM kamera ile video kare hızına yakın videolar elde edilmesine yardımcı olur; akış kanalının tam genişliğini 10x objektif ile bilgisayar ekranında görselleştirmek için bir CM montaj adaptörü kullanın. Şırıngayı ve hücreleri içeren konnektörü şırınga pompasına yerleştirmeden önce cıva lambasını açın. Ardından, konnektörü interleukin one beta stimüle edilmiş ax içeren mikro slaytın doldurulmuş giriş kanalına bağlayın.

Çıkış kanalını, hortuma takılı olan konnektörle bağlayın. Akışı toplamak için hortumu bir kaba veya 15 milliliter konik tüpe yerleştirin. Mikro slayt üzerinden dakikada 10 microliters hızla infüzyonu başlatın.

Endotel hücreler ile işaretli MDA hücreleri veya hastalardan elde edilen işaretli CTC'ler arasındaki etkileşimleri 488 nanometre altında gözlemleyin. Epi floresan mikroskobunda filtreleme yapın. Deneyi 32 saniyelik kısa videolar halinde kaydetmeye başlayın.

Oynatma analizi sırasında, yuvarlanma hızını ölçün. Yuvarlanma hızı, hücrelerin katettiği mesafenin zamana bölünmesiyle ölçülür. Burada, endotel hücrelerinden oluşan bir tek tabakanın gece boyu süren kültürü gösterilmektedir.

Mikro lam üzerinde. Ölçeklendirmeler, beş x objektif kullanıldığında mikro lamın %100'ünün, 10 x objektif kullanıldığında ise %70'inin görünür olduğunu göstermektedir; seçilen aracılı etkileşimler için kenarlarda yuvarlanan hücreler dikkate alınmamıştır, bu da mikro lamın %70'inden fazlasını video kaydı ve oynatma analizi için uygun hale getirmektedir. Kutu grafiği, farklı kayma gerilmesi koşulları altında, interlökin bir beta stimüle edilmiş endotel hücreleri üzerindeki hem işaretlenmemiş hem de anti PSMA işaretli MDA hücrelerinin yuvarlanma hızlarının dağılımını göstermektedir.

10 dyn/cm²'lik daha yüksek kayma geriliminde, 1 ve 5 dyn/cm²'deki yuvarlanma hızları arasında anlamlı bir fark gözlemlenmemiştir. İşaretlenmemiş ve anti-PSMA ile işaretlenmiş MDA hücrelerinin yuvarlanma hızları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlemlenmiştir. Bir prostat kanseri hastasından alınan kan kullanılarak çekilen zamanla birleştirilmiş bir video, işaretli prostat CTC'leri ile lektin eksprese eden endotel hücreleri arasında üç tip etkileşim göstermektedir: CTC'lerin yapıştığı ve tekrar yapıştığı tutunma (tethering), CTC'lerin 30 saniye sonra bile ayrılmadığı stabil adezyon ve etkileşime girmeyen CTC'lerin görüş alanına girdiği etkileşimsiz durumlar. Mikro slaytlar kolayca immünoboyanabilir ve anti-PSMA ile işaretlenmiş MDA hücrelerinin sıkı adezyonu floresan görüntüleme ile izlenebilir.

İnterlökin 1 beta ile stimüle edilmiş endotel hücreleri üzerindeki profüzyon sonrası görünüm burada görülebilir. Bu videoyu izledikten sonra, bu prosedürü takip ederek sirküle prostat tümör hücreleri gibi nadir hücreler ile S-selektin eksprese eden endotel hücreler arasındaki etkileşimlerin nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. S-selektin ligandlarının varlığı gibi ek soruları yanıtlamak için immunofloresan gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.

Bu tür teknikler, araştırmacıların metastazda yer alan farklı basamakları anlamalarına yardımcı olabilir.