Name: Bir Modifiye In vitro Invasion Deneyi Hormonlar, Açan Kanser Hücre Invasion Sitokinlerin ve / veya Büyüme Faktörleri Potansiyel Rolü belirlemek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Keşfedin modifiye in vitro invazyon deneyi ile hormonların, sitokinlerin ve büyüme faktörlerinin kanser hücrelerinin istilasındaki rolünü. Bu yöntem, farklı hücre mutantlarının invazyon indekslerini karşılaştırarak metastaz mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, D'Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY'den sağlanan finansman kaynaklarını kabul ediyor.

1. Farklı Medya ve Ek Bileşenleri hazırlayın <ol><li> Deneyden önce, test edilecek da normal FBS ilave karakalem sıyrılmış FBS ya da kömür şeritli FBS artı madde ile DMEM veya diğer belirtilen ortam maddelerini kapsayan ortamı hazırlar. Birden fazla bileşen, her deneyde test edilebilir unutmayın. </li><li> Tartın ve uygun fizyolojik konsantrasyon tarafından kömür şeritli serum içinde çözünmüş hormonlar, büyüme faktörleri ya da sitokinler seyreltin. </li></ol> 2. on Ice Kollajen Matrix hazırlayın <ol><li> 200 ul 10x PBS (pH 7.4), 5.4 ul 1 N NaOH, iki kez damıtılmış H2O 600 ul ve 1.2 ml kolajen I: buzda sonra steril filtre edilmiş bileşenler eklenerek 2.2 mg / ml&#39;lik bir matris 2 mi kolajen hazırlanması (de 3.63 mg / ml). </li><li> Plaka için hazır olana kadar buz üzerinde kolajen I çözeltisi tutun. </li></ol> 3. &lt;Testi için Göç / Invasion Tabaklar hazırlayın/ P&gt; <ol><li> Her bir hücre çizgisi test edilebilmesi için, 12-kuyu ekler ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka bölmesi kullanırlar. Kemoatraktan medya ekleyerek ve deney düzeneği up için ekler aktarmak için ekler içermeyen ek 12 kuyu kullanın. NOT: hücre hatları burada kullanmak için bir polietilen tereftalat (PET) membran ve 8 mikron gözenek büyüklüğüne sahip plakalar üzerinde bir kollajen matriks uygunudur. Bununla birlikte, önceden kaplanmış plakalar içinde bir Matrigel matris, hücre çizgisi araştırılmaktadır göre azalmış gözenek boyutu ile ikame edilebilir. </li><li> Açıkça (bir kontrol, invaziv olmayan hücre hattı için FBS göç, CS-FBS göç, FBS işgali, ve CS-FBS işgali yanı sıra FBS-göç) analiz edilen duruma başına 3 kuyu kullanılarak, plaka etiket. Bir kolajen ya da Matrigel matris boyunca ve daha sonra zar içindeki gözeneklerin içinden hareket etmek sureti ile PET zar içindeki gözeneklerin içinden hareketi ve deney invazyonu ile deney göç. Bir her hücre durum için farklı renk işaretçileri kullanınKaplama işleminde kimliği. </li></ol> 4. Invasion Matrix dağıtın <ol><li> Dikkatle uçlar haline kollajen matris solüsyon içerisinde 75 ul istila deneyleri için kullanılacak pipetle. Kabarcıkları önlemek için dikkatli kullanın. Yüzeye ters pipet uygulayarak kabarcıklar Dağılın. </li><li> Katılaşmaya jel sağlamak için 30 dakika boyunca 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatöründe kolajen kaplı insertler ile plaka aktarın. </li></ol> 5. Plaka Membran veya Invasion Matrix üzerine Hücreler <ol><li> Bu arada, Hücreleri tripsinize edin ve% 10 FBS ile ortamı eklenir. Sıkma hücreleri masa üstü bir santrifüj ile 5 dakika süreyle 200 x g&#39;de ve serumsuz ortamında 3 kez yıkayın. </li><li> Serum serbest medya süspanse. Bir hemasitometre veya otomatik slayt sayacı ile hücreleri saymak. 5 x 10 4 hücre / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar serumsuz ortam ekleyin. </li><li> Kolajen matrisi (30 dakika sonra) katılaşmış girdiğinde, ortam 700 ul ya da2% tanımlanan FBS veya her kuyuya FBS kömür-elimden. Plaka başına 12 ekler: <ul><li> 3 ekler medya ile kolajen ve kuyuları var +% 2 FBS </li><li> 3 ekler medya ile kolajen ve kuyuları var +% 2 CS-FBS </li><li> 3 ekler medya +% 2 FBS ile hiçbir kolajen ve kuyuları var </li><li> 3 ekler medya ile hiçbir kolajen ve kuyuları var +% 2 CS-FBS </li></ul><ol><li> Test edilen faktörlerin sayısı ve her bir durumda karşılık gelen herhangi bir kollajen kontrol olarak, ek plakalar kullanın. </li></ol></li><li> Tüm geçiş ve istila insertlerin de uç başına 500 ul hücre vererek, 5 x 10 4 hücre / ml&#39;de ekler hücre süspansiyonu ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de 22 saat boyunca kuluçkaya bırakılır. </li></ol> 6. Geçirme ve istila Hücrelerinin sayısı niceliğini <ol><li> Ayrı kuyularda metanol fiksatif, eozin ve hemotoksilin kullanarak kuyuların ayarlayın boyama. </li><li> Her kuyudan hücreleri ve matriks çıkarmak için pamuklu bezlerden kullanın.Her kuyu için ikinci sürüntü uygulaması ile Rrepeat. </li><li> Forseps ile, arka arkaya 3 çözeltilerin her birine, her bir ek 1 saniye için 5 kez batırın. </li><li> Ekler / N O kurumasını bekleyin. </li><li> Ya i) kenarlarda dikkatle kesim, bir neşter ile filtreleri kaldırabilirsiniz ve lamel ve daldırma yağ ile bir slayt monte, veya ii) ekler O / N ters kurumasını ve mikroskopi için doğrudan ekler kullanmak için izin. </li><li> Ertesi gün, bir 20X amacı ile bir mikroskop altında slaytlar veya ekler görüntüleyebilir ve filtrenin farklı bölgelerinden 5 görüntüleri çekmek. Tutarlılığı artırmak için, 4 dış alanları ve bir merkez almak. </li><li> ImageJ yazılımı kullanarak tüm koşullar için hücreleri saymak ve aşağıdaki formüller için geçerlidir. </li><li> Aşağıdaki gibi yüzde işgali belirleyin: Ben = a eklemek kollajen sayesinde işgalci hücrelerin # ortalama Kontrol eki aracılığıyla göç hücrelerin # = b Ortalama % Işgali = (a / b) x 100 </li><li> Aşağıdaki gibi% 2 FBS Invasion Endeksi belirleyin: Hücrelerin istilası% (% 2 FBS içinde) analiz edilir = C (% 2% FBS) kontrol girişimsel olmayan hücrelerin işgali = d Invasion İndeksi (FBS) = (c / d) </li><li> Aşağıdaki gibi% 2 CS-FBS Invasion Endeksi belirleyin: Hücrelerin istilası% = e (% 2 CS-FBS) analiz edilir % (% 2 CS-FBS) kontrol girişimsel olmayan hücrelerin işgali = f Invasion Endeksi (CS-FBS) = (e / f) </li></ol> 7. tekrarlayın Deneysel Protokolü + X n Çoklu Faktörler Kombine ile Kömür-elimden FBS ile FBS Kömür-elimden Karşılaştırılması <ol><li> &quot;X&quot; ya da bileşenlerin bir kombinasyonu, farklı bileşenler kullanılarak gerektiği kadar prosedür birden fazla kez tekrarlayın. </li><li> Göç ve istila etkileri her faktör &quot;X&quot; katkısını belirlemek için hesaplamalar uygulayın. </li></ol>

<ol><li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeinberg%2C+RA+%22The+Biology+of+Cancer%22">The Biology of Cancer</a>. , 2nd Edition, Garland Science. (2013).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li>
<li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+molecular+insights+and+evolving+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li>
<li>Dang, Z. C., Lowik, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+serum+factors+by+charcoal+treatment+promotes+adipogenesis+via+a+MAPK-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Removal of serum factors by charcoal treatment promotes adipogenesis via a MAPK-dependent pathway.</a> Mol Cell Biochem. 268 (1-2), 159-167 (2005).</li>
<li>Yohay, D. A., Zhang, J., Thrailkill, K. M., Arthur, J. M., Quarles, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+serum+in+the+developmental+expression+of+alkaline+phosphatase+in+MC3T3-E1+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of serum in the developmental expression of alkaline phosphatase in MC3T3-E1 osteoblasts.</a> J Cell Physiol. 158 (3), 467-475 (1994).</li>
<li>Zucker, S. N., Bancroft, T. A., Place, D. E., Des Soye,, Bagati, B., Berezney, A., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dominant+negative+Cx43+mutant+differentially+affects+tumorigenic+and+invasive+properties+in+human+metastatic+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A dominant negative Cx43 mutant differentially affects tumorigenic and invasive properties in human metastatic melanoma cells.</a> J Cell Physiol. 228 (4), 853-859 (2013).</li>
<li>Fox, E. M., Andrade, J., Shupnik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+actions+of+estrogen+to+promote+proliferation%3A+integration+of+cytoplasmic+and+nuclear+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Novel actions of estrogen to promote proliferation: integration of cytoplasmic and nuclear pathways.</a> Steroids. 74 (7), 622-627 (2009).</li>
<li>Meierjohann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP13+mediates+cell+cycle+progression+in+melanocytes+and+melanoma+cells%3A+in+vitro+studies+of+migration+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">MMP13 mediates cell cycle progression in melanocytes and melanoma cells: in vitro studies of migration and proliferation.</a> Molecular Cancer. 9, 201(2010).</li>
<li>Smalley, K. S., Haass, N. K., Brafford, P. A., Lioni, M., Flaherty, K. T., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+signaling+pathways+must+be+targeted+to+overcome+drug+resistance+in+cell+lines+derived+from+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases.</a> Mol Cancer Ther. 5 (5), 1136-1144 (2006).</li>
<li>Both, N. J., Vermey, M., Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+evaluation+of+various+invasion+assays+testing+colon+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A comparative evaluation of various invasion assays testing colon carcinoma cell lines.</a> Br J Cancer. 81 (6), 934-941 (1999).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+cancer+metastasis%3A+the+%27seed+and+soil%27+hypothesis+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 453-458 (2003).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+to+mesenchymal+transition+in+human+breast+epithelial+cells+transformed+by+17beta-estradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial to mesenchymal transition in human breast epithelial cells transformed by 17beta-estradiol.</a> Cancer Res. 67 (23), 11147-11157 (2007).</li>
<li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+hormone+regulation+of+miR-21+enhances+migration+and+invasion+of+hepatoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Thyroid hormone regulation of miR-21 enhances migration and invasion of hepatoma.</a> Cancer Res. 73 (8), 2505-2517 (2013).</li>
<li>Scheel, C., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+epithelial-mesenchymal+transition%3A+concepts+and+molecular+links%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition: concepts and molecular links.</a> Semin. Cancer Biol. 22 (5-6), 396-403 (2012).</li>
<li>Kojima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+TGF-beta+and+stromal+cell-derived+factor-1+%28SDF-1%29+signaling+drives+the+evolution+of+tumor-promoting+mammary+stromal+myofibroblasts.Proc%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.Proc.</a> Natl Acad Sci U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).</li>
<li>Maehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transforming+growth+factor-%CE%B21+in+invasion+and+metastasis+in+gastric+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncology%22%5BJournal%5D)">Role of transforming growth factor-β1 in invasion and metastasis in gastric carcinoma.</a> J. Clin. Oncology. 17 (2), 607-614 (1999).</li>
<li>Lu, Z., Jiang, G., Blume-Jensen, P., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor-induced+tumor+cell+invasion+and+metastasis+initiated+by+dephosphorylation+and+downregulation+of+focal+adhesion+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor-induced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase.</a> Mol. Cell Biol. 21 (12), 4016-4031 (2001).</li>
<li>Korkaya, H., Liu, S., Wicha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+stem+cells%2C+cytokine+networks%2C+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment.</a> J. Clin. Invest. 121 (10), 3804-3809 (2011).</li>
<li>Rosen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interrogation+of+HGF-SF+with+other+cytokines+in+tumor+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22EXS%22%5BJournal%5D)">The interrogation of HGF-SF with other cytokines in tumor invasion and metastasis.</a> EXS. 65, 301-310 (1993).</li>
<li>Sanz-Moreno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+and+JAK1+signaling+cooperate+to+control+actomyosin+contractility+in+tumor+cells+and+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ROCK and JAK1 signaling cooperate to control actomyosin contractility in tumor cells and stroma.</a> Cancer Cell. 20 (2), 229-245 (2011).</li>
<li>Fleming, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+interactions+between+primary+human+human+fibroblasts+enhance+murine+mammary+gland+humanization+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Paracrine interactions between primary human human fibroblasts enhance murine mammary gland humanization in vivo.</a> Breast Cancer Res. 14 (3), (2012).</li>
<li>Sikora, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M.J.%2C+V.%2C+M.E.%2C+M.D.%2C+J.M%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+estrogen-independent+breast+cancer+growth+driven+by+low+estrogen+concentrations+are+unique+versus+complete+estrogen+deprivation.Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">M.J., V., M.E., M.D., J.M.</a> Mechanisms of estrogen-independent breast cancer growth driven by low estrogen concentrations are unique versus complete estrogen deprivation.Breast Cancer Res Treat. 134 (3), 1027-1039 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Tümör metastaz çok aşamalı bir süreçtir. Hücreler, bazal membran kırmaya da uzak bölgelere taşınabilen lenf sistemi veya kan ya da kılcal damarlarla içine intravasate gerekir. Tümör hücreleri daha sonra damar dışına ve Makrometastaz 12 içine yerleşmektedir. Mezenkimal geçiş (EMT), tümör invazyonu ve metastaz için epitel yoluyla ilerleme steroid hormonların 13,14 tarafından geliştirilmiştir, büyüme 15-18, ve sitokinler 19-21 faktörleri. Bu moleküller, bir testin geliştirilmesi ...

Bir yeni işgal tahlil belirli hormonlar, kanser hücresi yayılımını tamamen içinde kimyasal çekici olarak sitokin ve / veya büyüme faktörlerinin katılımı belirlenmesi amacı ile geliştirilmiştir. hücre dışı matriks (ECM) ile işgal etmeye tümör hücrelerinin yeteneği metastatik fenotip 1-3 bir özelliğidir. İstila odaları yaygın olarak kanser hücresi istilasını ve göç çalışma, in vitro araç olarak kullanılmıştır ve in vivo tümör istilası ve metastaz mekanizmaları da bilgiyi sağlayabilir. odalar, hücre kültür plakalarının gözeneklerine içinde iç içe geçmiş silindir hücre kültürü ekler oluşur. insertlerin taban, tanımlanmış gözenek büyüklüğü ve yarı geçirgen polikarbonat veya polistirol membranlardır. Standart istila deneyinde, hücreler, serumsuz ortam ile uç zar üzerine ekilir ve serum veya serum gibi kemoatraktantlarla dolu olan hücre kültür çukurlarına yerleştirildi set kadar kemoatraktif kuvvet. Bu kuvvet, tahrik Hücreler daha sonra tespit etmek ve hücrelerin sayısını belirlemek için geleneksel boyaları kullanılarak boyanmış hücre dışı matris (yayılma) &#39;in bir kaplama boyunca, alternatif olarak, yarı geçirgen bir zar (göç) hareket ettirin. hücre sayısı daha sonra invaziv olmayan hücre hattında göç ve istila derecesine göre normalize edilir. Bu yöntem araştırmacının, genetik manipülasyon da dahil olmak üzere koşullar altında çeşitli farklı hücre tiplerinin invaziv potansiyelini değerlendirmek için izin verir. Hormonlar, sitokinler ve büyüme faktörleri serum kritik bileşenleridir ve giderek invaziv fenotip 4 sürüş ile ilişkili olduğu gösterilmiştir edilmektedir. Ancak, yine de işgali aracılık bu kemoatraktif serum moleküllerinin yapısı, rolü ve özgüllük zor kalır. meydan sürüş sorumlu serum veya serum benzeri chemoattractants belirli hangi faktörlerin belirlenmesi kalırmoleküller işgali sürecini inhibe ne olabilir kanser hücresi işgali yanı sıra. Bu yazıda, kanser hücrelerinin chemoattraction ve işgali sürüş molekülleri olarak, hormonlar, sitokinler ve / veya serum içinde mevcut olan büyüme faktörleri potansiyel katılımı değerlendirmek için bir yöntem tarif eder. Önerilen bu tadil edilmiş protokolde, odun kömürü sıyırma% 2 karakalem sıyrılmış FBS (CS-FBS) oluşturmak üzere,% 2 fetal sığır serumu (FBS) ile ilgili hormonlar, sitokinler ve büyüme faktörleri çıkarmak için kullanılır. % 2 FBS ve% 2 CS-FBS iki kanser hücre istilasını sürücü kemoatraktif kuvveti ayarlamak için maddeler olarak kullanılmaktadır. Normal% 2 FBS ile karşılaştırıldığında, kemoatraktif madde olarak% 2 CS-FBS kullanarak ilk dahil olmak üzere çeşitli yararlar elde edilir, ve en belirgin olarak, hormonlar, sitokinler ve büyüme faktörleri, indirgenmiş / bağıl yokluğunda kanser istilası fenotipi çalışma yeteneği. Ayrıca hormonlar, büyüme faktörleri kolektif çıkarılması olup olmadığını değerlendirmek için araştırmacı sağlar ve cytokines invaziv endeksteki artış veya azalmaya neden olur. Daha sonra deney, (Şekil 2 ve 3 e bakınız), &quot;X&quot; olarak adlandırılan tek bir bileşen eklenmesi azalma artışı önleyen, ya da orijinal değerine invaziv endeksi geri olup olmadığını belirlemek için tasarlanmıştır. Bu yöntem, kömür sıyırma boyunca serum uzaklaştırılır bileşen fizyolojik seviyelerini elde etmek için spesifik olan, ancak, aynı zamanda kömür sıyırma aynı zamanda sinyal iletim yollarını etkileyen unutulmamalıdır. Örneğin, odun kömürü sıyırma osteoprogenitör hücrelerinin alkalin fosfataz aktivitesi azalır ve MAPK nin aktivatörlerinin 5 azaltılması yoluyla adipogenesis uyarabilir bildirilmiştir. Karakalem sıyrılmış ortam ticari olarak temin edilebilir ve protokolüne göre bu dekstran ile kömür birleştirir ve fetus inek serumu, O / N 6 ile inkübe özetlenmiştir. Bu deney, RESPO geliştirilenNSE Zucker ve ark. 7 tarafından bildirilen bir sonuç yazarlar, normal% 2 FBS ile medya doğru göç sırasında gap junction iletişimi etkileyen bir mutant fenotip işgali endeksindeki artış gösterdi olduğunu gösterdi. Bu artış, kömürle sıyrılmış serum ikamesi ile ortadan kaldırıldı. Bu sonuçtan, Yazarlar, bir lipofilik molekül yönelik bu mutan etkilenen taşıma (daha özel olarak ise, bir hormon, bir büyüme faktörü, sitokin ya da) 7. İyi hormonlar, büyüme faktörleri ve sitokinler tümör promosyonuyla ve istila 4 yer alan sinyal yolları aracılık ettiği bilinmektedir. Bu nedenle, bu bilim araştırmacılar ne faktör (ler) çalışma altında, özellikle kanser hücrelerinin veya mutantlar tümör invazyonu sürüş belirlemek için de önemlidir. bileşenin konsantrasyonu arasındaki farka bağlı olarak, belirlenen deney fizyolojik konsantrasyonda ayrı ayrı bileşenlerin rolünü ele almak üzere tasarlanmıştır ve# 8220, X &quot;, normal FBS ve CS-FBS içinde. Bu testin gelişme sayesinde, araştırmacılar kendi sistemini düzenleyen özel invaziv yolun içine daha fazla fikir sahibi olabilir. Hormonlar, büyüme faktörleri, sitokinler ve genellikle tümör destekleyicileri 8 olarak sınıflandırılmıştır. Örneğin EGF, bu faktörlerden bazıları istila odaları 9 kimyasal çekici doğrudan kaynakları olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, bu doğrudan tümör invazyonu bu serum ana bileşenleri temsil gibi görünmektedir. Bu protokol bir araştırmacı kanser hücrelerinin invaziv potansiyeli aracılık hormonlar, büyüme faktörleri ve sitokinler katılımını değerlendirmek için izin verir geleneksel in vitro işgali tahlil için basit, ama önemli, değişiklik önermektedir. Ancak, tahlil değerli zaman ve r kullanmak şekilde değil, prosedür analizinde erken aşamada yaptıkları çalışmada etkili olacaktır dair bir cevap ile araştırmacı sağlamak için tasarlanmıştıresources gereksiz görülmesi halinde. Bu yöntem CS-FBS kullanır ve potansiyel kanser hücresi işgali aracılık kurşun adayları olarak sürdürmeye molekülleri hangi şekilde araştırmacılar takdirine bağlıdır. Bu analizlerin sonuçları, serum bileşenleri, özellikle hücre hattı veya mutant için Kemoattraktantlar veya inhibitörleri çalışılan olarak hizmet hangi belirlenmesinde yararlı olduğu ispatlamak zorundadır. Ayrıca, bu yaklaşım araştırmacı teşvik veya kanser hücresi işgali inhibe ya anahtar sinyal yolları belirlemeye yardımcı olabilir; Böylece gelecekte ilaç tasarımı yönlendiren.

<table><tbody><tr><td>8.0 & micro özellikli BioCoat Kontrol Ek Parçaları; m PET membran</td><td>Corning</td><td>354578</td><td>iki adet 24 oyuklu plakanın her birinde 12. PET = polietilen teraftalat</td></tr><tr><td>Kollajen I, sıçan kuyruğu</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Kaynak = sıçan kuyruğu tendonu, saflık =% 90</td></tr> <tr><td>Fiksatif; Diff-Quick</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9844047</td><td>Metanol bazlı fiksatif, hematoksilen/eozin</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Life Technologies</td><td>16000</td><td>FBS olarak belirlenmiştir</td></tr><tr><td>Kömürle soyulmuş fetal sığır serumu</td><td>Life Technologies</td><td>12676</td><td>CS-FBS olarak belirlenmiştir</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30070</td><td>FBS</td></tr> <tr><td>olarak belirlenmiştirKömürden sıyrılmış fetal sığır serumu</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30068</td><td>CS-FBS olarak belirlenmiştir</td></tr></tbody></table>

bir modifiye<em&gt; in vitro</em&gt; invasion deneyi hormonlar, açan kanser hücre invasion sitokinlerin ve / veya büyüme faktörleri potansiyel rolü belirlemek için

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Kan serumu kanser hücrelerinin mikrodamarlara kendi intravasation kolaylaştırılması, göç ve istila hangi doğru kemoatraktan olarak hizmet vermektedir. Ancak, hücre göç hangi doğru gerçek moleküller zor kalır. Bu modifiye işgali tahlil hücre göçü ve işgali sürücü hedefleri belirlemek için geliştirilmiştir. Bu teknik, belirli bir hormon, büyüme faktörü, sitokin ya da bir kanser hücresinin invaziv potansiyel aracılık bir rol oynayıp oynamadığını belirlemek için üç koşullar altında istila endeksi karşılaştırır. Bu koşullar, i), normal fetal sığır serumu (FBS), ii) kömür-sıyrılmış hormonlar, büyüme faktörleri ve sitokinler ve iii) CS-FBS + molekülü kaldırır FBS (CS-FBS) (&quot;X&quot;) gösterilir içerir. FBS ile karşılaştırıldığında CS-FBS ile hücresi yayılmasında belirgin bir değişiklik, değişiklik aracılık hormonlar, sitokinler ya da büyüme faktörleri olduğu anlamına gelir. Bağımsız molekülleri daha sonra yeniden kabiliyetlerini test etmek için, CS-FBS geri eklenebilirayet ya da işgali fenotip kurtarmak. Ayrıca, iki ya da daha çok faktör katkı maddesi veya araç veya yayılmasının inhibe edilmesinde çok sayıda molekülün sinerjistik etkilerini değerlendirmek için kombine edilebilir. Genel olarak, bu yöntem, hormonlar, sitokinler ve / veya büyüme faktörlerinin kanser hücresinin özel bir tip ya da belirli bir mutant için kimyasal çekici ve istila inhibitörleri olarak görev yapan hücre istilasında rol oynayan olup olmadığını belirlemek için araştırmacı sağlar. Belirli chemoattractants ve inhibitörleri tanımlayarak, bu değiştirilmiş işgali tahlil kanser hücresi işgali yönlendiren sinyal yolları aydınlatmak için yardımcı olabilir.

işgal endeksi noninvaziv hücre hattına normalleşme göre her durum için hesaplanır. Deneyler için, biz 1205Lu melanom hücre çizgisi ve kurulan varyant kararlı hücre kuşaklarının z invaziv çizgiler olarak hem de 1205Lu hücreleri mantıksal kontrol olarak hizmet vermektedir 10 türetildikleri premalign invaziv olmayan değişik türde, WM793 kullanın. Bu dermis birincil bileşeni olduğundan biz de işgali matrisi olarak kollajen I kullanmaktadır. Optimal işgali matris hücre hattı dayalı ve in vivo ile uyumlu ö...

Bu video makalesinde, kanser hücresi istilasını yönlendirmede hormonların, sitokinlerin ve/veya büyüme faktörlerinin rolünü incelemek için modifiye edilmiş bir in vitro yöntem açıklanmaktadır.

Bir Modifiye<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion Deneyi Hormonlar, Açan Kanser Hücre Invasion Sitokinlerin ve / veya Büyüme Faktörleri Potansiyel Rolü belirlemek için

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kanser hücresi invazyonunu tetiklemede hormonların, sitokinlerin ve/veya büyüme faktörlerinin rolünü incelemek için bir in vitro analiz yöntemi oluşturmaktır. Bu, ikinci bir adım olarak farklı hücre varyantlarının veya mutantlarının invazyon indeksleri arasında bir fark olup olmadığının belirlenmesiyle gerçekleştirilir. İnvazyon analizi, serumdaki tüm hormonları, büyüme faktörlerini veya sitokinleri uzaklaştıran kömürle temizlenmiş besiyeri kullanılarak tekrarlanır.Ardından, belirli ve bilinen bir faktörün kömürle arındırılmış ortama eklenmesiyle invazyon deneyi tekrarlanır; böylece söz konusu faktöre doğru gerçekleşen göçün invazyonu artırıp artırmadığı veya inhibe edip etmediği belirlenir. Sonuçlar, invaziv olmayan hücre popülasyonlarının invazyon indeksine göre normalize edilerek, bilinen deneysel faktörlere doğru göç sırasında belirli hücre popülasyonlarının invazyon indeksinde meydana gelen değişimleri gösterir. Bu yöntemle ilgili fikri ilk kez, geleneksel bir invazyon deneyi gerçekleştirdiğimde, farklı hücre mutantlarının invazyon indeksleri arasında belirgin bir fark olduğunu fark ettiğimde edindim.Bu tekniğin geleneksel invazyon analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hücre invazyonunu teşvik eden veya inhibe eden hormonların, spesifik büyüme faktörlerinin ve sitokinlerin rolunun bu teknikle spesifik olarak araştırılabiliyor olmasıdır. Bu yöntem, hangi faktörlerin kanser metastazına yol açtığı dahil olmak üzere, kanser araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin doğurguları, gelecekteki ilaç tasarımı için terapötik bir yaklaşım sağlayabilir. Test edilecek her bir hücre hattı için, 12 insert içeren 24 kuyucuklu bir plaka kullanın.Ardından plakaları analiz edilecek koşullara göre etiketleyin. Daha sonra, hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek, invazyon analizi için kullanılacak her bir inserte taze hazırlanmış 75 µL kolajen matriks çözeltisi dikkatlice aktarın. Ardından, jelin katılaşmasını sağlamak için kolajen kaplı insertlerin bulunduğu plakaları 37 °C ve %5 CO2 ortamında 30 dakika boyunca inkübe edin.Deney hücreleri tripsin ile ayrıştırıldıktan sonra, enzimi inaktive etmek için %10 FBS ile desteklenmiş besiyeri ekleyin ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Ardından pellet serumsuz besiyeri içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın. Kollajen matrisi katılaştığında, mililitre başına 50,000 hücre olacak nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde serumsuz besiyeri ekleyin.30 dakika sonra, her birine ya %2 tanımlanmış FBS, %2 kömürle arındırılmış FBS veya %2 kömürle arındırılmış FBS artı ek bileşen içeren 700 µL ortam ekleyin. Her bir migrasyon veya invazyon insertinin üst kısmına, serumsuz ortamdaki 500 µL hücre süspansiyonu ekleyin; ardından deneyleri 37 °C'de 22 saat boyunca inkube edin.Ardından, oda plakasının boş kuyucuklarından üçüne metanol, fiksatif, eozin ve hematin ekleyin. Sonrasında, her bir insertin üst kısmındaki hücreleri ve matriksi iki ardışık pamuklu çubukla temizleyin. Ardından pens kullanarak.Her bir inserti, sırasıyla üç boyama çözeltisinin her birine beşer kez, her seferinde bir saniye boyunca daldırın ve insertlerin ters çevrilmiş halde gece boyunca kurumasına izin verin. Ertesi gün, boyanmış insertleri doğrudan görüntüleyerek üzerindeki hücrelerin görüntülerini elde etmek için 20x objektif kullanın.Her örnek için, membranın dış alanlarından dördü ve merkezinden biri olmak üzere toplam beş görüntü alınır. Son olarak, Image J yazılımı kullanılarak her görüntüdeki hücreler sayılır ve invazyon indeksi, invazif olmayan bir hücre hattına göre normalize edilerek hesaplanır. Bu model, bir invazyon testi sırasında karşılaşılabilecek potansiyel sonuçları ve ilgili verilerin nasıl yorumlanacağını göstermektedir.Her bir daire, test edilen üç durumdan birine ait boyanmış bir filtrenin temsili bir sonucunu göstermektedir ve her bir nokta, invazyon matrisinden geçerek membranın alt kısmında boyanmış bir hücreyi temsil etmektedir. Ardından, her durum için invazyon indeksi, invaziv olmayan bir hücre hattına göre normalleştirilerek hesaplanır. Örneğin, bu temsili deneyde, olası bir x faktörünü belirlemek için üç hormon test edilmiştir.Hormonlardan ikisinin invazyon indeksi üzerinde hiçbir etkisi olmadı, ancak birinin inhibitör özellikler sergilediği belirlendi. Uzmanlaşıldığında, tüm adımlar doğru şekilde uygulandığı takdirde bu teknik birinci gün yaklaşık dört saatte ve ikinci gün bir saatte tamamlanabilir. Bu teknik kullanılırken, her bir hücre insertinin dikkatlice ve doğru şekilde etiketlenmesi önemlidir.Her bir hücre insertini dikkatle etiketlemek için renk kodlu bir sistem ve farklı noktalar kullandık. Bunu takiben, in vitro sonuçları doğrulamak için in vivo yöntemler veya metastaz için fare modelleri kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hormonlar, büyüme faktörleri ve sitokinler gibi faktörlerin in vitro bir modelde hücre invazyonunu artıran veya inhibe eden etkilerinin fizyolojik uygunluğunun nasıl test edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Videomuza gösterdiğiniz ilgi için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

a-modified-vitro-invasion-assay-to-determine-potential-role-hormones

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kantitatif büyüme faktörü (TGF)-β indüklenen 3 boyutlu kolajen jel işgali dönüştürme ölçmek için bir test tarif edilir. Bu testte, meme kanseri gelişiminin farklı aşamaları temsil hücre hatlarının MCF10A serisi, yararlanır. Bu yöntem, diğer hücre hatları ile birlikte kullanılmak üzere ve diğer potansiyel aktivatörleri veya işgali inhibitörleri araştırmak için kullanılmış olabilir kabul edilebilir.

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

Üç boyutlu hücre dışı matriks içine tümör hücresi invazyonu modelleri daha iyi...

Modelleme ve Görüntüleme 3-Boyutlu Toplu Hücre Invasion

Bu videoda, tümör hücresi istilasını incelemek için doğal bir matris kullanma tekniği açıklanmaktadır. Bu tahlilde kullanılan teknik, epitelyal-mezenkimal hücre etkileşimlerini sentetik veya yabancı bir matrise ihtiyaç duymadan 3 boyutlu bir ortamda değerlendirme yeteneği sağlar.

Tümör Hücresi İnvazyon Testi: Epitelyal-mezenkimal Hücre Etkileşimlerini Değerlendirmek için 3D İn Vitro Native Matris Tabanlı Bir Yöntem

Yaygın olarak kullanılan, in vitro olarak hücre göçü ve işgali incelenmesi için oldukça erişilebilir yöntemler tarif edilmiştir. Birinci yöntem, hücre motilitesini büyüklüğüne hücre yara kapatma deneyidir. İkinci yöntem kemotaktik ve hücrelerin invaziv kapasitesini değerlendirir transwell göç ve istila testtir.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Periton mezotel zarının içine yumurtalık kanseri hücre işgali zamanla dinamik bir süreçtir. Gerçek zamanlı analiz kullanarak, bir küremsi-mezotel hücresi eş-kültür modelinde, yumurtalık kanseri hücrelerinin invaziv kapasitesi metastatik işlemini düzenleyen faktörleri bakış açıları sağlayan, uzun süreler boyunca ölçülebilir.

Real Time Mezotelyal Hücrelerinin Yumurtalık Kanseri Sferoid Ek ve Invasion Değerlendirilmesi

Çevredeki normal dokuların invazyonu, malign tümörlerin tanımlayıcı bir özelliğidir. Burada, bir dizi ileri insan kanseri modeliyle örneklenmiş doğal bir 3D biyomatrise basit, yarı otomatik bir mikro plaka istila testi sunuyoruz.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Burada, üç boyutta normal doku parçaları canlı olarak tümör hücrelerinin istilasını incelemek için bir protokol mevcut. Bu organ kültürü tekniği, özellikle in vitro koşullarında potansiyel anti-invasif ilaçlar test etmek için uygulanır.

Test Chick Kalp Invasion Testi Kanser hücrelerinin invazivliğini ve Potansiyel Anti-invaziv Bileşikler Etkinlik

Bu yöntem, kanser hücresinin sferoidlerden çevredeki bir 3B matrise invazyonunu değerlendirir.  Sferoidler, asılı damla kültürü yöntemi ile üretilir ve daha sonra bazal membran malzemeleri ve tip I kollajenden oluşan bir matrise gömülür.  Spheroidlerin istilası daha sonra izlenir.

Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için

Bu iletişim kuralı hücreleri hücre microenvironment koruma sırasında bir üç boyutlu ortamda göç ve işgal yeteneklerini ölçmek için kullanılabilir bir ters dikey işgali tahlil açıklar. Bu tahlil nadir ve/veya hassas hücreler için uygundur.

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

İn vitro hücre invazyonu assay, protein matrisini içeren hücre kültürü eklemlerini kullanarak invazyon ve göç için hücresel potansiyelin ölçülmesi ile kanser metastifinin potansiyelini ölçmek için kullanılır. Hücreler protein matrisinde ve gözenekli membrandan, bir kemoçekiciye doğru göç etmek ve sonra ışık mikroskobu ile ölçülebilir.

Onkojenik hücre davranışının bir ölçüsü olarak bir In vitro Invazif tahlil içinde Mouse mammary tümör hücrelerinin kullanımı

İstila, kanserin gelişiminde ve ilerlemesinde önemli bir biyolojik olgudur. Bu süreç, neoplastik olmayan hücreler ve tümör mikroçevresinin bileşenleri tarafından etkilenir. Bu çalışmanın amacı, üç boyutlu (3D) kültürler kullanarak in vitro olarak tümör hücresi istilasını analiz etmek için alternatif bir yöntemi tanımlamaktır.

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

Keşfedin modifiye in vitro invazyon deneyi ile hormonların, sitokinlerin ve büyüme faktörlerinin kanser hücrelerinin istilasındaki rolünü. Bu yöntem, farklı hücre mutantlarının invazyon indekslerini karşılaştırarak metastaz mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

Bir Modifiye In vitro Invasion Deneyi Hormonlar, Açan Kanser Hücre Invasion Sitokinlerin ve / veya Büyüme Faktörleri Potansiyel Rolü belirlemek için (Video) | JoVE Journal

Bir Modifiye

Daha fazla video keşfet