Bir Kısıtlama Enzim Temelli Klonlama Yöntemi değerlendirin In vitro HIV-1 Tipi C Gag-MJ4 Kimerik Virüslerin Çoğaltma Kapasitesi

Bu prosedürün genel amacı, CHIV bir enfekte olmuş birey alt tipinden türetilen tıkaç genlerini replikasyon yetkin bir HIV bir plazmide dahil etmektir. Gag dizisi polimorfizmlerinin HIV bir replikasyon kapasitesi üzerindeki etkisini in vitro olarak değerlendirmek için, bu ilk olarak hastanın plazmasından gag geninin amplifiye edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hastadan türetilen tıkaç sekansını replikasyon yetkin enfeksiyöz moleküler klon MJ four'a klonlamaktır.

Daha sonra, gag MJ dört kimera plazmidi, enfeksiyöz viral stoklar oluşturmak için transfekte edilir ve bir gösterge hücre hattındaki enfektivitesi değerlendirmek için titre edilir. Son adım, G XR 25 T hücresi hattında in vitro replikasyon kapasitesinin ölçülmesidir. Sonuç olarak, viral replikasyon kinetiğini görselleştirmek için zaman içinde virion üretimini ölçmek için radyo etiketli bir ters transkriptaz testi kullanılır.

Bugün açıklayacağımız yöntem, HIV alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bunlar, HIV replikatif uygunluğunun belirleyicilerini tanımlamayı ve HIV uygunluğunun uzun vadeli patogenezi nasıl etkilediğini anlamayı içerir. Bugünkü yöntemleri açıklamak, yüksek lisans öğrencilerimden ikisi olan Jessica Prince ve Dan Klaban olacak.

Bu prosedüre başlamak için, CDNA'yı RNA'dan ters transkribe edin ve tek adımlı bir RT PCR'de ters transkriptaz ve termo stabil bir DNA polimeraz kullanarak ilk tur DNA ürünlerini çoğaltın. Ardından, DNA şablonu olarak ilk tur PCR amplifikasyonunun bir mikrolitresini kullanarak, iç içe geçmiş bir ikinci tur PCR amplifikasyonu gerçekleştirin. Daha sonra, ikinci tur reaksiyon hacminin beş mikrolitresine üç mikrolitre beş x yükleme boyası ekleyin.

Bantlar çözülene kadar UV floresan DNA lekesi içeren% 1 aros, TAE jeli üzerinde 120 voltta çalıştırın. Ardından 1,6 KB'lık bantları mavi ışıklı aydınlatıcı üzerinde gözünüzde canlandırın. Bundan sonra, kalan 45 mikrolitre reaksiyon hacmini% 1 aros, DNA boyası içeren TAE jeli üzerinde çalıştırın.

Uygun bantları temiz bir tıraş bıçağıyla kesin ve kişi başına üç pozitif reaksiyonu birleştirin. Daha sonra, bir jel saflaştırma kiti kullanarak jel diliminden DNA'yı çıkarın ve nükleaz içermeyen suda ükleyin. Bu prosedürde daha sonra kullanmak üzere ürünü eksi 20 santigrat derecede dondurun.

Uzun terminali yükselttikten sonra, MJ dört plazmidinin beş asal UTR bölgesini tekrarlayın. 1.3 KB PCR ürünlerini aydınlatıcı üzerinde görselleştirin, pozitif amplikonları eksize edin, ardından daha önce açıklandığı gibi saflaştırın ve dondurun. Ardından, ek yeri örtüşme uzantısı PCR aracılığıyla kaynaşmış MJ dört LTR gag amplikonunu oluşturun.

3,2 kb uzunluğundaki amplicon'u görselleştirin, çıkarın, saflaştırın ve dondurun. Şimdi 50 santigrat derecede 1.5 saat boyunca 1.5 mikrogram MJ, dört plazmid ve 1.5 mikrogram saflaştırılmış LTR gag PCR ürününü BCL bir kısıtlama endonükleazı ile sindirin. Daha sonra, sindirim reaksiyonuna bir mikrolitre NGOM dört ekleyin ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Bundan sonra, kısıtlama sindirim reaksiyonlarına beş x yükleme boyası ekleyin. 100 voltta bir ila iki saat boyunca bir DNA lekesi içeren% 1'lik bir aros, TAE jeli üzerinde toplam hacmi yavaşça elektroforez. Daha önce açıklandığı gibi klonlama için belirtilen bantları görselleştirin, çıkarın ve saflaştırın.

Ardından, saflaştırılmış LTR tıkacı kullanarak ligasyon reaksiyonlarını hazırlayın. Üçe bir vektör oranında bir MJ dört vektör DNA'sı ekleyin. Ligasyon reaksiyonlarını gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra JM 1 0 9 kimyasal olarak yetkin bakterileri, mililitre başına 100 mikrogram ile LB burgu plakalarına yayılmış ligasyon ürünleri ile dönüştürün. Ampisilin, dönüştürülmüş bakterileri en az 22 saat boyunca 30 santigrat derecede büyütür. Klonlama doğruluğunu doğrulamak için, mini hazırlık DNA'sını NGO M four ve HPA one kısıtlama enzimleri ile iki saat boyunca 37 santigrat derecede çift sindirimde kesin.

Daha sonra, %1'lik bir aros üzerinde analiz edin. TAE jeli. Beş kez 10 ila beşinci G XR, iki beş hücreyi 0.05'lik bir enfeksiyon çokluğunda enfekte etmek için bir TZM BL hücre tahlilinden mikrolitre titresi başına IU'ya dayalı olarak her bir stoktan ihtiyaç duyulan virüs hacmini hesaplayın.

Enfeksiyon gününde tam bir önlük, yüz maskesi ve çift eldiven içeren replikasyon yetkin HIV ile çalışmak için uygun kişisel koruyucu ekipman giydiğinizden emin olun. Eksi 80 santigrat derece dondurucudan virüs stoklarını çıkarın ve çözdürün. Daha sonra, virüsü C-R-P-M-I ortamında 100 mikrolitrelik bir hacme seyreltin.

0.05 MOI'lik bir elde etmek için, her bir replikasyon deneyi setinde hem pozitif hem de negatif bir kontrol dahil olmak üzere, vbo doku kültürü ile muamele edilmiş 96 oyuklu plakaya ekleyin ve plakayı, kuyucuklar arasındaki çapraz kontaminasyonu sınırlamak için diğer her sütun boş olacak şekilde ayarlayın. Daha sonra, otomatik bir hücre sayacı kullanarak GXR iki beş hücreyi sayın ve tüm enfeksiyonlar için toplam ihtiyaç duyulan hücre sayısını hesaplayın. Gerekli hacmi 50 mililitrelik konik bir tüpe alın ve hücreleri peletlemek için santrifüjleyin.

Daha sonra ortamı dikkatlice aspire edin ve 100 mikrolitre başına beş kez 10 ila beşinci hücre konsantrasyonunda C-R-P-M-I'de yeniden süspanse edin, hücreleri steril bir oluğa pipetleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra çok kanallı bir pipet kullanarak, seyreltilmiş virüsü içeren 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre hücre ekleyin ve iyice karıştırın. Bundan sonra, her bir kuyucuğa mililitre poli beyin çözeltisi başına beş miligramlık iki mikrolitre ekleyin ve hücreleri iyice karıştırın.

Daha sonra, enfekte olmuş hücreleri santrifüjlemek için% 5 CO2 içeren bir doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede üç saat inkübe edin. Hücreleri peletlemek için 96 kuyulu V alt plaka. Daha sonra ortamın 150 mikrolitresini dikkatlice çıkarın ve hücre peletini bozmadan yeni 150 mikrolitre C-R-P-M-I ile değiştirin.

Son santrifüjlemeden sonra hücreleri yeterince yıkamak için prosedürü iki kez daha tekrarlayın ve 150 mikrolitre C-R-P-M-I ilavesi, hücre peletini çok kanallı bir pipetle yeniden süspanse edin. Karışımı her bir oyuktan 800 mikrolitre C-R-P-M-I'ye 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının bir oyuğuna ekleyin. Daha sonra plakayı her iki günde bir 37 santigrat derecede% 5 CO2 doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.

100 mikrolitre süpernatanı kültür kuyusunun yüzeyinden 96 kuyulu bir alt plakanın kuyusuna aktarın ve RT tahlili kullanarak sonraki analiz için dondurun, daha sonra hücreleri iyice yeniden süspanse edin ve hücre aşırı büyümesini önlemek için kalan hacmin yarısını çıkarın. Bundan sonra, her bir kuyucuğa 550 mikrolitre taze C-R-P-M-I ekleyerek orijinal hacmi eski haline getirin, bu prosedürde mililitre DTTP başına bir ila iki mikrolitre 10 miliküri ve dört mikrolitre bir molar DIO üç etol ekleyin. RT master karışımı DTT ve DTTP'nin her 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünü 1000 mikrolitrelik bir pipetle dikkatlice karıştırın ve steril bir oluğa aktarın.

Daha sonra 25 mikrolitre etiketli RT dağıtın. 96 kuyulu ince duvarlı bir PCR plakasının her bir kuyucuğuna karıştırın. RT ana karışımını içeren PCR plakasına her süpernatanın beş mikrolitresini ekleyin. Daha sonra PCR plakasını yapışkan bir folyo kapakla kapatın ve inkübasyondan sonra bir termosikleratör içinde 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin, 200 mikrolitrelik çok kanallı bir pipet kullanarak folyo kapağında küçük delikler açın.

Örnekleri beş kez karıştırın. Her numuneden beş mikrolitreyi DE 81 kağıda aktarın ve tüm numunelerin 10 dakika boyunca kurumasını bekleyin. Lekeleri ayrı yıkama kaplarına koyun.

Daha sonra lekeleri bir XSSC ile beş kez yıkayın. Daha sonra, kurumaya bırakmadan önce yıkama başına beş dakika boyunca% 90 etanol ile iki kez. Kuruduktan sonra, lekeyi dikkatlice Saran sargısına sarın ve gece boyunca oda sıcaklığında sıkıca kapatılmış bir kaset içinde fosfo ekrana maruz bırakın.

Hazır olduğunda, fosfo ekranlarını bir fosfo görüntüleyici ile analiz edin ve radyoaktif transkriptleri ölçün. Gösterilen. Burada, MJ dört plazmit omurgasına klonlanabilen hastadan türetilmiş bir gag amplikonu oluşturmak için gerekli olan çeşitli PCR amplikonlarının elektroforetik ayrımını gösteren temsili jel görüntüleri bulunmaktadır. Bu temsili jel görüntüsü, hasta tıkaç genlerini MJ dörde klonlamak için kısıtlama sindirimlerinin elektroforetik ayrımını göstermektedir.

Ve bu temsili jel görüntüsü, kısıtlamanın elektroforetik ayrılmasını tasvir eder, saflaştırılmış bir tıkaç MJ dört kimera plazmid DNA'sını sindirir. Bu grafik, G XR iki beş hücre hattında replikasyon testinin zaman içinde tekrarlanabilirliğini göstermektedir. Aynı gag MJ dört kimerik virüs, yaklaşık bir yıl arayla gerçekleştirilen iki bağımsız deneyde G XR iki beş hücreyi enfekte etmek için kullanıldı.

Replikasyon skorları, log dönüştürülmüş DLU değerlerinin eğimi hesaplanarak ve bu eğim vahşi tip MJ dörde normalleştirilerek oluşturulmuştur. İki bağımsız ölçüm güçlü bir şekilde ilişkilidir ve farklı zamanlarda ve farklı geçişlerdeki hücrelerle gerçekleştirilen tahlillerin tekrarlanabilirliğini vurgular. Bu teknik, HIV AIDS alanındaki araştırmacıların patogenezin viral belirleyicilerini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Akut alt tip C enfeksiyonunda, dünya çapında en sık görülen alt tiptir. Replikasyon konusunda yetkin HIV ile çalışmak son derece tehlikeli olabilir. Canlı virüs içeren tüm adımlar bir BSL iki artı tesisinde gerçekleştirilmelidir.

Tüm yüzeyler düzenli olarak dekontamine edilmeli ve her zaman çift eldiven giyilmelidir.