Name: Bir Kısıtlama Enzim Temelli Klonlama Yöntemi değerlendirin In vitro HIV-1 Tipi C Gag-MJ4 Kimerik Virüslerin Çoğaltma Kapasitesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Öğrenin, kısıtlama enzim temelli klonlama yöntemiyle HIV-1 Gag-MJ4 kimerik virüslerin in vitro çoğaltma kapasitesini nasıl değerlendireceğinizi. Bu teknik, viral patogenez ve replikasyon kinetiği çalışmaları için güvenilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Araştırmacılar, bu çalışmaya katılan Zambiya'daki tüm gönüllülere ve bu çalışmayı mümkün kılan Lusaka'daki Zambiya Emory HIV Araştırma Projesi'ndeki tüm personele teşekkür eder. Araştırmacılar, teknik yardım ve numune yönetimi için Jon Allen, Smita Chavan ve Mackenzie Hurlston'a teşekkür eder. Ayrıca Dr. Mark Brockman'a tartışmaları ve GXR25 hücrelerinin cömert bağışı için teşekkür etmek istiyoruz.
Bu çalışma R01 AI64060 ve R37 AI51231 (EH) ve Uluslararası AIDS Aşı Girişimi tarafından finanse edilmiştir. Bu çalışma, kısmen Amerika Birleşik Devletleri Uluslararası Kalkınma Ajansı (USAID) aracılığıyla Amerikan halkının cömert desteğiyle mümkün olmuştur. İçerikler çalışma yazarlarının sorumluluğundadır ve USAID'in veya Amerika Birleşik Devletleri Hükümeti'nin görüşlerini yansıtmak zorunda değildir. Bu çalışma aynı zamanda kısmen Emory AIDS Araştırma Merkezi'ndeki Viroloji Çekirdeği (Grant P30 AI050409) tarafından da desteklenmiştir. DC ve JP kısmen Action Cycling Fellowships tarafından desteklendi. Bu çalışma kısmen Yerkes Ulusal Primat Araştırma Merkezi temel hibesi (2P51RR000165-51) ile desteklenmiştir. Bu proje aynı zamanda kısmen Ulusal Araştırma Kaynakları P51RR165 Merkezi tarafından finanse edilmiştir ve şu anda Araştırma Altyapısı Programları Ofisi / OD P51OD11132 tarafından desteklenmektedir.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Nedeniyle uzunluk ve bu protokol, teknik doğası nedeniyle, kimerik Gag-MJ4 plasmidlerin kurulmasında her ikisi için önemli bir unsur olarak ayrıca viral replikasyon kapasitesinin ölçümü için olan birkaç adım vardır. Bu protokolde belirtilen MJ4 yabancı öğürme genlerin tanıtımı için kısıtlama enzim bazlı klonlama stratejisi önceden kullanılan rekombinasyon bazlı yöntemlere göre çok sayıda avantajları olmasına rağmen kritik adımlar tam uyulmadığı takdirde, protokol teknik olarak zor olabilir. <p class="jove_c...

Ana ve HIV-1 patogenezi ve hastalığın ilerlemesi rasyonel aşı tasarımı için her şeyden önemlidir etkileyen viral özelliklerini hem belirlenmesi. Hücresel bağışıklık tepkisi, HIV-1 enfeksiyonu, insan bağışıklık tepkisinin temel bir bileşenidir. Sitotoksik T lenfositleri (CTL), akut viremi başlangıç ​​kontrolü için gerekli olan ve ana sabit bir düzeye (set noktası) virüs yükü, 1,2 kurmaya olanak verir. Bu efektör hücrelerin deneysel tükenmesi viral kontrole 3,4 kaybı ile sonuçlanır. Buna rağmen, mutasyon viral yönden enfekte hücreler 5-9 arasında CTL tanıması bozmak, viral genom içinde ortaya için dizayn edildi. Belirli HLA allelleri düşük viral yük ve B * 57, B * 27 ve B * 81 10-15 olmak üzere yavaş hastalığın ilerlemesi ile ilişkilendirilmiştir. HLA sınıf I alelleri koruyucu yarar bir kısmı, örneğin Gag gibi genomunun işlevsel olarak sınırlı bölgeleri hedef gerçeğine atfedilebilirve in vitro 16-21 çoğaltmak virüsün yeteneğini azaltmak kaçış mutasyonları için seçin. Hücresel bağışıklık sistemi için bir kaçış I aleli seçme HLA sınıf bağlamında virüse yararlı olmakla birlikte, bu mutasyonlar etkisinin bir HLA-uyumsuz 22,23 münferit iletim üzerine ev için farklı sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, viral replikasyon kapasitesi üzerinde iletilen HLA ilişkili kaçış mutasyonların etkilerini anlamak erken HIV-1 patogenezinde anlayışımızı ilerletmek için önemli olacaktır. Ben 24-29 kadar ilerleme allel spesifik HLA sınıf ile ilişkili bireysel kaçış mutasyonları fitness kusurları tespit ve karakterize etmek için yapılmış olmakla birlikte, doğal olarak, HIV-1 izolatları, HLA ilişkili polimorfizmlerin özel ve karmaşık bir ayak izleri büyük olasılıkla HLA kaynaklanan olarak oluşan Farklı immünogenetik geçmişlere 30 aracılıkh bağışıklık basıncı. Apnceki analizi, Goepfert ve diğ. 88 akut enfekte Zambiyalılar türetilen iletilen Gag dizilerinde HLA ilişkili bir mutasyon birikimi ayar noktası viral yükte 31 bir azalma ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu HLA uyumsuz alıcılara özel Gag zararlı kaçış mutasyonları iletim, bir klinik yarar sağlar ve viral replikasyon zayıflatılmış bağlı olabileceğini düşündürmektedir. İleride, bu tür çoğaltma kapasitesi ve erken çoğaltma sırayla HIV-1 klinik parametreleri ve geç-sahne nasıl etkileyebileceğini olarak iletilen virüsün özelliklerini tanımlamak için konser çalışmaları nasıl karmaşık Gag polimorfizmlerinin kombinasyonları doğal olarak oluşan izolatları içinde çalışmaya zorunlu olduğunu patogenezi. Broekman et al. Birinci alt tip C ve hem de B enfeksiyonlarının kronik aşamalı enfeksiyon ve viral yükü sırasında izole gag-pro sekansları replikasyon kapasitesi arasında bir bağ göstermiştir32-35. Bu çalışmalarda sunulan deneysel yaklaşım, kronik olarak enfekte edilmiş bireylerden türetilen dizilerinin in vitro replikasyon kapasitesi incelenmesi için her ne kadar uygun olan, akut enfeksiyonlu bireyler zor alt tip C, HIV-1 replikatif kapasite ders yapmayı çok sayıda teknik belgesine ve sınırlamalar vardır. Bu yöntem LAV kısmen elde edildi alt tip B NL4-3 Provirüsün, içine nüfus tabanlı PCR çoğaltılmış dizi rekombinasyon dayanan, bir laboratuvar virüs stokları 36 uyarlanmıştır. Virüs üretimi PCR amplikonlarının bir CEM dayalı T hücre hattı 37 birlikte-transfeksiyonu ile gerçekleştirilebilir ve delta-gag-Pro NL4-3 DNA sindirildi. Bu yöntem, potansiyel olarak, in vivo olarak, viral quasi ile ilgili olarak geri kazanılan virüs stokunun doğasını eğriltme ve bu nedenle in vitro replikasyon kapasitesi ölçülmesini değiştirerek, haftalar ve aylar arasında bir süre içinde virüsünün gelişimini gerektirir. Bu yöntem, Ikronik olarak enfekte bireylerin büyük bir sayıda çok sayıda, farklı viral varyantları klonlama etkili yüksek kapasiteli replikatif virüs seçtiği, kronik olarak enfekte olmuş bireylerin incelenerek ve burada daha uygun s uygun bu nedenle oldukça emek yoğun değildir. Ancak, akut enfekte olmuş kişide, genel olarak 1-2 varyantları mevcut bulunmaktadır ve bu nedenle, in vitro seçme basınçları ile geri kazanılan virüs stokunun doğasını eğriltme riskini ortadan kaldırır, in vitro replikasyon kapasitesi daha doğru bir şekilde değerlendirilmesi için sağlar. İkincisi, bu yöntem bir alt tip B türetilmiş omurgası içine alt tip C gag-yanlısı dizileri birleştirilmesini gerektirir ve analiz içine omurga uyumsuzluk önyargıları tanıtmak olabilir. Bu sınırlamalar nedeniyle, dizilerin sayıda oluşan herhangi bir muhtemel yanlılığı üstesinden gelmek için analiz edilmelidir. Burada alternatif bir deneysel bir yaklaşımı açıklamakalt tip C, akut olarak enfekte olmuş bireylerdeki türetilen sekansları üzerinde çalışmaya uygun ACH. Bu alt tip C Proviral omurgasına MJ4 olarak HIV-1 alt tip C enfekte bireylerin akut enfeksiyon zaman noktalarında elde edilen gag geninin katılması, bir kısıtlayıcı enzim bazlı klonlama stratejisi kullanın. Gag genleri klonlamak için ortak bir omurga olarak MJ4 kullanılması alt tipi C türetilmiş sekansların analizi için çok önemlidir. MJ4 nedeniyle omurga ve gag geni arasındaki alt tipi uyumsuzluk önyargı tanıtmak için daha az muhtemel olacağını, böylece primer izolat 38 türetilmiştir edilir ve. Proviral 293T hücreleri doğrudan transfekte edilmesi gereken yapıların ve klonlanmış gag dizisi ile aynı olan bir klonal virüs stokunun geri kazanımı için Buna ek olarak, kısıtlama enzim bazlı klonlama bölgesinin bir yaklaşım sağlar. Aşağıda sunulan yöntem türetilmiş Gag-MJ4 alt tip C çoğaltma kapasitesini değerlendirmek için yüksek verimli bir yöntemdirsimerik virüslerin. 293T hücreleri içine transfeksiyonu basittir ve virüsün geri üç gün sürer. In vitro replikasyon kapasitesi. Brockman et al tarafından oluşturulan aynı CEM-CCR5 göre T-hücresi hattında 37 tahlil, ancak başarılı bir çoğaltma için gerekli olan önemli değişiklikler protokolü kullanarak alt tip C MJ4 simerik virüslerin. PBMC&#39;ler daha çok, uygun bir T-hücresi çizgisinin kullanımı, yüksek tahlil üretilebilirliğine ile test edilecek olan alt tip C MJ4-simerik virüslerin çok sayıda sağlar. Son olarak, üstte yüzen madde içindeki virüs miktarının tayini için bir radyo-etiketli ters transkriptaz deneyi kullanılarak ticari olarak temin edilebilen ELISA kitleri kullanılarak P24 den daha düşük maliyetlidir. Ayrıca, aynı tahlilde, hem zayıf ve son derece kopyalayan virüs tespit etmek ve suşlar arasında çoğaltma ince farklar tespit edilmesi için önemli olan bir yüksek dinamik aralık verir. Sonuç olarak, burada sunulan yöntem için izin verdiHIV-1 alt tip C türetilen öğürme dizilerinin çoğaltma kapasitesi derinlemesine çalışma akut Zambiya bireylerin enfekte ve yazılı olarak, ayrıca C popülasyonları enfekte diğer subtipini incelemek için genişletilmiş olabilir. Farklı Gag izolatlar arasında çoğaltma kapasitelerde varyasyon yüksek derecede gözlenmiştir. Ayrıca, üç yıllık bir süre üzerinde 39 CD4 + düşüş iletilen Gag çoğaltma kapasitesine ve set noktası viral yük arasındaki yanı sıra ile istatistiksel bir ilişki göstermek için başardık. Bu sonuçlar, bu tür çoğaltma kapasitesi nasıl bulaşan viral özellikleri, çalışmanın önemini vurgulamak, erken enfeksiyon sırasında patogenezi etkilemeye konak bağışıklık sistemi ile etkileşim ve etkin bir aşı müdahaleleri gibi tedaviler geliştirilmesinde ayrılmaz olacaktır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">PCR Reaktifleri</td></tr><tr><td>GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz</td></tr><tr><td>giderme MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz için3</td></tr><tr><td>: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>CoolRack PCR 96 XT</td><td>Biocision</td><td>BCS-529</td><td></td></tr><tr><td>CoolRack M15</td><td>Biocision</td><td>BCS-125</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Fisher</td><td>SH30538FS</td><td>Hyclone</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Kiti</td><td>tarafından üretilmiştir Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>Simport PCR 8 Şerit Tüpler, Mavi (Düz Kapak)</td> <td>Daigger</td><td>EF3647BX</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III tek adımlı RT-PCR sistemi</td><td>Yaşam Teknolojileri/Invitrogen</td><td>12574035</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Sıcak başlangıç II DNA polimeraz</td><td>Fisher</td><td>F-549L</td><td></td></tr><tr><td>PCR Nükleotid </td><td>Roche</td><td>4638956001</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz, yüksek jel mukavemeti</td><td>Fisher</td><td>50-213-128</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>Promega 1 kb DNA merdiveni</td><td>Fisher</td><td>PRG5711</td><td>Promega Sybr tarafından üretilmiştir</td></tr><tr><td>Güvenli DNA Jel Boyası, 10.000x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Sihirbaz SV Jel ve PCR Temizleme Sistemi</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş bıçakları, tek kenarlı</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td>Cerrahi Tasarım</td></tr><tr><td>Thermocycler tarafından üretilmiştir, PTC-200</td><td>MJ Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Mikrobiyoloji & Klonlama Reaktifleri</güçlü></td></tr><tr><td>LB Ağar, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LB Et Suyu, Lennox</td><td>Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Steril 100 x 15 mm polistiren Petri kapları</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14 ml Polipropilen yuvarlak tabanlı tüpler</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>352059</tr><tr><td>NgoMIV kısıtlama endonükleazı</td><td>New England BioLabs</td><td>R0564L</td><td></td></tr><tr><td>BclI kısıtlama endonükleazı</td><td>New England BioLabs</td><td>R0160L</td><td></td></tr><tr><td>HpaI kısıtlama endonükleazı</td><td>New England BioLabs</td><td>R0105L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz, 5 U/&mu; l</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td></td></tr><tr><td>JM109 yetkin hücreler, >108 cfu/&mu; g</td><td>Promega</td><td>L2001</td><td></td></tr><tr><td>PureYield plazmid miniprep sistemi</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>Güvenli Görüntüleyici 2.0 Mavi Işık Transilluminator</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofüj 18 santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Hücre Kültürü Reaktifleri</td></tr><tr><td>Amphyl temizleyici/dezenfektan</td><td>Fisher</td><td>22-030-394</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD, 1 ml</td><td>VWR</td><td>PAE2311</td><td>Promega</td></tr><tr><td>Heksadimetrin bromür (Polibren)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Costar Plakaları, 6 kuyulu, düz</td><td>Fisher</td><td>07-200-83</td><td>Corning Life tarafından üretilmiştir</td></tr><tr><td>Costar Plakaları, 24 kuyulu, düz</td><td>Fisher</td><td>07-200-84</td><td>Corning Life</td></tr> <tr>tarafından üretilmiştir<td>Costar Plakaları, 96 kuyulu, yuvarlak</td><td>Fisher</td><td>07-200-95</td><td>Corning Life</td></tr><tr><td>Şişeleri tarafından üretilmiştir, Corning filtre üstü/eğimli boyun, 75 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-37</td><td></td></tr><tr><td>Şişeler, Corning filtre üstü/eğimli boyun, 150 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-34</td><td>Corning Life tarafından üretilmiştir</td></tr><tr><td>Konik Tüpler, 50 ml, mavi kapaklı</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td>BD Biosciences tarafından üretilmiştir</td></tr><tr><td>Konik Tüpler, 15 ml, mavi kapaklı</td><td>Fisher</td><td>14-959-70C</td><td>BD Biosciences tarafından üretilmiştir</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CI</td><td>Mediatech</td></tr><tr><td>RPMI, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin/Glutamin, 100x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS, magnezyum ve kalsiyum içeren, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS magnezyum ve kalsiyum içermeyen</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Sarstedt tüpleri, çeşitli renkler</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.996</td><td></td></tr><tr><td>Rezervuar Tepsileri Çok kanallı, 55 ml</td><td>Fisher</td><td>13-681-501</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Fisher</td><td>NC9691007</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 iyi berrak V alt doku kültürü ile tedavi edilmiş mikroplaka</td><td>Fisher</td><td>07-200-96</td><td>Corning Life</td></tr><tr><td>HEPES tarafından üretilmiştir, 1 M Tampon Çözelti</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS, Tanımlı, 500 ml</td><td>Fisher</td><td>SH30070 03</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>VWR</td><td>PAV3941</td><td>Promega Glutaraldehyde tarafından üretilmiştir</td></tr><tr><td>, Grade II, H2O içinde %25</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1 M Magnezyum klorür çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler biyoloji için formaldehit çözeltisi, %36,5</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hekzasiyanoferrat(II) trihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387-100G</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hekzasiyanoferrat(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8131-100G</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15-R santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>TC10 otomatik hücre sayacı</td><td>Bio-Rad</td><td>1450001</td><td></td></tr><tr><td>VistaVision ters mikroskop</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Ters Transkriptaz Miktar Tayini Test Reaktifleri</td></tr><tr><td>dTTP, [&alpha;-33P]- 3000 Ci / mmol, 10 mCi / ml, 1 mCi</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEG605H001MC</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-Cl, pH 8.0</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15568025</td><td>KOH 2 M ile pH 7.8'e ayarlanmalıdır</td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9640G</td><td>Ayarlayın 1 M çözeltiye</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Roche</td><td>11333941103</td><td></td></tr><tr><td>Poliadenlik asit (Poli rA) potasyum tuzu&nbsp;</td><td>Midland Reaktif A.Ş.</td><td>P-3001</td><td></td></tr><tr><td>Oligo d (T) primer</td><td>Yaşam Teknolojileri / Invitrogen</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>Ditiyotreitol (DTT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>SR, Süper Çözünürlüklü Fosfor Ekran, Küçük</td><td>Perkin-Elmer</td><td>7001485</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Thermowell 96 kuyulu plaka modeli (M) Polikarbonat</td><td>Fisher</td><td>07-200-245</td><td>Corning Life tarafından üretilmiştir</td>.</tr><tr><td>Corning 96 kuyulu Mikroplaka Alüminyum Sızdırmazlık Bandı, Steril</td><td>Olmayan Fisher</td><td>07-200-684</td><td>Corning Life</td></tr><tr><td>tarafından üretilmiştir DE-81 anyon değişim kağıdı</td><td>Whatman</td><td>3658-915</td><td></td></tr><tr><td>Trisodyum sitrat dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Fisher</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Otoradyografi kaseti</td><td>Fisher</td><td>FB-CA-810</td><td></td></tr><tr><td>Siklon depolama fosfat ekranı</td><td>Packard</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bir kısıtlama enzim temelli klonlama yöntemi değerlendirin<em&gt; in vitro</em&gt; hiv-1 tipi c gag-mj4 kimerik virüslerin Çoğaltma kapasitesi

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Birçok HLA sınıf I alelinin HIV-1 patogenezi ve hastalığın ilerlemesi üzerindeki koruyucu etkisi, kısmen, HIV-1 genomunun zorlukla kaçan korunmuş kısımlarını hedefleme yeteneklerine atfedilir. Hücresel bağışıklık basıncına atfedilen dizi değişiklikleri, enfeksiyon sırasında genom boyunca ortaya çıkar ve Gag gibi genomun korunmuş bölgelerinde bulunursa, virüsün in vitro olarak çoğalma yeteneğini etkileyebilir. Gag'daki HLA'ya bağlı polimorfizmlerin HLA uyumsuz alıcılara iletilmesi, azaltılmış ayar noktası viral yükleri ile ilişkilendirilmiştir. Bunun, virüsün replikasyon kapasitesinin azalmasından kaynaklanabileceğini varsaydık. Burada, HIV-1'in in vitro replikasyonunu, alt tip C ile enfekte Zambiyalılardan akut zaman noktalarından izole edilen gag geninden etkilendiği şekilde değerlendirmek için yeni bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, gag genini ortak bir alt tip C HIV-1 proviral omurga olan MJ4'e yerleştirmek için kısıtlama enzimi bazlı klonlamayı kullanır. Bu, kronik olarak türetilmiş gag-pro dizilerinin in vitro replikasyonunu değerlendiren önceki rekombinasyon tabanlı yöntemlerden ziyade alt tip C dizilerinin incelenmesine daha uygun hale getirir. Bununla birlikte, protokol diğer alt tiplerden virüslerin çalışmaları için kolayca değiştirilebilir. Ayrıca, bu protokol, Gag-MJ4 kimerik virüslerinin CEM tabanlı bir T hücre hattı üzerindeki replikasyon kapasitesini değerlendirmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntemi detaylandırır. Bu yöntem, akut olarak enfekte olmuş 149 alt tip C Zambiyalıdan türetilen Gag-MJ4 kimerik virüslerinin incelenmesi için kullanıldı ve Gag'da replikasyonu etkileyen kalıntıların tanımlanmasına izin verdi. Daha da önemlisi, bu tekniğin uygulanması, viral replikasyonun, ayar noktası viral yükü ve uzunlamasına CD4+ T hücresi düşüşü gibi erken HIV-1 patogenezinin parametrelerini nasıl tanımladığının daha derin bir şekilde anlaşılmasını kolaylaştırmıştır.

Düzgün tam fonksiyonel, bulaşıcı Gag-MJ4 şimeralar montaj yeteneğine sahip bir proviral plazmid oluşturur bu protokolü, yürütmek amacıyla, büyük bakım uygun PCR amplıkonları oluşturmak için alınmalıdır. PCR uygun büyüklükte öğürme Amplikon&#39;u üretti olmadığının saptanması önemlidir. Ürünler, şekil 1A&#39;da gösterilen yaklaşık olarak 1700 bp&#39;lik bir amplikon, 100 baz çifti (bp) içinde olmalıdır. Bu fragmanın tam uzunluğu, çalışma kapsamında gag geni bağlı olarak değişecektir. Da...

HIV-1 patogenezi hem viral özellikler hem de konak genetik faktörleri ile tanımlanır. Burada, gag gen dizisi varyasyonunun virüsün in vitro replikasyon kapasitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için tekrarlanabilir ölçümlere izin veren sağlam bir yöntemi açıklıyoruz.

Bir Kısıtlama Enzim Temelli Klonlama Yöntemi değerlendirin<em&gt; In vitro</em&gt; HIV-1 Tipi C Gag-MJ4 Kimerik Virüslerin Çoğaltma Kapasitesi

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Bu prosedürün genel amacı, gag sekans polimorfizmlerinin in vitro HIV1 replikasyon kapasitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için, alt tip-C HIV1 enfekte bireylerden türetilen gag genlerini replikasyon yeteneğine sahip bir HIV1 plazmidine dahil etmektir. Bu işlem, öncelikle hastanın plazmasından gag geninin amplifiye edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hastadan türetilen gag sekansının replikasyon yeteneğine sahip enfeksiyöz moleküler klon MJ-four içerisine klonlanmasıdır. Ardından, enfeksiyöz viral stoklar oluşturmak için gag-MJ-four kimera plazmidi transfekte edilir ve bir indikatör hücre hattı üzerindeki enfektiviteyi değerlendirmek için titresi belirlenir. Son adım, GXR-25 T-hücre hattında in vitro replikasyon kapasitesini ölçmektir. Nihayetinde, viral replikasyon kinetiğini görselleştirmek amacıyla, zaman içindeki virion üretimini nicelleştirmek için radyoaktif işaretli bir ters transkriptaz analizi kullanılır.Bugün açıklayacağımız yöntem, HIV alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bunlar arasında HIV replikasyon uygunluğunun belirleyicilerinin tanımlanması ve HIV uygunluğunun uzun vadeli patogenezi nasıl etkilediğinin anlaşılması yer almaktadı

a-restriction-enzyme-based-cloning-method-to-assess-vitro-replication

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu görüntülenmiştir deney canlı konfokal görüntüleme deneyleri için HIV floresan moleküler klon kullanan için bir rehber.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

Heterokaryon Oluşumu İki Yöntemleri HCV Sınırlayıcı Etkenler Discover

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Kaynak: Claiborne, D. T. et al. A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses. J. Vis. Exp. (2014)Bu video, radyomarked reverse transcriptase deneyi kullanılarak viral replikasyon kapasitesinin değerlendirilmesini göstermektedir. Progeny virionlar içeren kültür süpernatantları, radyomarked bir nükleotid içeren bir reverse transkripsiyon karışımına eklenir. İnkorpore olan sinyal, viral çıktıyı ve replikasyon...

Radyoetiketli bir Ters Transkriptaz Deneyi ile Viral Replikasyon Kapasitesinin Değerlendirilmesi

Neredeyse izojenik virüsler arasındaki büyüme rekabeti, göreceli replikasyon uygunluğunu belirlemek için hassas bir ölçüm sağlar. Burada açıklanan protokoller, rekombinant HIV-1 klonlarının oluşturulmasını, virüs yayılımını ve büyüme rekabetini ve hassas ve tutarlı sonuçlar elde etmek için optimize edilmiş analiz yöntemlerini içerir.

İnsan İmmün Yetmezlik Virüs çoğaltma Fitness belirlenmesi için İkili Büyüme Rekabet Analizi

Burada, Japon ensefalit virüsünün pozitif sarmallı genomik RNA'sının tam uzunlukta bir cDNA'sını içeren bulaşıcı bir bakteriyel yapay kromozom oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, diğer pozitif sarmallı RNA virüslerinin işlevsel bir cDNA'sını oluşturmak için kullanılabilir, bu da onu virüs biyolojisini incelemek için güçlü bir genomik araç haline getirir.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından algılanabilir yeşil flüoresan proteinin ifade bildirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklar. İnhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılabilir.

Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

Biz yeni tüp bebek modelleri üretimi için seçili genomik sitelerdeki proviral tümleştirme özetlemek HIV-1 enfeksiyonu için genom mühendislik iş akışı mevcut. HIV kaynaklı gazetecilere hedefleme CRISPR-Cas9-aracılı, siteye özgü genom manipülasyon tarafından yönetilir. Detaylı iletişim kuralları tek hücreli klon üretimi, tarama ve doğru hedefleme doğrulama için sağlanan.

HIV-1 enfeksiyonu seçili Proviral tümleştirme siteleri ile Jurkat muhabir modelleri oluşturmak için CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik

HIV verimli yeniden etkinleştirme işlev değerlendirmesi ve gizli proviruses boşluk için yüksek aktarım protokolü açıklanan ve müdahaleler HIV transkripsiyon üzerinde etkisini test ve yapıştırma uygulanır. Soldan sağa dayalı transkripsiyon ajanlara geri ve yapıştırma gecikme etkisi temsilcisi sonuçları sağlanır.

Vitro değerlendirme HIV transkripsiyon ve yapıştırma ajanları geri gecikme süresi yüksek işlem hacmi

Burada açıklanan, hücresel inhibitör protein SAMHD1 tarafından HIV-1 kısıtlamasının derecesini belirlemek için kurulmuş bir yöntemdir. İnsan miyeloid soy U937 hücreleri, YFP'yi birlikte eksprese eden bir SAMHD1 ekspresyon vektörü ile dönüştürülür, farklılaştırılır ve daha sonra HIV-RFP ile zorlanır. Kısıtlama seviyesi akım sitometri analizi ile belirlenir.

İnsan Miyeloid U937 Hücrelerinde Akış Sitometrisi ile SAMHD1 Kısıtlamasının Analizi

Burada, özellikle HIV-1 enfeksiyonuna vurgu yaparak, endoplazmik retikulum (ER) stresini ve katlanmamış protein yanıtı (UPR) aktivasyonunu belirlemek için bazı yerleşik yöntemleri açıklıyoruz. Bu makalede ayrıca ER stresi/UPR'nin HIV-1 replikasyonu ve virion enfektivitesi üzerindeki etkisini araştırmak için bir dizi protokol açıklanmaktadır.

HIV-1 ile Enfekte T Hücrelerinde Endoplazmik Retikulum Stresi ve Katlanmamış Protein Yanıtının Ölçülmesi ve HIV-1 Replikasyonundaki Rolünün İncelenmesi

Öğrenin, kısıtlama enzim temelli klonlama yöntemiyle HIV-1 Gag-MJ4 kimerik virüslerin in vitro çoğaltma kapasitesini nasıl değerlendireceğinizi. Bu teknik, viral patogenez ve replikasyon kinetiği çalışmaları için güvenilir sonuçlar sunar.

Bir Kısıtlama Enzim Temelli Klonlama Yöntemi değerlendirin

Daha fazla video keşfet