Name: Bir Kısıtlama Enzim Temelli Klonlama Yöntemi değerlendirin In vitro HIV-1 Tipi C Gag-MJ4 Kimerik Virüslerin Çoğaltma Kapasitesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Öğrenin, kısıtlama enzim temelli klonlama yöntemiyle HIV-1 Gag-MJ4 kimerik virüslerin in vitro çoğaltma kapasitesini nasıl değerlendireceğinizi. Bu teknik, viral patogenez ve replikasyon kinetiği çalışmaları için güvenilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Araştırmacılar, bu çalışmaya katılan Zambiya'daki tüm gönüllülere ve bu çalışmayı mümkün kılan Lusaka'daki Zambiya Emory HIV Araştırma Projesi'ndeki tüm personele teşekkür eder. Araştırmacılar, teknik yardım ve numune yönetimi için Jon Allen, Smita Chavan ve Mackenzie Hurlston'a teşekkür eder. Ayrıca Dr. Mark Brockman'a tartışmaları ve GXR25 hücrelerinin cömert bağışı için teşekkür etmek istiyoruz.
Bu çalışma R01 AI64060 ve R37 AI51231 (EH) ve Uluslararası AIDS Aşı Girişimi tarafından finanse edilmiştir. Bu çalışma, kısmen Amerika Birleşik Devletleri Uluslararası Kalkınma Ajansı (USAID) aracılığıyla Amerikan halkının cömert desteğiyle mümkün olmuştur. İçerikler çalışma yazarlarının sorumluluğundadır ve USAID'in veya Amerika Birleşik Devletleri Hükümeti'nin görüşlerini yansıtmak zorunda değildir. Bu çalışma aynı zamanda kısmen Emory AIDS Araştırma Merkezi'ndeki Viroloji Çekirdeği (Grant P30 AI050409) tarafından da desteklenmiştir. DC ve JP kısmen Action Cycling Fellowships tarafından desteklendi. Bu çalışma kısmen Yerkes Ulusal Primat Araştırma Merkezi temel hibesi (2P51RR000165-51) ile desteklenmiştir. Bu proje aynı zamanda kısmen Ulusal Araştırma Kaynakları P51RR165 Merkezi tarafından finanse edilmiştir ve şu anda Araştırma Altyapısı Programları Ofisi / OD P51OD11132 tarafından desteklenmektedir.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Nedeniyle uzunluk ve bu protokol, teknik doğası nedeniyle, kimerik Gag-MJ4 plasmidlerin kurulmasında her ikisi için önemli bir unsur olarak ayrıca viral replikasyon kapasitesinin ölçümü için olan birkaç adım vardır. Bu protokolde belirtilen MJ4 yabancı öğürme genlerin tanıtımı için kısıtlama enzim bazlı klonlama stratejisi önceden kullanılan rekombinasyon bazlı yöntemlere göre çok sayıda avantajları olmasına rağmen kritik adımlar tam uyulmadığı takdirde, protokol teknik olarak zor olabilir. <p class="jove_c...

Ana ve HIV-1 patogenezi ve hastalığın ilerlemesi rasyonel aşı tasarımı için her şeyden önemlidir etkileyen viral özelliklerini hem belirlenmesi. Hücresel bağışıklık tepkisi, HIV-1 enfeksiyonu, insan bağışıklık tepkisinin temel bir bileşenidir. Sitotoksik T lenfositleri (CTL), akut viremi başlangıç ​​kontrolü için gerekli olan ve ana sabit bir düzeye (set noktası) virüs yükü, 1,2 kurmaya olanak verir. Bu efektör hücrelerin deneysel tükenmesi viral kontrole 3,4 kaybı ile sonuçlanır. Buna rağmen, mutasyon viral yönden enfekte hücreler 5-9 arasında CTL tanıması bozmak, viral genom içinde ortaya için dizayn edildi. Belirli HLA allelleri düşük viral yük ve B * 57, B * 27 ve B * 81 10-15 olmak üzere yavaş hastalığın ilerlemesi ile ilişkilendirilmiştir. HLA sınıf I alelleri koruyucu yarar bir kısmı, örneğin Gag gibi genomunun işlevsel olarak sınırlı bölgeleri hedef gerçeğine atfedilebilirve in vitro 16-21 çoğaltmak virüsün yeteneğini azaltmak kaçış mutasyonları için seçin. Hücresel bağışıklık sistemi için bir kaçış I aleli seçme HLA sınıf bağlamında virüse yararlı olmakla birlikte, bu mutasyonlar etkisinin bir HLA-uyumsuz 22,23 münferit iletim üzerine ev için farklı sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, viral replikasyon kapasitesi üzerinde iletilen HLA ilişkili kaçış mutasyonların etkilerini anlamak erken HIV-1 patogenezinde anlayışımızı ilerletmek için önemli olacaktır. Ben 24-29 kadar ilerleme allel spesifik HLA sınıf ile ilişkili bireysel kaçış mutasyonları fitness kusurları tespit ve karakterize etmek için yapılmış olmakla birlikte, doğal olarak, HIV-1 izolatları, HLA ilişkili polimorfizmlerin özel ve karmaşık bir ayak izleri büyük olasılıkla HLA kaynaklanan olarak oluşan Farklı immünogenetik geçmişlere 30 aracılıkh bağışıklık basıncı. Apnceki analizi, Goepfert ve diğ. 88 akut enfekte Zambiyalılar türetilen iletilen Gag dizilerinde HLA ilişkili bir mutasyon birikimi ayar noktası viral yükte 31 bir azalma ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu HLA uyumsuz alıcılara özel Gag zararlı kaçış mutasyonları iletim, bir klinik yarar sağlar ve viral replikasyon zayıflatılmış bağlı olabileceğini düşündürmektedir. İleride, bu tür çoğaltma kapasitesi ve erken çoğaltma sırayla HIV-1 klinik parametreleri ve geç-sahne nasıl etkileyebileceğini olarak iletilen virüsün özelliklerini tanımlamak için konser çalışmaları nasıl karmaşık Gag polimorfizmlerinin kombinasyonları doğal olarak oluşan izolatları içinde çalışmaya zorunlu olduğunu patogenezi. Broekman et al. Birinci alt tip C ve hem de B enfeksiyonlarının kronik aşamalı enfeksiyon ve viral yükü sırasında izole gag-pro sekansları replikasyon kapasitesi arasında bir bağ göstermiştir32-35. Bu çalışmalarda sunulan deneysel yaklaşım, kronik olarak enfekte edilmiş bireylerden türetilen dizilerinin in vitro replikasyon kapasitesi incelenmesi için her ne kadar uygun olan, akut enfeksiyonlu bireyler zor alt tip C, HIV-1 replikatif kapasite ders yapmayı çok sayıda teknik belgesine ve sınırlamalar vardır. Bu yöntem LAV kısmen elde edildi alt tip B NL4-3 Provirüsün, içine nüfus tabanlı PCR çoğaltılmış dizi rekombinasyon dayanan, bir laboratuvar virüs stokları 36 uyarlanmıştır. Virüs üretimi PCR amplikonlarının bir CEM dayalı T hücre hattı 37 birlikte-transfeksiyonu ile gerçekleştirilebilir ve delta-gag-Pro NL4-3 DNA sindirildi. Bu yöntem, potansiyel olarak, in vivo olarak, viral quasi ile ilgili olarak geri kazanılan virüs stokunun doğasını eğriltme ve bu nedenle in vitro replikasyon kapasitesi ölçülmesini değiştirerek, haftalar ve aylar arasında bir süre içinde virüsünün gelişimini gerektirir. Bu yöntem, Ikronik olarak enfekte bireylerin büyük bir sayıda çok sayıda, farklı viral varyantları klonlama etkili yüksek kapasiteli replikatif virüs seçtiği, kronik olarak enfekte olmuş bireylerin incelenerek ve burada daha uygun s uygun bu nedenle oldukça emek yoğun değildir. Ancak, akut enfekte olmuş kişide, genel olarak 1-2 varyantları mevcut bulunmaktadır ve bu nedenle, in vitro seçme basınçları ile geri kazanılan virüs stokunun doğasını eğriltme riskini ortadan kaldırır, in vitro replikasyon kapasitesi daha doğru bir şekilde değerlendirilmesi için sağlar. İkincisi, bu yöntem bir alt tip B türetilmiş omurgası içine alt tip C gag-yanlısı dizileri birleştirilmesini gerektirir ve analiz içine omurga uyumsuzluk önyargıları tanıtmak olabilir. Bu sınırlamalar nedeniyle, dizilerin sayıda oluşan herhangi bir muhtemel yanlılığı üstesinden gelmek için analiz edilmelidir. Burada alternatif bir deneysel bir yaklaşımı açıklamakalt tip C, akut olarak enfekte olmuş bireylerdeki türetilen sekansları üzerinde çalışmaya uygun ACH. Bu alt tip C Proviral omurgasına MJ4 olarak HIV-1 alt tip C enfekte bireylerin akut enfeksiyon zaman noktalarında elde edilen gag geninin katılması, bir kısıtlayıcı enzim bazlı klonlama stratejisi kullanın. Gag genleri klonlamak için ortak bir omurga olarak MJ4 kullanılması alt tipi C türetilmiş sekansların analizi için çok önemlidir. MJ4 nedeniyle omurga ve gag geni arasındaki alt tipi uyumsuzluk önyargı tanıtmak için daha az muhtemel olacağını, böylece primer izolat 38 türetilmiştir edilir ve. Proviral 293T hücreleri doğrudan transfekte edilmesi gereken yapıların ve klonlanmış gag dizisi ile aynı olan bir klonal virüs stokunun geri kazanımı için Buna ek olarak, kısıtlama enzim bazlı klonlama bölgesinin bir yaklaşım sağlar. Aşağıda sunulan yöntem türetilmiş Gag-MJ4 alt tip C çoğaltma kapasitesini değerlendirmek için yüksek verimli bir yöntemdirsimerik virüslerin. 293T hücreleri içine transfeksiyonu basittir ve virüsün geri üç gün sürer. In vitro replikasyon kapasitesi. Brockman et al tarafından oluşturulan aynı CEM-CCR5 göre T-hücresi hattında 37 tahlil, ancak başarılı bir çoğaltma için gerekli olan önemli değişiklikler protokolü kullanarak alt tip C MJ4 simerik virüslerin. PBMC&#39;ler daha çok, uygun bir T-hücresi çizgisinin kullanımı, yüksek tahlil üretilebilirliğine ile test edilecek olan alt tip C MJ4-simerik virüslerin çok sayıda sağlar. Son olarak, üstte yüzen madde içindeki virüs miktarının tayini için bir radyo-etiketli ters transkriptaz deneyi kullanılarak ticari olarak temin edilebilen ELISA kitleri kullanılarak P24 den daha düşük maliyetlidir. Ayrıca, aynı tahlilde, hem zayıf ve son derece kopyalayan virüs tespit etmek ve suşlar arasında çoğaltma ince farklar tespit edilmesi için önemli olan bir yüksek dinamik aralık verir. Sonuç olarak, burada sunulan yöntem için izin verdiHIV-1 alt tip C türetilen öğürme dizilerinin çoğaltma kapasitesi derinlemesine çalışma akut Zambiya bireylerin enfekte ve yazılı olarak, ayrıca C popülasyonları enfekte diğer subtipini incelemek için genişletilmiş olabilir. Farklı Gag izolatlar arasında çoğaltma kapasitelerde varyasyon yüksek derecede gözlenmiştir. Ayrıca, üç yıllık bir süre üzerinde 39 CD4 + düşüş iletilen Gag çoğaltma kapasitesine ve set noktası viral yük arasındaki yanı sıra ile istatistiksel bir ilişki göstermek için başardık. Bu sonuçlar, bu tür çoğaltma kapasitesi nasıl bulaşan viral özellikleri, çalışmanın önemini vurgulamak, erken enfeksiyon sırasında patogenezi etkilemeye konak bağışıklık sistemi ile etkileşim ve etkin bir aşı müdahaleleri gibi tedaviler geliştirilmesinde ayrılmaz olacaktır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">PCR Reaktifleri</td></tr><tr><td>GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz</td></tr><tr><td>giderme MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'</td><td>IDT DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz için3</td></tr><tr><td>: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCA 3'IDT</td> <td>DNA</td><td>Özel Oligo</td><td>25 nmol, standart tuz giderme</td></tr><tr><td>CoolRack PCR 96 XT</td><td>Biocision</td><td>BCS-529</td><td></td></tr><tr><td>CoolRack M15</td><td>Biocision</td><td>BCS-125</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Fisher</td><td>SH30538FS</td><td>Hyclone</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Kiti</td><td>tarafından üretilmiştir Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>Simport PCR 8 Şerit Tüpler, Mavi (Düz Kapak)</td> <td>Daigger</td><td>EF3647BX</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III tek adımlı RT-PCR sistemi</td><td>Yaşam Teknolojileri/Invitrogen</td><td>12574035</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Sıcak başlangıç II DNA polimeraz</td><td>Fisher</td><td>F-549L</td><td></td></tr><tr><td>PCR Nükleotid </td><td>Roche</td><td>4638956001</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz, yüksek jel mukavemeti</td><td>Fisher</td><td>50-213-128</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9869</td><td></td></tr><tr><td>Promega 1 kb DNA merdiveni</td><td>Fisher</td><td>PRG5711</td><td>Promega Sybr tarafından üretilmiştir</td></tr><tr><td>Güvenli DNA Jel Boyası, 10.000x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Sihirbaz SV Jel ve PCR Temizleme Sistemi</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş bıçakları, tek kenarlı</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td>Cerrahi Tasarım</td></tr><tr><td>Thermocycler tarafından üretilmiştir, PTC-200</td><td>MJ Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Mikrobiyoloji & Klonlama Reaktifleri</güçlü></td></tr><tr><td>LB Ağar, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LB Et Suyu, Lennox</td><td>Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Steril 100 x 15 mm polistiren Petri kapları</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14 ml Polipropilen yuvarlak tabanlı tüpler</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>352059</tr><tr><td>NgoMIV kısıtlama endonükleazı</td><td>New England BioLabs</td><td>R0564L</td><td></td></tr><tr><td>BclI kısıtlama endonükleazı</td><td>New England BioLabs</td><td>R0160L</td><td></td></tr><tr><td>HpaI kısıtlama endonükleazı</td><td>New England BioLabs</td><td>R0105L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz, 5 U/&mu; l</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td></td></tr><tr><td>JM109 yetkin hücreler, >108 cfu/&mu; g</td><td>Promega</td><td>L2001</td><td></td></tr><tr><td>PureYield plazmid miniprep sistemi</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>Güvenli Görüntüleyici 2.0 Mavi Işık Transilluminator</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofüj 18 santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Hücre Kültürü Reaktifleri</td></tr><tr><td>Amphyl temizleyici/dezenfektan</td><td>Fisher</td><td>22-030-394</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD, 1 ml</td><td>VWR</td><td>PAE2311</td><td>Promega</td></tr><tr><td>Heksadimetrin bromür (Polibren)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Costar Plakaları, 6 kuyulu, düz</td><td>Fisher</td><td>07-200-83</td><td>Corning Life tarafından üretilmiştir</td></tr><tr><td>Costar Plakaları, 24 kuyulu, düz</td><td>Fisher</td><td>07-200-84</td><td>Corning Life</td></tr> <tr>tarafından üretilmiştir<td>Costar Plakaları, 96 kuyulu, yuvarlak</td><td>Fisher</td><td>07-200-95</td><td>Corning Life</td></tr><tr><td>Şişeleri tarafından üretilmiştir, Corning filtre üstü/eğimli boyun, 75 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-37</td><td></td></tr><tr><td>Şişeler, Corning filtre üstü/eğimli boyun, 150 cm2</td><td>Fisher</td><td>10-126-34</td><td>Corning Life tarafından üretilmiştir</td></tr><tr><td>Konik Tüpler, 50 ml, mavi kapaklı</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td>BD Biosciences tarafından üretilmiştir</td></tr><tr><td>Konik Tüpler, 15 ml, mavi kapaklı</td><td>Fisher</td><td>14-959-70C</td><td>BD Biosciences tarafından üretilmiştir</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CI</td><td>Mediatech</td></tr><tr><td>RPMI, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin/Glutamin, 100x</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS, magnezyum ve kalsiyum içeren, 500 ml</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS magnezyum ve kalsiyum içermeyen</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Sarstedt tüpleri, çeşitli renkler</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.996</td><td></td></tr><tr><td>Rezervuar Tepsileri Çok kanallı, 55 ml</td><td>Fisher</td><td>13-681-501</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Dextran</td><td>Fisher</td><td>NC9691007</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 iyi berrak V alt doku kültürü ile tedavi edilmiş mikroplaka</td><td>Fisher</td><td>07-200-96</td><td>Corning Life</td></tr><tr><td>HEPES tarafından üretilmiştir, 1 M Tampon Çözelti</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS, Tanımlı, 500 ml</td><td>Fisher</td><td>SH30070 03</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>VWR</td><td>PAV3941</td><td>Promega Glutaraldehyde tarafından üretilmiştir</td></tr><tr><td>, Grade II, H2O içinde %25</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1 M Magnezyum klorür çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler biyoloji için formaldehit çözeltisi, %36,5</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hekzasiyanoferrat(II) trihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387-100G</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hekzasiyanoferrat(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8131-100G</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15-R santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>TC10 otomatik hücre sayacı</td><td>Bio-Rad</td><td>1450001</td><td></td></tr><tr><td>VistaVision ters mikroskop</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Ters Transkriptaz Miktar Tayini Test Reaktifleri</td></tr><tr><td>dTTP, [&alpha;-33P]- 3000 Ci / mmol, 10 mCi / ml, 1 mCi</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEG605H001MC</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-Cl, pH 8.0</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15568025</td><td>KOH 2 M ile pH 7.8'e ayarlanmalıdır</td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>AM9640G</td><td>Ayarlayın 1 M çözeltiye</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Roche</td><td>11333941103</td><td></td></tr><tr><td>Poliadenlik asit (Poli rA) potasyum tuzu&nbsp;</td><td>Midland Reaktif A.Ş.</td><td>P-3001</td><td></td></tr><tr><td>Oligo d (T) primer</td><td>Yaşam Teknolojileri / Invitrogen</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>Ditiyotreitol (DTT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>SR, Süper Çözünürlüklü Fosfor Ekran, Küçük</td><td>Perkin-Elmer</td><td>7001485</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Thermowell 96 kuyulu plaka modeli (M) Polikarbonat</td><td>Fisher</td><td>07-200-245</td><td>Corning Life tarafından üretilmiştir</td>.</tr><tr><td>Corning 96 kuyulu Mikroplaka Alüminyum Sızdırmazlık Bandı, Steril</td><td>Olmayan Fisher</td><td>07-200-684</td><td>Corning Life</td></tr><tr><td>tarafından üretilmiştir DE-81 anyon değişim kağıdı</td><td>Whatman</td><td>3658-915</td><td></td></tr><tr><td>Trisodyum sitrat dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Fisher</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Otoradyografi kaseti</td><td>Fisher</td><td>FB-CA-810</td><td></td></tr><tr><td>Siklon depolama fosfat ekranı</td><td>Packard</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bir kısıtlama enzim temelli klonlama yöntemi değerlendirin<em&gt; in vitro</em&gt; hiv-1 tipi c gag-mj4 kimerik virüslerin Çoğaltma kapasitesi

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Birçok HLA sınıf I alelinin HIV-1 patogenezi ve hastalığın ilerlemesi üzerindeki koruyucu etkisi, kısmen, HIV-1 genomunun zorlukla kaçan korunmuş kısımlarını hedefleme yeteneklerine atfedilir. Hücresel bağışıklık basıncına atfedilen dizi değişiklikleri, enfeksiyon sırasında genom boyunca ortaya çıkar ve Gag gibi genomun korunmuş bölgelerinde bulunursa, virüsün in vitro olarak çoğalma yeteneğini etkileyebilir. Gag'daki HLA'ya bağlı polimorfizmlerin HLA uyumsuz alıcılara iletilmesi, azaltılmış ayar noktası viral yükleri ile ilişkilendirilmiştir. Bunun, virüsün replikasyon kapasitesinin azalmasından kaynaklanabileceğini varsaydık. Burada, HIV-1'in in vitro replikasyonunu, alt tip C ile enfekte Zambiyalılardan akut zaman noktalarından izole edilen gag geninden etkilendiği şekilde değerlendirmek için yeni bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, gag genini ortak bir alt tip C HIV-1 proviral omurga olan MJ4'e yerleştirmek için kısıtlama enzimi bazlı klonlamayı kullanır. Bu, kronik olarak türetilmiş gag-pro dizilerinin in vitro replikasyonunu değerlendiren önceki rekombinasyon tabanlı yöntemlerden ziyade alt tip C dizilerinin incelenmesine daha uygun hale getirir. Bununla birlikte, protokol diğer alt tiplerden virüslerin çalışmaları için kolayca değiştirilebilir. Ayrıca, bu protokol, Gag-MJ4 kimerik virüslerinin CEM tabanlı bir T hücre hattı üzerindeki replikasyon kapasitesini değerlendirmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntemi detaylandırır. Bu yöntem, akut olarak enfekte olmuş 149 alt tip C Zambiyalıdan türetilen Gag-MJ4 kimerik virüslerinin incelenmesi için kullanıldı ve Gag'da replikasyonu etkileyen kalıntıların tanımlanmasına izin verdi. Daha da önemlisi, bu tekniğin uygulanması, viral replikasyonun, ayar noktası viral yükü ve uzunlamasına CD4+ T hücresi düşüşü gibi erken HIV-1 patogenezinin parametrelerini nasıl tanımladığının daha derin bir şekilde anlaşılmasını kolaylaştırmıştır.

Düzgün tam fonksiyonel, bulaşıcı Gag-MJ4 şimeralar montaj yeteneğine sahip bir proviral plazmid oluşturur bu protokolü, yürütmek amacıyla, büyük bakım uygun PCR amplıkonları oluşturmak için alınmalıdır. PCR uygun büyüklükte öğürme Amplikon&#39;u üretti olmadığının saptanması önemlidir. Ürünler, şekil 1A&#39;da gösterilen yaklaşık olarak 1700 bp&#39;lik bir amplikon, 100 baz çifti (bp) içinde olmalıdır. Bu fragmanın tam uzunluğu, çalışma kapsamında gag geni bağlı olarak değişecektir. Da...

HIV-1 patogenezi hem viral özellikler hem de konak genetik faktörleri ile tanımlanır. Burada, gag gen dizisi varyasyonunun virüsün in vitro replikasyon kapasitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için tekrarlanabilir ölçümlere izin veren sağlam bir yöntemi açıklıyoruz.

Bir Kısıtlama Enzim Temelli Klonlama Yöntemi değerlendirin<em&gt; In vitro</em&gt; HIV-1 Tipi C Gag-MJ4 Kimerik Virüslerin Çoğaltma Kapasitesi

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Bu prosedürün genel amacı, gag sekans polimorfizmlerinin in vitro HIV1 replikasyon kapasitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için, alt tip-C HIV1 enfekte bireylerden türetilen gag genlerini replikasyon yeteneğine sahip bir HIV1 plazmidine dahil etmektir. Bu işlem, öncelikle hastanın plazmasından gag geninin amplifiye edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hastadan türetilen gag sekansının replikasyon yeteneğine sahip enfeksiyöz moleküler klon MJ-four içerisine klonlanmasıdır. Ardından, enfeksiyöz viral stoklar oluşturmak için gag-MJ-four kimera plazmidi transfekte edilir ve bir indikatör hücre hattı üzerindeki enfektiviteyi değerlendirmek için titresi belirlenir. Son adım, GXR-25 T-hücre hattında in vitro replikasyon kapasitesini ölçmektir. Nihayetinde, viral replikasyon kinetiğini görselleştirmek amacıyla, zaman içindeki virion üretimini nicelleştirmek için radyoaktif işaretli bir ters transkriptaz analizi kullanılır.Bugün açıklayacağımız yöntem, HIV alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bunlar arasında HIV replikasyon uygunluğunun belirleyicilerinin tanımlanması ve HIV uygunluğunun uzun vadeli patogenezi nasıl etkilediğinin anlaşılması yer almaktadır. Yöntemleri bugün, lisansüstü öğrencilerimden ikisi olan Jessica Prince ve Dan Claiborne anlatacak.Bu prosedüre başlamak için, tek aşamalı bir RT-PCR ile ters transkriptaz ve termostabil bir DNA polimeraz kullanarak RNA'dan cDNA'ya ters transkripsiyon yapın ve ilk tur DNA ürünlerini amplifiye edin. Ardından, ilk tur PCR amplifikasyonundan 1 µL'yi DNA şablonu olarak kullanarak, iç içe (nested) ikinci tur bir PCR amplifikasyonu gerçekleştirin. Sonrasında, ikinci tur reaksiyon hacminin 5 µL'sine 3 µL 5X yükleme boyası ekleyin.Bantlar ayrılana kadar, UV floresan DNA boyası içeren %1'lik agaroz TAE jelinde 120 volt değerinde çalıştırın. Ardından, 1.6 KB bantları mavi ışık illuminatöründe görselleştirin. Bundan sonra, kalan 45 µL reaksiyon hacmini DNA boyası içeren %1'lik agaroz TAE jelinde çalıştırın. Uygun bantları temiz bir jiletle kesin ve birey başına üç pozitif reaksiyonu birleştirin. Ardından, bir jel saflaştırma kiti kullanarak jel diliminden DNA'yı ekstrakte edin ve nükleaz içermeyen su ile elüe edin. Ürünü, daha sonra kullanmak üzere -20 °C'de dondurun. 0:15:56 Bu prosedürde, MJ-four plazmidinin uzun terminal tekrar (LTR) 5' UTR bölgesini amplifiye ettikten sonra, 1.3 KB PCR ürünlerini illuminatörde görselleştirin. Pozitif amplikonları kesin, ardından daha önce açıklandığı gibi saflaştırın ve dondurun. Sonra, splice overlap extension PCR yoluyla füzyon MJ-four LTR gag amplikonlarını oluşturun. 3.2 kb uzunluğundaki amplikonu görselleştirin, kesin, saflaştırın ve dondurun. Şimdi, 1.5 µg MJ-four plazmidini ve 1.5 µg saflaştırılmış LTR-gag PCR ürününü, BCL-one restriksiyon endonükleazı ile 50 °C'de 1.5 saat boyunca digeste edin. Ardından, digestiyon reaksiyonuna 1 µL NGOM-four ekleyin ve 37 °C'de bir saat inkübe edin. Bundan sonra, restriksiyon digestiyon reaksiyonlarına 5x yükleme boyası ekleyin. Toplam hacmi, DNA boyası içeren %1'lik agaroz TAE jelinde 100 volt değerinde bir ila iki saat boyunca yavaşça elektroforez yapın. Klonlama için belirtilen bantları, daha önce açıklandığı gibi görselleştirin, kesin ve saflaştırın.Ardından, saflaştırılmış LTR-gag inserti ile MJ-four vektör DNA'sını üçe bir insert-vektör oranında kullanarak ligasyon reaksiyonlarını hazırlayın. Ligasyon reaksiyonlarını dört °C'de gece boyunca inkübe edin.Ardından, ligasyon ürünlerini mililitre başına 100 µg Ampisilin içeren LB agar plaklarına yayarak kimyasal olarak kompetan JM-109 bakterilerini transforme edin. Transforme edilmiş bakterileri 30 °C'de en az 22 saat boyunca büyütün. Klonlama doğruluğunu teyit etmek için, mini prep DNA'yı NGOM-four ve HPA-one restriksiyon enzimleri ile 37 °C'de iki saat boyunca çift sindirime tabi tutarak kesin.Ardından, %1'lik agaroz TAE jelinde analiz edin. 0,05 enfeksiyon çokluğu ile 5×10⁵ GXR-25 hücresini enfekte etmek için, TZM-BL hücre deneyi ile belirlenen mikrolitre başına IU titresi bazında her bir stoktan gereken virüs hacmini hesaplayın. Tam önlük, yüz maskesi ve çift eldiven dahil olmak üzere, replikasyon yeteneği olan HIV ile çalışmak için uygun kişisel koruyucu ekipman kullandığınızdan emin olun. Enfeksiyon gününde, virüs stoklarını -80 °C dondurucudan çıkarın ve çözdürün. Daha sonra, 0,05 MOI değerine ulaşmak için virüsü C-R-P-M-I besiyerinde 100 µL hacme seyreltin. Bunu, her replikasyon deney seti içerisinde hem pozitif hem de negatif kontrol olacak şekilde V-tabanlı doku kültürüle işlenmiş 96 kuyucuklu plakaya ekleyin ve kuyucuklar arası çapraz kontaminasyonu sınırlamak için her iki sütundan birinin boş kalacağı şekilde plağı düzenleyin. Ardından, otomatik bir hücre sayıcı kullanarak GXR-25 hücrelerini sayın ve tüm enfeksiyonlar için toplamda gereken hücre sayısını hesaplayın. Gerekli hacmi 50 mL'lik konik bir tüpe paylaştırın ve hücreleri çöktürmek için santrifüjleyin. Daha sonra besiyerini dikkatlice aspire edin ve 100 µL başına 5×10⁵ hücre konsantrasyonunda C-R-P-M-I içerisinde yeniden süspanse edin. Hücreleri steril bir hazneye pipetleyin ve iyice karıştırın. Ardından çok kanallı bir pipet kullanarak, seyreltilmiş virüs içeren 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 100 µL hücre ekleyin ve iyice karıştırın. Bundan sonra, her kuyucuğa 2 µL 5 mg/mL'lik polibren çözeltisi ekleyin ve hücreleri iyice karıştırın. Ardından %5 CO2 içeren bir doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin.Enfekte hücreleri yıkamak için, hücrelerin çöktürülmesini sağlamak amacıyla 96 kuyucuklu V tabanlı plakayı santrifüjleyin. Ardından, hücre peletini bozmadan ortamdan dikkatlice 150 µL sıvı alın ve yerine taze 150 µL C-R-P-M-I ekleyin. Hücreleri yeterince yıkamak için bu işlemi iki kez daha tekrarlayın. Son santrifüjden ve 150 µL C-R-P-M-I eklemesinden sonra, hücre peletini çok kanallı bir pipetle yeniden süspande edin. Her kuyucuktaki karışımı, 24 kuyucuklu bir doku kültürü plağının kuyucuğundaki 800 µL C-R-P-M-I içerisine ekleyin. Ardından plağı, 37 °C'deki %5CO2'li bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Her iki günde bir, kültür kuyucuğunun yüzeyinden 100 µL süpernatan alarak 96 kuyucuklu U tabanlı bir plağın kuyucuğuna aktarın ve RT analizi ile yapılacak sonraki incelemeler için dondurun. Daha sonra, hücreleri iyice yeniden süspande edin ve hücrelerin aşırı büyümesini önlemek için kalan hacmin yarısını uzaklaştırın. Ardından, her kuyucuğa 550 µL taze C-R-P-M-I ekleyerek orijinal hacmi geri kazandırın.Bu prosedürde, RT ana karışımının her 1 mL'lik alikotuna 10 mCi/mL DTTP'den bir ila iki µL ve 1 M DTT'den dört µL ekleyin. RT ana karışımı, DTT ve DTTP içeren her bir 1,5 mL'lik mikro santrifüj tüpünü 1000 µL'lik bir pipetle dikkatlice karıştırın ve steril bir hazneye aktarın.Ardından, 96 kuyucuklu ince duvarlı bir PCR plakasına her kuyucuğa 25 µL işaretli RT karışımı dağıtın. RT master mix içeren PCR plakasına her bir süpernatanttan 5 µL ekleyin. Daha sonra PCR plakasını yapışkan folyo kapakla kapatın ve bir termosikletörde 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, 200 µL çok kanallı pipet kullanarak folyo kapakta küçük delikler açın. Örnekleri beş kez karıştırın. Her bir örnekten 5 µL'yi DE-81 kağıdına aktarın ve tüm örneklerin 10 dakika boyunca havada kurumasına izin verin. Blotları ayrı yıkama kaplarına yerleştirin. Ardından blotları 1X SSC ile beş kez yıkayın. Daha sonra, havada kurumaya bırakmadan önce her yıkama için beş dakika boyunca %90 etanol ile iki kez yıkayın. Kuruduktan sonra, blotu dikkatlice Saran wrap ile sarın ve oda sıcaklığında, sıkıca kapatılmış bir kaset içinde gece boyunca fosfor ekrana maruz bırakın.Hazır olduğunda, fosfor ekranları bir fosfor görüntüleyici ile analiz edin ve radyoaktif transkriptleri nicelendirin.Gösterilmiştir. Burada, MJ-four plazmit omurgasına klonlanabilir hasta kaynaklı bir gag amplikonu oluşturmak için gerekli olan çeşitli PCR amplikonlarının elektroforetik ayrımını betimleyen temsili jel görüntüleri yer almaktadır. Bu temsili jel görüntüsü, hasta gag genlerinin MJ four'a klonlanması için gerçekleştirilen restriksiyon sindirimlerinin elektroforetik ayrımını betimlemektedir.Bu temsili jel görüntüsü, saflaştırılmış bir gag MJ-dört kimera plazmit DNA'sının restriksiyon sindirimlerinin elektroforetik ayrımını göstermektedir. Bu grafik, GXR-25 hücre hattında replikasyon analizinin zaman içindeki tekrarlanabilirliğini göstermektedir. Yaklaşık bir yıl arayla gerçekleştirilen iki bağımsız deneyde GXR-25 hücrelerini enfekte etmek için aynı gag MJ dört kimera virüsleri kullanılmıştır.Replikasyon skorları, logaritmik olarak dönüştürülmüş DLU değerlerinin eğimi hesaplanarak ve bu eğimin vahşi tip MJ-four'a normalize edilmesiyle oluşturulmuştur. İki bağımsız ölçüm güçlü bir korelasyon göstermekte olup, farklı zamanlarda ve farklı pasajdaki hücrelerle gerçekleştirilen analizlerin tekrarlanabilirliğini vurgulamaktadır. Bu teknik, HIV AIDS alanındaki araştırmacıların, dünya çapında en yaygın alt tip olan akut alt tip C enfeksiyonunda patogenezin viral belirleyicilerini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Replikasyon yeteneği olan HIV ile çalışmak son derece tehlikeli olabilir. Canlı virüs içeren tüm adımlar, BSL iki artı tesisinde gerçekleştirilmelidir. Tüm yüzeyler düzenli olarak dekontamine edilmeli ve her zaman çift eldiven giyilmelidir.

a-restriction-enzyme-based-cloning-method-to-assess-vitro-replication

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu görüntülenmiştir deney canlı konfokal görüntüleme deneyleri için HIV floresan moleküler klon kullanan için bir rehber.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

Heterokaryon Oluşumu İki Yöntemleri HCV Sınırlayıcı Etkenler Discover

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Viral yüzey antijenleri konformasyonlarını anlamak, antikor nötralizasyonunu değerlendirmek ve etkili aşı immünojenlerinin tasarımına rehberlik etmek için gereklidir. Burada, spesifik anti-Env antikorları tarafından transfekte edilmiş hücrelerin yüzeyinde eksprese edilen trimerik HIV-1 Env'nin tanınmasının çalışmasına izin veren hücre bazlı bir ELISA testini açıklıyoruz.

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

Neredeyse izojenik virüsler arasındaki büyüme rekabeti, göreceli replikasyon uygunluğunu belirlemek için hassas bir ölçüm sağlar. Burada açıklanan protokoller, rekombinant HIV-1 klonlarının oluşturulmasını, virüs yayılımını ve büyüme rekabetini ve hassas ve tutarlı sonuçlar elde etmek için optimize edilmiş analiz yöntemlerini içerir.

İnsan İmmün Yetmezlik Virüs çoğaltma Fitness belirlenmesi için İkili Büyüme Rekabet Analizi

Burada, Japon ensefalit virüsünün pozitif sarmallı genomik RNA'sının tam uzunlukta bir cDNA'sını içeren bulaşıcı bir bakteriyel yapay kromozom oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, diğer pozitif sarmallı RNA virüslerinin işlevsel bir cDNA'sını oluşturmak için kullanılabilir, bu da onu virüs biyolojisini incelemek için güçlü bir genomik araç haline getirir.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından algılanabilir yeşil flüoresan proteinin ifade bildirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklar. İnhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılabilir.

Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

Biz yeni tüp bebek modelleri üretimi için seçili genomik sitelerdeki proviral tümleştirme özetlemek HIV-1 enfeksiyonu için genom mühendislik iş akışı mevcut. HIV kaynaklı gazetecilere hedefleme CRISPR-Cas9-aracılı, siteye özgü genom manipülasyon tarafından yönetilir. Detaylı iletişim kuralları tek hücreli klon üretimi, tarama ve doğru hedefleme doğrulama için sağlanan.

HIV-1 enfeksiyonu seçili Proviral tümleştirme siteleri ile Jurkat muhabir modelleri oluşturmak için CRISPR-Cas9-esaslı genom mühendislik

Burada yeni doğmakta olan 3'-termini tarafsız bir belirlenmesi yanı sıra tek iplikçikli DNA moleküllerinin mutational profilleri sağlar bir derin sıralama yaklaşım mevcut. Ana uygulama doğmakta olan retroviral tamamlayıcı DNA'lar (cDNAs), retroviral Ters transkripsiyon işlemi sırasında oluşturulan ara ürün karakterizasyonudur.

Ters transkripsiyon enfekte hücreleri içinde belirleyici 3'-Termini ve HIV-1 sırasında doğmakta olan tek iplikçikli Viral DNA moleküllerinin dizileri

HIV verimli yeniden etkinleştirme işlev değerlendirmesi ve gizli proviruses boşluk için yüksek aktarım protokolü açıklanan ve müdahaleler HIV transkripsiyon üzerinde etkisini test ve yapıştırma uygulanır. Soldan sağa dayalı transkripsiyon ajanlara geri ve yapıştırma gecikme etkisi temsilcisi sonuçları sağlanır.

Vitro değerlendirme HIV transkripsiyon ve yapıştırma ajanları geri gecikme süresi yüksek işlem hacmi

Burada, özellikle HIV-1 enfeksiyonuna vurgu yaparak, endoplazmik retikulum (ER) stresini ve katlanmamış protein yanıtı (UPR) aktivasyonunu belirlemek için bazı yerleşik yöntemleri açıklıyoruz. Bu makalede ayrıca ER stresi/UPR'nin HIV-1 replikasyonu ve virion enfektivitesi üzerindeki etkisini araştırmak için bir dizi protokol açıklanmaktadır.

HIV-1 ile Enfekte T Hücrelerinde Endoplazmik Retikulum Stresi ve Katlanmamış Protein Yanıtının Ölçülmesi ve HIV-1 Replikasyonundaki Rolünün İncelenmesi

Öğrenin, kısıtlama enzim temelli klonlama yöntemiyle HIV-1 Gag-MJ4 kimerik virüslerin in vitro çoğaltma kapasitesini nasıl değerlendireceğinizi. Bu teknik, viral patogenez ve replikasyon kinetiği çalışmaları için güvenilir sonuçlar sunar.

Bir Kısıtlama Enzim Temelli Klonlama Yöntemi değerlendirin

Daha fazla video keşfet