Lokal ve sistemik Yer de patojen kaynaklı kronik enflamasyon Fare Modeli

Aşağıdaki protokolün genel amacı, mikrobiyal enfeksiyonun kronik inflamasyon üzerindeki etkilerini in vivo olarak fizyolojik olarak ilgili bir hayvan modeli kullanarak incelemektir. Bu, lokal ve sistemik kronik inflamasyonu indüklemek için farelerin porphyromonas gingivalis ile oral yoldan enfekte edilmesiyle elde edilir. MRG daha sonra canlı hayvanlarda sistemik inflamasyonun ilerlemesini ölçmek için kullanılabilirken, lokal inflamatuar kemik kaybı mikro BT ile değerlendirilir ve aterosklerotik plaklar kurban sonrası yüz lipid boyaması ile görüntülenebilir.

Sonuç olarak, P gingivalis ile enfekte fareler ve enfekte olmayan kontroller arasındaki alveolar kemik hacmindeki farklılıklar ve aterosklerotik plakların birikimi, sırasıyla mikro BT analizine ve yüz lipid boyamasına dayalı olarak ölçülebilir. Hayvan modelimizin en büyük avantajı, kronik inflamasyonda ve özellikle enfeksiyondan uzak bölgelerde yer alan hem konakçı hem de patojenik mekanizmaları incelemenize izin vermesidir. Böylece, transgenik fareler ve tanımlanmış bakteriyel mutantlar kullanarak yerel enfeksiyon bölgelerinin yanı sıra sistemik bölgelere de bakabilirsiniz.

Bu model, hastalığa katkıda bulunan konak ve mikrobiyal faktörler gibi patogenezin temel yönlerini tanımlamaya yardımcı olabilir. Bu yöntem, inflamatuar kemik kaybı ve aterosklerozda yer alan spesifik konak ve patojen mekanizmaları hakkında bilgi sağlayabilse de, romatoid artrit, diyabet ve kanser dahil olmak üzere diğer fare hastalık modelleri için de uyarlanabilir. Bu, Boston Üniversitesi için yüksek alan MRI çekirdek tesisidir ve doktora sonrası arkadaşım Ning, fare görüntülemenin yönlerini gösterecek: Şeftali gingivalis 3 81'in donmuş saplarını anaerobik kan agar plakalarına çizerek başlayın ve plakaları 37 santigrat derecede anaerobik bir odada inkübe edin.

Üç ila beş gün sonra, beş mililitre sıvı beyin kalp infüzyon suyu veya BHI kültürünü aşılamak için plakada yetiştirilen organizmaları kullanın. Gece boyunca büyümenin ardından, kültürleri 45 mililitre BHI'ye aktarın ve kültürleri anaerobik olarak 18 ila 24 saat daha inkübe edin. Orta log fazında, bakterileri 7.000 GS ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüjleme ile hasat edin ve daha sonra peleti 50 mililitre PBS Resus'ta üç kez yıkadıktan sonra serolojik bir pipet ile beş mililitre PBS'de iyice yeniden süspanse edin, PBS'deki pelet, kültürün bir ila 10 seyreltilmesi 660 nanometrede 1.0'lık bir optik yoğunluğa sahip olacak şekilde.

Ardından, ağırlıkça %2'lik bir çözelti elde etmek için yeterli orta viskoziteli karboksi metil selülozu çıkarın ve topaklanmayı önlemek için girdap yaparken karbox etil selülozu bakteri süspansiyonuna yavaşça ekleyin. C iki'de inflamasyonun ilerlemesini ölçmek için. İlk olarak, farenin kafası sırtüstü pozisyonda olacak şekilde bir hayvan tutucuyu 30 milimetrelik dikey bir proba ve 11.7 TMRI tarayıcının dikey deliğine yerleştirin.

Sallanma ve şimleme işlemlerinden sonra, eksenel koronal ve sagital görüntüler oluşturmak için üç ortogonal yönelim boyunca izci görüntüleri elde etmek için nadir bir dizi kullanın. Daha sonra, elde edilen görüntülerin hedef bölgede olduğunu doğrulamak için düşük çözünürlüklü manyetik rezonans anjiyografi kullandıktan sonra, aşağıdaki parametreleri kullanarak innomin arterin yüksek çözünürlüklü manyetik rezonans anjiyografisini unatsız bir 3D gradyan eko dizisi ile gerçekleştirin. 1,5 santimetre döşeme kalınlığı, 45 derecelik bir çevirme açısı, 20 milisaniyelik bir tekrarlama süresi, 2,2 milisaniyelik bir yankı süresi, 1,5 x 1,5 x 1,5 santimetre görüş alanı, 1 28 x 1 28 x 1 28'lik bir matris ve yaklaşık 22 dakikalık toplam tarama süresi için ortalama dört sayısı.

Ardından, ROI analizi için subklavyen bifurkasyonun 0,3 ila 0,5 milimetre altındaki mezhep arterin eksenel bir görüntüsünü seçin Aortu sabitlemek için, dokuyu her zaman PBS'de kapalı tutun. Aortu anatomik pozisyonda, aortun ampulleri solda olacak şekilde döşeyerek başlayın. Daha sonra geçici mnuchin pimlerini aşağıdaki beş yere art arda yerleştirin: aortun üst kısmı kemerin üçüncü dalının altında, inen aortun ortasına, inen aortun alt ucuna yakın ve femoral arterin dalının üstüne.

Daha sonra, aortun sol tarafını femoral arterin sol dalından başlayarak çıkan aortun en alt dalının altına kadar kesmek için ekstra ince yaylı makas kullanın. Ardından, iç yüzeyini ortaya çıkarmak için her dalı kesip iğneledikten sonra dokuyu iğnelemeye devam edin. Tüm iç yüzey açıkta kalır ve yukarıdan net bir şekilde görülebilir ve pimlerden görsel parazit yoktur.

Lipitleri boyamak ve lezyonları ölçmek için, sabitlenmiş aortu taze hazırlanmış Sudan dört veya yağ kırmızısı O çözeltisi ile kaplayarak başlayın. 50 dakika sonra, dokuyu bir ila beş dakika boyunca% 70 izopropanol ile yıkayın ve ardından dokudan çıkan su artık kırmızı olmayana kadar aortu çift damıtılmış suyla nazikçe durulayın. Ardından, aortu PBS ile örtün ve görüntü kalibrasyonuna yardımcı olması için dokunun yanına bir cetvel yerleştirin.

Ardından, diseksiyon mikroskobuna bağlı yüksek çözünürlüklü kamera ile dokunun görüntülerini yakalayın ve görüntüleri TIFF dosyaları olarak kaydedin. Son olarak, görüntü analiz yazılımında, alanını belirlemek için her bir intimal yüzeyi manuel olarak izleyin. Ardından, otomatik renk eşiklemesi kullanarak lezyon alanını hesaplamak için, lezyonları normal alanlardan ayıran bir renk yoğunluğu tanımlamak üzere her görüntü için bir eşik ayarlayın.

Aterosklerotik lezyonların kapladığı intimal yüzeyin yüzdesi daha sonra p gingivalis ile enfekte farelerle yapılan bu temsili deneyde hesaplanabilir. Hacimsel analiz, enfekte farelerin, enfekte olmayan kontrollere kıyasla önemli kemik kaybı sergilediğini ortaya koydu. Yeniden yapılandırılmış Hemi maksillanın görsel muayenesi, ateroskleroza eğilimli bir kontrol sistemine kıyasla, enfekte farelerde azı dişi köklerin açıkta kalan yüzey alanında bir artışı göstermektedir.

POE eksikliği olan bir fare. P gingivalis, son enfeksiyonu takip eden 24 saat gibi kısa bir sürede aort sinüsü ve aday bir arter içinde alveolar kemik kaybına ve inflamatuar plak birikimine neden olan kronik bir inflamasyona neden olur ve bu temsili görüntülerde olduğu gibi enfeksiyon sonrası çeşitli zaman noktalarında seri in vivo, MRG ile canlı farelerde izlenebilir. Sudan'da ayrıca dört lekeli aortun yüz ölçümleri, p gingivalis enfeksiyonunun intimal yüzeyde lipid birikimini ve lezyonel alanları önemli ölçüde artırdığını göstermektedir.

Ek olarak, aort sinüs lezyonlarının immünohistokimyasal analizi, mikrofaj infiltrasyonunun arttığını ve doğuştan gelen immün reseptör toll benzeri reseptör iki IV ile enfekte farenin yüksek ekspresyonunu ortaya koymaktadır. Bu prosedürü denerken, iltihabın değerlendirildiği deneysel süre zaman noktalarının hastalığın ilerlemesi ile uygun şekilde uyumlu olması gerektiğini göz önünde bulundurmak önemlidir. Başkalarının MR görüntülemesinden sonra, global aterosklerotik yük veya lezyonun hücresel bileşenleri gibi ek soruları yanıtlamak için yüz ayakta durma veya immün histo kimyası gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, kronik inflamasyonda yer alan hem konakçı hem de patojenik faktörleri incelemenize olanak tanıyan bir in vivo fare modelini iyi anlamış olmalısınız. Patojenlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken KKD'nin uygun kullanımı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.