Biyomedikal Araştırma Sığır Akciğer: Görme Kılavuzlu Bronkoskopi, intrabronşiyal Aşılama ve

Aşağıdaki deneyin genel amacı, solunum yolu enfeksiyonunun sığır modelinde konakçı-patojen etkileşimlerini incelemektir. Bu, hastalık seyri boyunca ilgili patojenin intrabronşiyal inokülasyonu ile buzağılarda solunum yolu enfeksiyonu indüklenerek gerçekleştirilir. Hayvandan bronkoalveoler lavaj yoluyla tekrarlayan örnekler alınır.

Ardından, sırasıyla epitel hücrelerini ve alveol veya akciğer doku örneklerini elde etmek için bronşiyal fırçalama ve transbronşiyal akciğer biyopsileri yapılır. Sonuç olarak, patojene özgü solunum yolu hastalığı; örneğin lavajdaki inflamatuar değişiklikler, sitoloji ve patojenin immünohistokimyasal tespiti ile doğrulanabilir. Transbronşiyal akciğer biyopsilerinde, bu büyük hayvan modelinin diğer mevcut hayvan modellerine ve kemirgenlere kıyasla temel avantajı, modelimizde tekrarlanan örneklemeler yoluyla aynı bireyde hastalığın seyrini uzun bir süre boyunca inceleyebilmemizdir.

Bu yöntem, konakçı-patojen etkileşimleri hakkında in vivo bilgi sağlayabilse de, alternatif patojenler veya konakçı türler gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Anestezinin sürdürülmesi ve örnekleme sürecine yardımcı olan kişi, laboratuvarımızın veteriner hekimi olan Fisher olacaktır. İşleme başlamadan önce, üç şırıngayı sırasıyla bir, iki ve beş mililitre inokülum ile doldurun.

Ardından anestezi onaylandıktan sonra, hayvanın dilini dışarı çekin ve boynunu gerin. Sonrasında, hafif döndürme hareketleri kullanarak metal bir spekulumu hayvanın ağzına yerleştirin. Larinks görünür olana kadar, bir el feneri yardımıyla alanı kontrol ederek spekulumu ileriye doğru itin.

Ardından, bir endoskopun çalışma kanalına bir Teflon tüp yerleştirin. Tüp, endoskopun ucundan dışarı taşmamalıdır. Endoskobu spekulüm aracılığıyla yerleştirin.

Endoskopun yerleştirilmesini sağlamak için spekulümde küçük ayarlamalar yapılması gerekebilir. Larinksi geçmek için, monitördeki görüntünün hizalanmasına yardımcı olmak amacıyla akciğerin sağ tarafına dallanan bronkus trake'yi kullanın. Ardından, beş mililitre inokülum içeren şırıngayı Teflon tüpün ucuna takın.

Tüpü, inokülümün yerleştirileceği dallara doğru yönlendirin ve uygun miktarda inokülüm uygulayın. Ardından, bir mililitre inokülüm içeren şırıngayı tüpe takın. Bronş trakealarına ilerleyin ve inokülümü kodla dalına yerleştirin.

Endoskopu ve spekulumu çıkarın. Ardından, son şırıngayı bir aktüatöre takın ve her bir burun deliğine bir mililitre inokülüm püskürtün. Hayvanı, uyanması için yüzüstü pozisyonda tekrar bölmesine yerleştirin.

İyileşme ahırında klima bulunmalıdır. Genel anestezi altında hayvanın termoregülasyon yeteneği azaldığından, örnekleme için istenen zaman noktasında valv örnekleri toplamak amacıyla, her biri 20 mililitre steril izotonik salin içeren beş şırıngayı 38 °C'lik bir su banyosunda ısıtın. Ardından, endoskopun çalışma kanalına bir lavaj kateteri yerleştirin ve endoskopu metal spekuluma yerleştirin.

Ardından, kama pozisyonuna ulaşılana ve endoskop daha fazla ileri itilemeyene kadar sol akciğerin ana bronşuna doğru ilerleyin. Sonra, sıvıyı instill etmek ve doğrudan aspire etmek için sıcak sodyum klorür çözeltisi içeren şırıngaları sırayla lavaj kateterine takın.

Alveoler makrofajların cam yüzeye yapışmasını önlemek için, bronkoalveoler lavaj sıvısını geri kazanım işleminin hemen ardından buz üzerinde silikonize cam şişelerde saklayın. Hem verilen serum fizyolojik miktarını hem de geri kazanılan sıvı miktarını not edin. Ardından, epitel hücrelerini toplamak için lavaj kateterini çalışma kanalından çıkarın.

Ardından, endoskobu istenen örnekleme konumuna yönlendirin. Örneğin, bu deneyde trake bifurkasyonuna; endoskop yerleştiğinde, bir bronş fırçasını tüp ile kaplayın ve fırça ucu monitörde görünene kadar endoskopun çalışma kanalına yerleştirin. Fırçayı ve plastik tüpü yaklaşık beş santimetre ileriye doğru itin.

Ardından, fırçayı plastik tüpten çıkarmak için fırça sapını itin. Fırça konumlandığında, onu fırçalanacak bölgeye yönlendirin. Daha sonra, endoskopu yönlendirirken fırçayı nazikçe ileri geri itip çekin.

Epitel hücrelerini sıyırmak için fırçanın bronş duvarıyla temas ettiğinden emin olun. Kanama meydana geldiğinde sıyırma işlemini durdurun. Ardından fırçayı tüp ile kapatın ve çalışma kanalından dışarı çekin.

Epitel hücre kaplı kılları beş mikroskop lamına kadar nazikçe yuvarlayın ve yaymaları soğuk metanol içinde 10 dakika boyunca fikse edin. Ardından, lamların havada kurumasına izin verdikten sonra, transbronşiyal akciğer biyopsisi gerçekleştirmek üzere bunları minus 20 degrees Celsius'da saklayın. Sonrasında, endoskopu istenen örnekleme konumuna yönlendirin.

Örneğin, bu deneydeki LOAs crans'ın pars Alis'i için, biyopsi forceps'ini çalışma kanalına yerleştirmeden önce, düzgün çalıştığından emin olmak için birkaç kez açıp kapatın ve ardından forceps'i hafif bir direnç hissedene kadar bronkus trakeasının coddle dalına doğru itin. Şimdi, iki ila üç santimetre geri çekin ve forceps'i açın. Forceps'i tekrar yaklaşık iki santimetre ileri itin ve ardından kapatın.

Penseti çalışma kanalından geri çekerek çıkarın. Dokuyu biyopsi pensetinden dikkatlice çıkarmak için bir iğne kullanın ve otolitik süreçlerin oluşumunu önlemek için uygun bir tespit ortamında saklayın. Son olarak, buzağının bölmesinde dinlenmesine izin verdikten sonra, yem ve taze su sağlayarak hayvanı önümüzdeki 24 saat boyunca pnömotoraks açısından tekrar izleyin.

Hayvan tamamen bilincini geri kazandığında, transbronşiyal akciğer biyopsilerinin dondurulmuş kesitleri immünohistokimyasal olarak boyanabilir. İnoküle edilen patojeni görselleştirmek için, örneklemeden dört gün önce klamidya C ile inoküle edilmiş olan bu hayvanın akciğerindeki kahverengi klamidyal inklüzyonları dikkate alın. İmmünohistokimyasal boyama, lavaj hücrelerinin boyanmasını sağlayarak hücre içi patojenlerin görselleştirilmesine olanak tanır.

Örneğin bu görüntüde, bir buzağıdan alınan alveolar makrofajlarda mevcut olan klamidya inklüzyonları görülmektedir. İntrabronşiyal klamidya inokülasyonundan dokuz gün sonra CTAC gözlemlenebilir. Bronkoalveolar lavaj hücreleri, sitolojik boyama ile ayırt edilebilir.

Alveoler makrofajlar, lavaj sıvısındaki baskın hücre tipidir. Bununla birlikte, enflamatuar süreçler mevcut olduğunda nötrofilik granülositlerin sayısı artar. Usul bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde inokülasyon 10 ila 15 dakika, örnekleme ise 20 ila 30 dakika içinde tamamlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, anestezi altındaki hayvanlarda intrabronşiyal inokülasyonun nasıl yapılacağı ile bronkoalveoler lavaj sıvısı, bronşiyal fırçalama örnekleri ve transbronşiyal akciğer biyopsilerinin nasıl alınacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.