Bölünme Fragmentlerin Algılama ile Akım Ölçümleri birleştiren tarafından Epitel Sodyum Kanalı (ENaC) proteolitik Aktivasyonunun gösteri

Aşağıdaki deneyin genel amacı, Xenopus laevis oositlerinde heterolog olarak eksprese edilen epitelyal sodyum kanalı veya ENaC üzerindeki proteazların etkisini incelemektir. Bu, öncelikle bir oositte amilorid duyarlı tüm hücre akımının ölçülmesiyle gerçekleştirilir. Oositin toparlanmasına izin verildikten sonra, proteaza maruz bırakılır ve akım tekrar ölçülür.

Ardından, paralel olarak oositler biyotinillenir ve hücre yüzeyindeki gamma ENaC parçalanma fragmanlarının ortaya çıkışını izlemek için western blotting işlemine tabi tutulur; iki elektrotlu voltaj klemp tekniği ile biyotin yaklaşımının kombinasyonuna dayalı olarak, kanal parçalanması ile kanal aktivasyonu arasında nedensel bir bağlantı olduğunu gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, plansız ölçüm gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, oositin iki ölçüm arasında, küçük bir test çözeltisi hacminde çeşitli süreler boyunca proteaz veya diğer farmakolojik ajanlara maruz bırakılabilmesidir. Xenopus laevis oositlerinin izole edilmesinden ve metot protokolüne göre cRNA enjeksiyonunun yapılmasından iki gün sonra, yerçekimi ile beslenen bir perfüzyon sisteminin bir şırıngasını doldurmak için ND 96 ve ikinci bir şırıngayı doldurmak için amid içeren ND 96 kullanın.

Şırıngaları banyo haznesinin 50 santimetre üzerine monte ettikten sonra, 150 watt'lık bir halojen soğuk ışık kaynağını açın ve binoküler mikroskop ile iyi bir görselleştirme sağlamak için ışık kaynağını oosit banyo haznesinin 10 santimetre üzerine ayarlayın; ardından vakumu açın ve vakum tüpünü oosit banyo haznesindeki süperfüzyon tüpü adaptörünün karşısına yerleştirin. Sonrasında, IV yerçekimi akış kontrol cihazını kullanarak her bir solüsyonun süperfüzyon hızını dakikada üç ila beş mililitreye ayarlayın. Ardından, bir mikropipet polar çekme cam kılcal tüpler kullanarak bir mikrometreden küçük uç çapları elde edin ve süperfüzyon tüplerini bir adaptör aracılığıyla oosit banyo haznesine bağlayın.

Ardından, bunları yaklaşık dörtte bir oranında doldurmak için üç molar potasyum klorür kullanın. Kılcalları akım ve voltaj elektrotlarının elektrot tutucularına yerleştirin ve mikro manipülatörleri kullanarak bunları iki mikromolar Amid çözeltisi içeren ND 96 içine yerleştirin. Amid duyarlı tüm hücre akımlarını ölçmek için, öncelikle voltaj elektrodunun elektrot potansiyelini sıfırlamak için VM offset düğmesini ve akım elektrodunu sıfırlamak için VE offset düğmesini ayarlayarak başlayın.

Bir UO bölgesini banyo haznesine ve voltaj algılama elektroduna yakın bir konuma yerleştirin. Ardından, her iki mikro elektrodu kullanarak UO bölgesini nazikçe delin, amplifikatör tutma potansiyelini -60 mV olarak ayarlayın ve grafik kaydediciyi açın. Sonrasında, amid içeren çözeltiyi açın.

Ardından kayda başlayın ve gerekirse kazancı (gain) ayarlayın. Ölçülen akım kararlı bir platoya ulaştıktan sonra, amid içermeyen çözeltiye geçin. Akım platosuna ulaşıldığında, perfüzyonu tekrar amid içeren çözeltiye döndürün. Daha sonra, UO bölgesindeki akım başlangıçtaki bazal akım seviyesine ulaştığında, voltaj kenetlemeyi (voltage clamp) kapatın ve plazma membranının giriş bölgelerinde yeniden mühürlenmesini sağlamak için elektrotları nazikçe geri çekin.

UOC bölgesini, proteaz içermeyen ND 96 çözeltisinden 100 ila 150 µL içeren 96 kuyucuklu plakanın bir kuyucuğuna, UOC bölgesini proteaz içeren bir çözeltiye veya proteaz içermeyen bir kontrol çözeltisine aktarmadan önce beş dakika boyunca yerleştirin. İnkübasyondan sonraki 30 dakika boyunca güncel ölçümü tekrarlayın, stereo mikroskop altında kusurlu oositleri ayıklayın ve uygun proteaz ile ve proteazsız anti 96 hazırlayın. Oositlerin zarar görmesini önlemek için uçlarını kısa süreliğine alevle sterilize ederek ve etiketleyerek past pipetleri hazırlayın.

Altı kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğunu 2,5 milliliters oda sıcaklığındaki ND 96 veya proteaz içeren ND 96 ile doldurun. Ardından her kuyucuğa 30 oosit ekleyin ve bunları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Yeni bir altı kuyucuklu plakanın kuyucuklarına 2,5 milliliters ND 96 ekledikten sonra, her bir oosit grubunu ND 96 ile doldurulmuş bir kuyucuğa aktarın.

Kalan proteazları yıkamak için oositleri sırasıyla ND 96 içeren iki ek kuyucuğa aktarın ve son kuyucukta beş dakika inkübe edin; metin protokolüne uygun olarak biotin elüsyon tamponu içinde biotin hazırlayın. Her oosit grubunu 2,5 ml biotin elüsyon tamponu içeren bir kuyucuğa yerleştirdikten sonra, hafif ajitasyonla 15 dakika inkübe edin. Ardından, biotin reaksiyonunu durdurmak için her oosit grubunu 2,5 ml sönümleme tamponu içeren bir kuyucuğa yerleştirdikten sonra, onları ikinci bir sönümleme tamponu kuyucuğuna aktarın ve beş dakika inkübe edin.

Hafifçe çalkalayarak, her bir oosit grubunu 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş bir mililitre liziz tamponu kullanarak, hücreleri 27 gauge bir iğneden geçirerek liziz edin. Lizatlari 1500 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı, TRITTON X 100 ve MP 40 içeren yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve tüpleri buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. Proteinleri çözmek için tüpleri tekrar tekrar vorteksledikten sonra, oosit grubu başına 100 µL vagaro boncuğunu dengeleyerek protein deterjan çözeltilerine ekleyin ve örnekleri dört °C'de, baş üstü rotasyonla gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, örnekleri 1500 ×g hızda üç dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, hücre yüzeyindeki act parçalanma fragmanlarını tespit etmek için süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. İki X SDS-PAGE örnek tamponu eklemeden önce, boncukları üç kez yıkamak için lizis tamponu kullanarak jel örneklerini hazırlayın. Örnekleri 20.000 ×g hızda üç dakika santrifüjledikten sonra, süpernatanı yeni mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin.

Serin proteaz plazminin ENaC aracılı akımları aktive edip edemeyeceğini araştırmak için örnekleri metin protokolüne uygun olarak western blot ile analiz edin. ENaC eksprese eden tekil sitlerin delta IE değerleri, sitlerin proteaz içermeyen veya plazmin içeren solüsyonda 30 dakikalık inkübasyonundan önce ve sonra belirlenmiştir. Burada gösterildiği gibi iki elektrotlu voltaj klemp tekniği kullanılarak yapılan ölçümlerde, plazmine maruz bırakmanın ölçülen her sitte delta IE'yi artırdığı görülmüştür.

Buna karşılık, proteaz içermeyen çözeltide inkübasyonun etkisi ihmal edilebilir düzeydeydi. Bu şekil, chymotrypsin'in yabani tip ENaC üzerindeki etkisi ile mutasyona uğramış prostasin ve plazmin kesim bölgelerine sahip ENaC üzerindeki etkisini karşılaştırmaktadır. Burada görüldüğü üzere, mutant kanal, chymotrypsin tarafından aracılık edilen ENaC akımının aktivasyonunu geciktirmekte ve azaltmaktadır.

Ayrıca, vahşi tip ENaC'e kıyasla daha düşük bir oranda bir kesim fragmanı oluşturur. Bu videoyu izledikten sonra, açıklanan yöntemlerin kombinasyonunun, proteazların iç oluşum üzerindeki stimülatör etkisini hücre yüzeyindeki kesim ürünlerinin oluşumuyla ilişkilendirmek için nasıl kullanılabileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu durum, örneğin diğer iyon kanallarının, taşıyıcıların veya transmembran reseptörlerinin düzenlenmesine ilişkin benzer soruları ele almak için geniş bir uygulama alanı için yararlı olabilir.