Fare Genotipleme
Genotipleme, belirli bir organizmanın genomunda spesifik DNA dizilerinin varlığının veya yokluğunun tespit edilmesi sürecidir.
Genler farenin fenotipini etkileyebildiğinden, bireysel bir farenin genetik yapısını veya "genotipini" inceleyebilmek, bir fenotipi belirli bir gene atfetmek için kritik öneme sahiptir. Bu video fare genetiğini keşfedecek, genotipleme prosedürünün temel adımlarını gösterecek ve PCR tabanlı genotipleme sonuçlarının nasıl yorumlanacağını açıklayacaktır.
Araştırmacıların fareleri genotiplerken nelere dikkat ettiklerini anlamak için, fare genetiğinde yaygın olarak kullanılan bazı manipülasyonları gözden geçirelim.
Bir geni incelemek için bilim insanları, genellikle genin genetik dizilimini değiştirerek işlevini bozarlar. Ancak fareler diploidtir, dolayısıyla herhangi bir genin iki kopyasına sahiptirler. Çoğu genin işlev göstermesi için tek bir normal kopya yeterli olduğundan, fenotip çalışılmadan önce her iki geni de bozulmuş bir hayvan üretmek için farelerin çiftleştirilmesi gerekir.
Bu genotipe “homozigot nakavt” veya yaygın olarak kısaca “nakavt” denir. Buna karşılık, iki fonksiyonel kopyaya sahip normal bir fareye “homozigot yabanı tip” veya sadece “yabanı tip” denir. Son olarak, yalnızca bir fonksiyonel kopyaya sahip olan fareler “heterozigot” veya “het” olarak adlandırılır.
Genetik materyali uzaklaştırmak yerine, bazı deneyler fare genomuna DNA dizilerinin eklenmesini gerektirir. Bu eklenen DNA fragmanlarına “transgen” denir ve bunları taşıyan fareler “transgenik” olarak adlandırılır. Farelere en yaygın olarak eklenen “transgen”, deniz anasından elde edilen yeşil floresan proteinin (GFP) ekspresyonunu sağlayan transgendir. GFP üretimini yönlendirmek için dokuya özgü bir promotör (bir genin aktivitesini “teşvik eden” düzenleyici bir dizi) kullanılarak, belirli bir doku tipindeki hücreler yeşil floresan ile kolayca tanımlanabilir.
Birçok genetik değişikliğin GFP ekspresyonu gibi kolayca gözlemlenebilir bir fenotipe yol açmaması nedeniyle, deneylerde hangi spesifik hayvanın kullanılması gerektiğini belirlemek için farelerin genotiplendirilmesi gerekir. Genotiplendirme öncesinde, fareler daha sonra tekrar tanımlanabilmeleri için dikkatlice etiketlenmelidir. Hayır, bundan daha kalıcı bir şeye ihtiyacınız olacak. Yaygın bir yöntem, kulaklara, çentiklerin konumunun ve sayısının bir kimlik numarasına karşılık geleceği şekilde çentikler atmaktır.
Fare etiketlendikten sonra, DNA ekstraksiyonu için küçük bir doku parçası (genellikle jilet veya makas kullanarak kuyruktan 2 — 5 mm) toplayın. Birden fazla fareden doku topluyorsanız, örneklerinizde çapraz kontaminasyona yol açabilecek aynı bölümü bir sonraki hayvanda kullanmamak için jiletin kullanılan kısımlarını işaretleyin.
Genetik materyalin dokunun diğer bileşenlerinden ayrılma işlemini başlatmak için, örnek proteinaz K enzimi içeren lizis tamponunda sindirilir. Bir gecelik sindirimin ardından, kılları ve diğer sindirilmemiş materyalleri çöktürmek için örnek santrifüj edilir. Sindirilmiş lizattan DNA'yı izole etmek için basit ve etkili bir yöntem, nükleik asitleri çöktürmek amacıyla alkol eklemektir. Kısa bir inkübasyon sonrası, DNA'yı bir pelet halinde toplamak için örnek tekrar santrifüj edilir.
Fazla tuzları uzaklaştırmak için %70 etanol ile yıkandıktan sonra, DNA peleti su veya tampon içerisinde yeniden süspanse edilir ve genotiplendirme için hazır hale gelir.
Farelerinizde belirli bir DNA dizisinin mevcut olup olmadığını belirlemek için birçok strateji vardır. Bunların çoğu, öncelikle polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR kullanarak ilgili genetik bölgeyi amplifiye etmenizi gerektirir. PCR kurulumu hakkında daha fazla bilgi için lütfen JoVE Science Education “Guide to PCR” içeriğine göz atın.
Genotipleri ayırt etmenin bir yolu, PCR ile amplifiye edilen fragmanın boyutundaki değişiklikleri tespit etmektir. Diyelim ki 700 baz çiftlik bir genetik insersiyona sahip fareleri tarıyorsunuz. PCR sonrası, yaban tip (wildtype) bantları 200 baz çift, transgen bantları ise 900 baz çift olmalıdır.
PCR işlemini gerçekleştirdikten sonra, fragmanlarınızın boyutlarını ayırt edebilmek için reaksiyon ürünlerini uygun yüzdeli bir agaroz jelde ayırın. Yaban tip kontrolü sadece 200 baz çiftlik yaban tip bandına sahip olmalı; transgenik kontrol sadece 900 baz çiftlik tek bir transgen bandına sahip olmalı ve het kontrolü her iki banda da sahip olmalıdır. Son olarak, reaktiflerin herhangi bir kontamine DNA içermediğinden emin olmak için bir “kalıp yok” (no template) kontrolü eklenir ve bu nedenle herhangi bir bant oluşturmamalıdır.
Kontrollerin beklendiği gibi çalıştığından emin olduğumuza göre, bilinmeyen fareleri kontrol edelim. Fare 1 ve 2'nin her biri sadece tek bir yaban tip bandına sahip olduğundan, bunlar homozigot yaban tiptir. Fare 4 ve 6'nın her biri sadece tek bir transgen bandına sahiptir ve bu nedenle homozigot transgeniktirler.
Fare 3 ve 5'in ise her biri iki banda sahiptir ve bu nedenle hetlerdir.
Son olarak, istediğiniz genotipe sahip fareleri bulmak için geri döndüğünüzde, kulak çentiği paternini farenin kimlik numarasıyla eşleştirmeniz yeterlidir.
Genotiplemenin ne olduğunu ve nasıl yapıldığını anladıktan sonra, neden yararlı olduğuna dair bazı örneklere bakalım.
Bazı durumlarda, istenen fenotipi elde etmek için daha karmaşık genetik modifikasyonlar gerekir. Örneğin, farelerdeki bu cilt kanseri modelini oluşturmak için iki transgen gereklidir. Bunlardan biri, indüklenebilir bir “onkogen” veya kansere neden olabilen bir gen taşır; ikincisi ise sadece cilt hücrelerinde ifade edilen ve onkogen transkripsiyonunu engelleyen bir diziyi keserek onkogen ekspresyonuna izin veren Cre rekombinaz enzimini taşır. Her iki transgene de sahip yavrular üretmek için, her biri için heterozigot olan fareler çiftleştirilir. Ardından, istenen yavruları belirlemek için genotipleme kullanılır.
Bazen deneyden önce farelerin genotiplemesi mümkün olmayabilir. Örneğin, embriyonik kalp hızıyla ilgili bu çalışmada, embriyoların davranışlarını bozmadan genotipleme için doku toplamak mümkün değildir. Bu nedenle, önce anne içindeki embriyo konumları dikkatlice işaretlenir, ardından ultrason ölçümleri kaydedilir. Son olarak, genotipin kalp hızı üzerindeki etkisini belirlemek için kuyruk biyopsileri alınır.
Bu video bir DNA ekstraksiyon yöntemini göstermiştir, ancak birçok varyasyon mevcuttur. Örneğin, Direct PCR sistemi beş dakikadan daha kısa süren bir doku sindirimi gerektirir. Ayrıca, sindirilmemiş materyal çöktürüldükten sonra süpernatant PCR için hazırdır ve böylece DNA saflaştırma ihtiyacı ortadan kalkar.
Farelerin genotiplemesine yönelik JoVE kılavuzunu izlediniz. Bu videoda, fare genetiğinin temellerini, fare DNA örneklerinin nasıl hazırlanacağını ve analiz edileceğini ve bu tekniğin bazı pratik uygulamalarını inceledik. İzlediğiniz için teşekkürler!
İnsan genomu 10 yılı aşkın bir süre önce haritalandırılmış olsa da, bilim insanları hâlâ her bir insan geninin işlevini anlama yolunda katedilmesi ger…
Genotipleme, belirli bir organizmanın genomunda spesifik DNA dizilerinin varlığının veya yokluğunun tespit edilmesi sürecidir.
Genler farenin fenotipini etkileyebildiğinden, bireysel bir farenin genetik yapısını veya "genotipini" inceleyebilmek, bir fenotipi belirli bir gene atfetmek için kritik öneme sahiptir. Bu video fare genetiğini keşfedecek, genotipleme prosedürünün temel adımlarını gösterecek ve PCR tabanlı genotipleme sonuçlarının nasıl yorumlanacağını açıklayacaktır.
Araştırmacıların fareleri genotiplerken nelere dikkat ettiklerini anlamak için, fare genetiğinde yaygın olarak kullanılan bazı manipülasyonları gözden geçirelim.
Bir geni incelemek için bilim insanları, genellikle genin genetik dizilimini değiştirerek işlevini bozarlar.Ancak fareler diploidtir, dolayısıyla herhangi bir genin iki kopyasına sahiptirler. Çoğu genin işlev göstermesi için tek bir normal kopya yeterli olduğundan, fenotip çalışılmadan önce her iki geni de bozulmuş bir hayvan üretmek için farelerin çiftleştirilmesi gerekir.
Bu genotipe “homozigot nakavt” veya yaygın olarak kısaca “nakavt” denir. Buna karşılık, iki fonksiyonel kopyaya sahip normal bir fareye “homozigot yabanı tip” veya sadece “yabanı tip” denir. Son olarak, yalnızca bir fonksiyonel kopyaya sahip olan fareler “heterozigot” veya “het” olarak adlandırılır.
Genetik materyali uzaklaştırmak yerine, bazı deneyler fare genomuna DNA dizilerinin eklenmesini gerektirir. Bu eklenen DNA fragmanlarına “transgen” denir ve bunları taşıyan fareler “transgenik” olarak adlandırılır. Farelere en yaygın olarak eklenen “transgen”, deniz anasından elde edilen yeşil floresan proteinin (GFP) ekspresyonunu sağlayan transgendir. GFP üretimini yönlendirmek için dokuya özgü bir promotör (bir genin aktivitesini “teşvik eden” düzenleyici bir dizi) kullanılarak, belirli bir doku tipindeki hücreler yeşil floresan ile kolayca tanımlanabilir.
Birçok genetik değişikliğin GFP ekspresyonu gibi kolayca gözlemlenebilir bir fenotipe yol açmaması nedeniyle, deneylerde hangi spesifik hayvanın kullanılması gerektiğini belirlemek için farelerin genotiplendirilmesi gerekir. Genotiplendirme öncesinde, fareler daha sonra tekrar tanımlanabilmeleri için dikkatlice etiketlenmelidir. Hayır, bundan daha kalıcı bir şeye ihtiyacınız olacak. Yaygın bir yöntem, kulaklara, çentiklerin konumunun ve sayısının bir kimlik numarasına karşılık geleceği şekilde çentikler atmaktır.
Fare etiketlendikten sonra, DNA ekstraksiyonu için küçük bir doku parçası (genellikle jilet veya makas kullanarak kuyruktan 2 — 5 mm) toplayın. Birden fazla fareden doku topluyorsanız, örneklerinizde çapraz kontaminasyona yol açabilecek aynı bölümü bir sonraki hayvanda kullanmamak için jiletin kullanılan kısımlarını işaretleyin.
Genetik materyalin dokunun diğer bileşenlerinden ayrılma işlemini başlatmak için, örnek proteinaz K enzimi içeren lizis tamponunda sindirilir. Bir gecelik sindirimin ardından, kılları ve diğer sindirilmemiş materyalleri çöktürmek için örnek santrifüj edilir. Sindirilmiş lizattan DNA'yı izole etmek için basit ve etkili bir yöntem, nükleik asitleri çöktürmek amacıyla alkol eklemektir. Kısa bir inkübasyon sonrası, DNA'yı bir pelet halinde toplamak için örnek tekrar santrifüj edilir.
Fazla tuzları uzaklaştırmak için %70 etanol ile yıkandıktan sonra, DNA peleti su veya tampon içerisinde yeniden süspanse edilir ve genotiplendirme için hazır hale gelir.
Farelerinizde belirli bir DNA dizisinin mevcut olup olmadığını belirlemek için birçok strateji vardır. Bunların çoğu, öncelikle polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR kullanarak ilgili genetik bölgeyi amplifiye etmenizi gerektirir. PCR kurulumu hakkında daha fazla bilgi için lütfen JoVE Science Education “Guide to PCR” içeriğine göz atın.
Genotipleri ayırt etmenin bir yolu, PCR ile amplifiye edilen fragmanın boyutundaki değişiklikleri tespit etmektir. Diyelim ki 700 baz çiftlik bir genetik insersiyona sahip fareleri tarıyorsunuz. PCR sonrası, yaban tip (wildtype) bantları 200 baz çift, transgen bantları ise 900 baz çift olmalıdır.
PCR işlemini gerçekleştirdikten sonra, fragmanlarınızın boyutlarını ayırt edebilmek için reaksiyon ürünlerini uygun yüzdeli bir agaroz jelde ayırın. Yaban tip kontrolü sadece 200 baz çiftlik yaban tip bandına sahip olmalı; transgenik kontrol sadece 900 baz çiftlik tek bir transgen bandına sahip olmalı ve het kontrolü her iki banda da sahip olmalıdır. Son olarak, reaktiflerin herhangi bir kontamine DNA içermediğinden emin olmak için bir “kalıp yok” (no template) kontrolü eklenir ve bu nedenle herhangi bir bant oluşturmamalıdır.
Kontrollerin beklendiği gibi çalıştığından emin olduğumuza göre, bilinmeyen fareleri kontrol edelim. Fare 1 ve 2'nin her biri sadece tek bir yaban tip bandına sahip olduğundan, bunlar homozigot yaban tiptir. Fare 4 ve 6'nın her biri sadece tek bir transgen bandına sahiptir ve bu nedenle homozigot transgeniktirler.
Fare 3 ve 5'in ise her biri iki banda sahiptir ve bu nedenle hetlerdir.
Son olarak, istediğiniz genotipe sahip fareleri bulmak için geri döndüğünüzde, kulak çentiği paternini farenin kimlik numarasıyla eşleştirmeniz yeterlidir.
Genotiplemenin ne olduğunu ve nasıl yapıldığını anladıktan sonra, neden yararlı olduğuna dair bazı örneklere bakalım.
Bazı durumlarda, istenen fenotipi elde etmek için daha karmaşık genetik modifikasyonlar gerekir. Örneğin, farelerdeki bu cilt kanseri modelini oluşturmak için iki transgen gereklidir. Bunlardan biri, indüklenebilir bir “onkogen” veya kansere neden olabilen bir gen taşır; ikincisi ise sadece cilt hücrelerinde ifade edilen ve onkogen transkripsiyonunu engelleyen bir diziyi keserek onkogen ekspresyonuna izin veren Cre rekombinaz enzimini taşır. Her iki transgene de sahip yavrular üretmek için, her biri için heterozigot olan fareler çiftleştirilir. Ardından, istenen yavruları belirlemek için genotipleme kullanılır.
Bazen deneyden önce farelerin genotiplemesi mümkün olmayabilir. Örneğin, embriyonik kalp hızıyla ilgili bu çalışmada, embriyoların davranışlarını bozmadan genotipleme için doku toplamak mümkün değildir. Bu nedenle, önce anne içindeki embriyo konumları dikkatlice işaretlenir, ardından ultrason ölçümleri kaydedilir. Son olarak, genotipin kalp hızı üzerindeki etkisini belirlemek için kuyruk biyopsileri alınır.
Bu video bir DNA ekstraksiyon yöntemini göstermiştir, ancak birçok varyasyon mevcuttur. Örneğin, Direct PCR sistemi beş dakikadan daha kısa süren bir doku sindirimi gerektirir. Ayrıca, sindirilmemiş materyal çöktürüldükten sonra süpernatant PCR için hazırdır ve böylece DNA saflaştırma ihtiyacı ortadan kalkar.
Farelerin genotiplemesine yönelik JoVE kılavuzunu izlediniz. Bu videoda, fare genetiğinin temellerini, fare DNA örneklerinin nasıl hazırlanacağını ve analiz edileceğini ve bu tekniğin bazı pratik uygulamalarını inceledik. İzlediğiniz için teşekkürler!
Genotipleme, belirli bir organizmanın genomunda spesifik DNA dizilerinin varlığının veya yokluğunun tespit edilmesi sürecidir.
Genler farenin fenotipini etkileyebildiğinden, bireysel bir farenin genetik yapısını veya "genotipini" inceleyebilmek, bir fenotipi belirli bir gene atfetmek için kritik öneme sahiptir. Bu video fare genetiğini keşfedecek, genotipleme prosedürünün temel adımlarını gösterecek ve PCR tabanlı genotipleme sonuçlarının nasıl yorumlanacağını açıklayacaktır.
Araştırmacıların fareleri genotiplerken nelere dikkat ettiklerini anlamak için, fare genetiğinde yaygın olarak kullanılan bazı manipülasyonları gözden geçirelim.
Bir geni incelemek için bilim insanları, genellikle genin genetik dizilimini değiştirerek işlevini bozarlar. Ancak fareler diploidtir, dolayısıyla herhangi bir genin iki kopyasına sahiptirler. Çoğu genin işlev göstermesi için tek bir normal kopya yeterli olduğundan, fenotip çalışılmadan önce her iki geni de bozulmuş bir hayvan üretmek için farelerin çiftleştirilmesi gerekir.
Bu genotipe “homozigot nakavt” veya yaygın olarak kısaca “nakavt” denir. Buna karşılık, iki fonksiyonel kopyaya sahip normal bir fareye “homozigot yabanı tip” veya sadece “yabanı tip” denir. Son olarak, yalnızca bir fonksiyonel kopyaya sahip olan fareler “heterozigot” veya “het” olarak adlandırılır.
Genetik materyali uzaklaştırmak yerine, bazı deneyler fare genomuna DNA dizilerinin eklenmesini gerektirir. Bu eklenen DNA fragmanlarına “transgen” denir ve bunları taşıyan fareler “transgenik” olarak adlandırılır. Farelere en yaygın olarak eklenen “transgen”, deniz anasından elde edilen yeşil floresan proteinin (GFP) ekspresyonunu sağlayan transgendir. GFP üretimini yönlendirmek için dokuya özgü bir promotör (bir genin aktivitesini “teşvik eden” düzenleyici bir dizi) kullanılarak, belirli bir doku tipindeki hücreler yeşil floresan ile kolayca tanımlanabilir.
Birçok genetik değişikliğin GFP ekspresyonu gibi kolayca gözlemlenebilir bir fenotipe yol açmaması nedeniyle, deneylerde hangi spesifik hayvanın kullanılması gerektiğini belirlemek için farelerin genotiplendirilmesi gerekir. Genotiplendirme öncesinde, fareler daha sonra tekrar tanımlanabilmeleri için dikkatlice etiketlenmelidir. Hayır, bundan daha kalıcı bir şeye ihtiyacınız olacak. Yaygın bir yöntem, kulaklara, çentiklerin konumunun ve sayısının bir kimlik numarasına karşılık geleceği şekilde çentikler atmaktır.
Fare etiketlendikten sonra, DNA ekstraksiyonu için küçük bir doku parçası (genellikle jilet veya makas kullanarak kuyruktan 2 — 5 mm) toplayın. Birden fazla fareden doku topluyorsanız, örneklerinizde çapraz kontaminasyona yol açabilecek aynı bölümü bir sonraki hayvanda kullanmamak için jiletin kullanılan kısımlarını işaretleyin.
Genetik materyalin dokunun diğer bileşenlerinden ayrılma işlemini başlatmak için, örnek proteinaz K enzimi içeren lizis tamponunda sindirilir. Bir gecelik sindirimin ardından, kılları ve diğer sindirilmemiş materyalleri çöktürmek için örnek santrifüj edilir. Sindirilmiş lizattan DNA'yı izole etmek için basit ve etkili bir yöntem, nükleik asitleri çöktürmek amacıyla alkol eklemektir. Kısa bir inkübasyon sonrası, DNA'yı bir pelet halinde toplamak için örnek tekrar santrifüj edilir.
Fazla tuzları uzaklaştırmak için %70 etanol ile yıkandıktan sonra, DNA peleti su veya tampon içerisinde yeniden süspanse edilir ve genotiplendirme için hazır hale gelir.
Farelerinizde belirli bir DNA dizisinin mevcut olup olmadığını belirlemek için birçok strateji vardır. Bunların çoğu, öncelikle polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR kullanarak ilgili genetik bölgeyi amplifiye etmenizi gerektirir. PCR kurulumu hakkında daha fazla bilgi için lütfen JoVE Science Education “Guide to PCR” içeriğine göz atın.
Genotipleri ayırt etmenin bir yolu, PCR ile amplifiye edilen fragmanın boyutundaki değişiklikleri tespit etmektir. Diyelim ki 700 baz çiftlik bir genetik insersiyona sahip fareleri tarıyorsunuz. PCR sonrası, yaban tip (wildtype) bantları 200 baz çift, transgen bantları ise 900 baz çift olmalıdır.
PCR işlemini gerçekleştirdikten sonra, fragmanlarınızın boyutlarını ayırt edebilmek için reaksiyon ürünlerini uygun yüzdeli bir agaroz jelde ayırın. Yaban tip kontrolü sadece 200 baz çiftlik yaban tip bandına sahip olmalı; transgenik kontrol sadece 900 baz çiftlik tek bir transgen bandına sahip olmalı ve het kontrolü her iki banda da sahip olmalıdır. Son olarak, reaktiflerin herhangi bir kontamine DNA içermediğinden emin olmak için bir “kalıp yok” (no template) kontrolü eklenir ve bu nedenle herhangi bir bant oluşturmamalıdır.
Kontrollerin beklendiği gibi çalıştığından emin olduğumuza göre, bilinmeyen fareleri kontrol edelim. Fare 1 ve 2'nin her biri sadece tek bir yaban tip bandına sahip olduğundan, bunlar homozigot yaban tiptir. Fare 4 ve 6'nın her biri sadece tek bir transgen bandına sahiptir ve bu nedenle homozigot transgeniktirler.
Fare 3 ve 5'in ise her biri iki banda sahiptir ve bu nedenle hetlerdir.
Son olarak, istediğiniz genotipe sahip fareleri bulmak için geri döndüğünüzde, kulak çentiği paternini farenin kimlik numarasıyla eşleştirmeniz yeterlidir.
Genotiplemenin ne olduğunu ve nasıl yapıldığını anladıktan sonra, neden yararlı olduğuna dair bazı örneklere bakalım.
Bazı durumlarda, istenen fenotipi elde etmek için daha karmaşık genetik modifikasyonlar gerekir. Örneğin, farelerdeki bu cilt kanseri modelini oluşturmak için iki transgen gereklidir. Bunlardan biri, indüklenebilir bir “onkogen” veya kansere neden olabilen bir gen taşır; ikincisi ise sadece cilt hücrelerinde ifade edilen ve onkogen transkripsiyonunu engelleyen bir diziyi keserek onkogen ekspresyonuna izin veren Cre rekombinaz enzimini taşır. Her iki transgene de sahip yavrular üretmek için, her biri için heterozigot olan fareler çiftleştirilir. Ardından, istenen yavruları belirlemek için genotipleme kullanılır.
Bazen deneyden önce farelerin genotiplemesi mümkün olmayabilir. Örneğin, embriyonik kalp hızıyla ilgili bu çalışmada, embriyoların davranışlarını bozmadan genotipleme için doku toplamak mümkün değildir. Bu nedenle, önce anne içindeki embriyo konumları dikkatlice işaretlenir, ardından ultrason ölçümleri kaydedilir. Son olarak, genotipin kalp hızı üzerindeki etkisini belirlemek için kuyruk biyopsileri alınır.
Bu video bir DNA ekstraksiyon yöntemini göstermiştir, ancak birçok varyasyon mevcuttur. Örneğin, Direct PCR sistemi beş dakikadan daha kısa süren bir doku sindirimi gerektirir. Ayrıca, sindirilmemiş materyal çöktürüldükten sonra süpernatant PCR için hazırdır ve böylece DNA saflaştırma ihtiyacı ortadan kalkar.
Farelerin genotiplemesine yönelik JoVE kılavuzunu izlediniz. Bu videoda, fare genetiğinin temellerini, fare DNA örneklerinin nasıl hazırlanacağını ve analiz edileceğini ve bu tekniğin bazı pratik uygulamalarını inceledik. İzlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between homozygous wildtype, heterozygous, and homozygous knockout mice?
Homozygous wildtype mice have two functional gene copies and normal phenotype. Heterozygous mice carry one functional and one disrupted copy. Homozygous knockout mice have both gene copies disrupted, allowing researchers to study the gene's full functional role. These genotypes are critical for understanding how specific genetic changes affect mouse biology and development and reproduction of the laboratory mouse.
Q2: How do you extract DNA from mouse tissue for genotyping?
Collect a small tissue sample (2-5 mm of tail) and digest it overnight in lysis buffer containing proteinase K enzyme. Centrifuge to pellet hair and debris, then add alcohol to precipitate nucleic acids. Centrifuge again to collect the DNA pellet, wash with 70% ethanol to remove salts, and resuspend in water or buffer for genotyping analysis.
Q3: What are transgenic mice and why are they used in research?
Transgenic mice carry inserted DNA fragments called transgenes introduced into their genome. A common transgene drives expression of green fluorescent protein (GFP) from jellyfish using tissue-specific promoters, allowing researchers to easily identify cells from specific tissues by green fluorescence. This enables tracking of gene expression patterns and cellular behavior in living organisms.
Q4: How do you interpret PCR-based genotyping results on an agarose gel?
Compare band patterns to control samples. Wildtype controls show only the wildtype band size; transgenic controls show only the transgene band size; heterozygous controls display both bands. Unknown mice with one wildtype band are homozygous wildtype, one transgene band indicates homozygous transgenic, and two bands indicate heterozygous genotype.
Q5: Why is it important to label mice before genotyping?
Labeling mice with permanent identifiers like ear notches ensures researchers can track individual animals after genotyping and match them to their genetic results. This allows scientists to identify and select mice with desired genotypes for experiments and maintain accurate records across multiple generations of breeding.
Q6: What are some practical applications of mouse genotyping in research?
Genotyping identifies offspring carrying multiple transgenes needed for complex genetic models, such as cancer studies requiring both an oncogene and Cre recombinase. It also enables retrospective analysis when direct embryo sampling is impossible, such as measuring embryonic heart rate while preserving fetal development by collecting tail biopsies after ultrasound measurements.
Q7: What precautions should you take when collecting tissue samples from multiple mice?
Mark used segments of the blade or scissors to prevent cross-contamination between samples. Using the same part of the cutting tool on multiple animals can transfer DNA from one mouse to another, compromising genotyping accuracy and leading to false or ambiguous results in your analysis.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
0:40
Mouse Genetics
2:23
Tissue Collection and DNA Extraction
4:11
Genotyping by PCR
6:08
Applications
8:02
Summary