4.10: Fare Genotiplemesi

Genotipleme, belirli bir organizmanın genomundaki belirli DNA dizilerinin varlığını veya yokluğunu tespit etme işlemidir.

Genler bir farenin fenotipini etkileyebildiğinden, tek bir farenin genetik yapısını veya "genotipini" inceleyebilmek bir fenotipi belirli bir gene atfetmek için kritik öneme sahiptir. Bu videoda fare genetiği keşfedilecek, genotipleme prosedürünün temel adımları gösterilecek ve PCR tabanlı genotipleme sonuçlarının nasıl yorumlanacağı açıklanacaktır.

Araştırmacıların fareleri genotiplediklerinde ne aradıklarını anlamak için, fare genetiğine yönelik bazı yaygın manipülasyonları gözden geçirelim.

Bir geni incelemek için, bilim adamları sıklıkla genetik dizisini değiştirerek işlevini bozarlar. Bununla birlikte, fareler diploiddir, bu nedenle herhangi bir genin iki kopyasına sahiptirler. Çoğu genin işlev görmesi için yalnızca bir normal kopyaya ihtiyaç duyduğundan, fareler, fenotipi incelemeden önce her iki genin de bozulduğu bir hayvan üretmek için yetiştirilmelidir.

Bu genotipe "homozigot nakavt" denir. ya da daha yaygın olarak sadece ?nakavt? kısaca. Tersine, iki işlevsel kopyaya sahip normal bir fareye "homozigot vahşi tip" denir. ya da sadece ?wildtype.? Son olarak, sadece bir işlevsel kopyaya sahip fareler "heterozigot" olarak adlandırılır. veya ?hets.?

Genetik materyali çıkarmak yerine, bazı deneyler DNA dizilerinin fare genomuna sokulmasını gerektirir. Bu eklenen DNA parçalarına "transgenler" denir. ve onları taşıyan fareler ?transgenik'tir. En yaygın ?transgen? farelere sokulan, denizanasından yeşil floresan proteininin veya GFP'nin ekspresyonunu sağlayan bir şeydir. GFP üretimini yönlendirmek için dokuya özgü bir promotör (bir genin aktivitesini ?teşvik eden düzenleyici bir dizi) kullanılarak, belirli bir doku tipinden hücreler yeşil floresan ile kolayca tanımlanabilir.

Birçok genetik değişiklik, GFP ekspresyonu gibi kolayca gözlemlenebilir bir fenotipe yol açmadığından, deneylerde hangi spesifik hayvanın kullanılması gerektiğini belirlemek için farelerin genotiplendirilmesi gerekir. Genotiplemeden önce, fareler daha sonra tekrar tanımlanabilmeleri için dikkatlice etiketlenmelidir. Hayır, bundan daha kalıcı bir şeye ihtiyacınız olacak. Yaygın bir yöntem, çentiklerin konumu ve sayısı bir kimlik numarasına karşılık gelecek şekilde kulakta çentikler yapmaktır.

Fare etiketlendikten sonra, DNA'yı çıkarmak için küçük bir doku parçası (tipik olarak bir tıraş bıçağı veya makas kullanarak 2 ila 5 mm kuyruk) toplayın. Birden fazla fareden doku topluyorsanız, aynı parçayı bir sonraki hayvanda kullanmayacağınızdan emin olmak için bıçağın kullanılmış segmentlerini işaretleyin, bu da numunelerinizde çapraz kontaminasyona yol açabilir.

Genetik materyali dokunun diğer bileşenlerinden ayırma işlemine başlamak için numune, proteinaz K enzimini içeren lizis tamponunda sindirilir. Gece boyunca sindirildikten sonra, numune pelet kılı ve diğer sindirilmemiş materyaller için santrifüjlenir. DNA'yı sindirilmiş lizattan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem, nükleik asitleri çökeltmek için alkol eklemektir. Kısa bir inkübasyondan sonra, DNA'yı bir topak halinde toplamak için numune tekrar santrifüjlenir.

Fazla tuzları uzaklaştırmak için% 70 etanol ile yıkandıktan sonra, DNA peleti su veya tampon içinde yeniden süspanse edilir ve genotipleme için hazır hale gelir.

Farelerinizde belirli bir DNA dizisinin bulunup bulunmadığını belirlemek için birçok strateji vardır. Çoğu, önce polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR kullanarak ilgilenilen genetik bölgeyi büyütmenizi gerektirir. PCR'nin nasıl kurulacağı hakkında daha fazla bilgi için lütfen JoVE Science Education'a göz atın. PCR Kılavuzu.?

Genotipleri ayırt etmenin bir yöntemi, PCR ile çoğaltılmış fragmanın boyutundaki değişiklikleri tespit etmektir. Diyelim ki 700 baz çiftinin genetik olarak eklenmesine sahip fareleri tarıyorsunuz. PCR'den sonra, vahşi tip bantlar 200 baz çiftidir ve transgen bantları 900 baz çifti olmalıdır.

PCR'nizi çalıştırdıktan sonra, reaksiyon ürünlerini uygun bir yüzde agaroz jel üzerinde ayırın, böylece parçalarınızın boyutlarını ayırt edebilirsiniz. Wildtype kontrolü yalnızca 200 baz çifti wildtype bandına sahip olmalıdır; Transgenik kontrol sadece bir 900 baz çiftine, transgen bandına sahip olmalıdır; Ve HET kontrolü her iki banda da sahip olmalıdır. Son olarak, bir ?şablon yok mu? reaktiflerin herhangi bir kirletici DNA içermediğinden emin olmak için kontrol dahil edilmiştir ve bu nedenle herhangi bir bant oluşturmamalıdır.

Artık kontrollerin beklendiği gibi çalıştığından emin olduğumuza göre, bilinmeyen farelere bir göz atalım. Fare 1 ve 2'nin her biri yalnızca bir vahşi tip bandına sahip olduğundan, bunlar homozigot vahşi tiptir. Fare 4 ve 6'nın her biri yalnızca bir transgen bandına sahiptir ve bu nedenle homozigot transgeniktir.

Ve fareler 3 ve 5'in her birinin iki bandı vardır ve bu nedenle tavşandır.

Son olarak, istediğiniz genotipe sahip fareleri bulmak için geri döndüğünüzde, kulak çentiklerinin desenini farenin kimlik numarasıyla eşleştirmeniz yeterlidir.

Genotiplemenin ne olduğunu ve nasıl yapıldığını anladıktan sonra, neden yararlı olduğuna dair bazı örneklere bakalım.

Bazı durumlarda, istenen fenotipi üretmek için daha karmaşık genetik modifikasyonlar gereklidir. Örneğin, farelerde bu cilt kanseri modelini oluşturmak için iki transgen gereklidir. Biri indüklenebilir bir "onkogen" taşır. veya kansere neden olabilen bir gen ve ikincisi, yalnızca cilt hücrelerinde eksprese edilen ve onkogen transkripsiyonunu önleyen bir diziyi eksize eden ve böylece onkogen ekspresyonuna izin veren Cre rekombinaz enzimini taşır. Her iki transgene sahip yavrular üretmek için, her biri için heterozigot fareler çiftleştirilir. Genotipleme daha sonra istenen yavruyu tanımlamak için kullanılır.

Bazen bir deneyden önce fareleri genotiplemek mümkün olmayabilir. Örneğin, embriyonik kalp atış hızı ile ilgili bu çalışmada, davranışlarını bozmadan embriyolardan genotipleme için doku toplamak mümkün değildir. Bu nedenle, anne içindeki embriyo pozisyonları önce dikkatlice etiketlenir, daha sonra ultrason ölçümleri kaydedilir. Son olarak, genotipin kalp atış hızı üzerindeki etkisini belirlemek için kuyruk biyopsileri toplanır.

Bu video, DNA ekstraksiyonunun bir yöntemini göstermiştir, ancak birçok varyasyon vardır. Örneğin, Doğrudan PCR sistemi beş dakikadan daha az doku sindirimi gerektirir. Ek olarak, sindirilmemiş materyali döndürdükten sonra, süpernatan PCR için hazırdır ve DNA saflaştırma ihtiyacını ortadan kaldırır.

JoVE'nin fareleri genotipleme rehberini yeni izlediniz. Bu videoda, fare genetiğinin temellerini, fare DNA örneklerinin nasıl hazırlanacağını ve analiz edileceğini ve bu tekniğin bazı pratik uygulamalarını inceledik. İzlediğiniz için teşekkürler!