İnsan Pluripotent dan Sinir Crest Progenitör Hücreler besleyici ücretsiz Derivasyon Kök Hücre

Bu prosedürün genel amacı, kısa, tekrarlanabilir ve tanımlanmış bir protokol ile insan pluripotent kök hücrelerinden nöral krista progenitör hücreleri üretmektir. Bu hücreler daha sonra ya in vitro nöral krista ile ilişkili hastalıkların çalışılması ya da bu hücrelerin progeni hücrelere farklılaşmaya devam etmesi için kullanılabilir. Bu işlem, önce yüksek yoğunluktaki insan pluripotent kök hücrelerinin matrijel üzerinde tek tabaka halinde ekilmesiyle gerçekleştirilir.

İkinci adım, temel sinyal yolaklarını etkileyen küçük moleküllerin tanımlanmış bir dizisi ve kombinasyonu kullanılarak hücrelerin nöroepitelyal hücrelere farklılaştırılmasıdır. Ardından, nöroepitelyal hücreler yeniden ekilir ve nöral krest progenitör hücrelerine daha fazla farklılaştırılır. Son adım ise, floresanla aktive edilmiş hücre ayıklama yöntemi kullanılarak nöral krest hücrelerinin izole edilmesidir.

Son olarak, uygun nöral krest hücrelerinin oluşturulduğunu göstermek için immünofloresan ve hücrenin göç etme yeteneği gibi fonksiyonel analizler kullanılır. Bu tekniğin, insan pluripotent kök hücrelerinden nöral krest hücrelerinin türetilmesine yönelik mevcut protokollerle kıyaslandaki temel avantajı, daha kısa süreli olmasıdır. İşlem yalnızca 18 gün sürer.

MS five feeder hücrelerin yokluğu nedeniyle daha tekrarlanabilirdir. Ölçeklendirilmesi kolaydır ve insan pluripotent kök hücre hatları arasında yüksek düzeyde tekrarlanabilirlik gösterir. Bu tekniğin etkileri, nöral soy ile ilgili insan hastalıklarının mekanizmalarına yönelik çalışmalara uzanmakta olup, bu hastalıkların in vitro modellemesinin ve ilaç taramasının detaylandırılması konusunda potansiyel sunmaktadır.

Bu protokole başlamadan önce, insan pluripotent kök hücre kolonilerinin gözle görülebilecek kadar büyük olduğundan ve sınırlarında çok az farklılaşmış hücre ile hala keskin kenarlara sahip olduğundan emin olun. Ardından, hPSC'ler bölmeye hazır olduğunda, medyumu aspire edin, bir kez 5 mL 1XPBS ile yıkayın ve hücrelere 4 mL %0,05 tripsin-EDTA ekleyin. Daha sonra, fare embriyonik fibroblastlarının mikroskop altında plakadan tek hücreler halinde ayrıldığı görüldüğünde, kabı iki dakika boyunca yatay olarak kuvvetlice sallayın.

HPSC kolonileri kapta koloni şeklinde yapışık kalacaktır; ardından tripsini hemen ve tamamen aspire edin ve plakayı oda sıcaklığında iki ila dört dakika bekletin. Plakaya iki mililitre HES ortamı ekleyin ve hücreleri ayırmak için P 1000 pipet kullanın. Eğer hücreler kolayca kalkmazsa, plakayı iki ila üç dakika daha inkübe edin.

Oda sıcaklığında, hücre süspansiyonunu 10 µM Y 2 7 6 3 2 diklorhidrat ile desteklenmiş sekiz mL HES ortamı içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Ardından, önceden işlem görmüş 10 cm'lik bir kapaktaki matrigeli aspire edin ve hücreleri bir bire bir veya bir bire iki oranında matrigel ile işlem görmüş plağa ekimleyin. Hücreleri %5 CO2 inkübatöründe 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Hücreler farklılaşmaya hazır olana kadar onları her gün HES medyumu ile besleyin. Ardından, hücreler %90 ila %100 konfluen olduğunda nöral farklılaştırmaya başlayın. Bu, sıfırıncı gündür.

Hücreleri sıfırıncı günden üçüncü güne kadar, 0,1 µM LDN 193189 ve 10 µM SB 431542 içeren 10 mL KSR diferansiyasyon besiyeri ile her gün besleyin. Ardından dördüncü ve beşinci günlerde, hücreleri %75 KSR diferansiyasyon besiyeri, %25 And 2 diferansiyasyon besiyeri, 0,1 µM LDN 193189 ve 10 µM SB 431542 içeren 10 mL besiyeri ile besleyin. Altıncı ve yedinci günlerde hücreleri, 0,1 µM LDN 193189 ve 10 µM SB 431542 takviyesine ek olarak %50 KSR diferansiyasyon besiyeri ve %50 And 2 diferansiyasyon besiyeri içerecek şekilde ayarlanan besiyeri ile besleyin.

Sekizinci ve dokuzuncu günler için, hücreleri %25 KSR diferansiyasyon besiyeri ve %75 N2 diferansiyasyon besiyeri ile besleyin; her ikisi de 0,1 µM LDN 193189 ve 10 µM SB 431542 içermelidir. Ardından dokuzuncu ve onuncu günlerde, 11. günde hücrelerin yeniden ekimi için kullanılacak olan kültür kaplarını, metin protokolünde açıklandığı şekilde poli-L-ornitin, laminin 1 ve fibronektin ile hazırlayın. 11. günde, hücreleri 0,1 µM LDN 193189 ve 10 µM SB 431542 ile desteklenmiş N2 diferansiyasyon besiyeri ile besleyin. 11. günde, daha önce hazırlanmış kültür kaplarındaki laminin 1 ve fibronektin solüsyonunu aspire edin ve bir doku kültürü davlumbazında oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika boyunca kurumaya bırakın.

Ardından, farklılaşan hücrelerdeki besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri bir kez 1X PBS ile yıkayın. Daha sonra, her 10 cm'lik plağa sekiz mililitre Accutane ekleyin ve plakları 37 °C'de 20 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, hücreleri ayırmak için bir hücre kaldırıcı (cell lifter) kullanın ve ardından hücreleri Accutane solüsyonu içinde yeniden süspande edin.

Beş mililitrelik bir pipet ile hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Ardından, tüpe beş mililitre 1X PBS ekleyin ve hücreleri 5 dakika boyunca 115 G'de santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini 10 mililitre 1X PBS içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücre süspansiyonunu 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin.

Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın. Hücreleri 115 Gs'de beş dakika boyunca tekrar santrifüjleyin ve hücreleri, takviye edilmiş N iki diferansiyasyon besiyerinin 10 mikrolitresi başına 100.000 ila 150.000 hücre olacak şekilde yeniden süspande edin. Hücre süspansiyonundan 10 mikrolitrelik damlacıkları, poli L-ornin ile ön işleme tabi tutulmuş 15 santimetrelik kültür kaplarına ekmek için tekrarlayıcı pipet kullanın.

Laminin 1 ve fibronektin. Damlacıkları oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika bekletin. Ardından, damlacıkları bozmadan, plakaya çok dikkatli bir şekilde 30 ml takviye edilmiş N2 farklılaşma ortamı ekleyin.

Hücreleri %5 karbon dioksit inkübatöründe 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. 12. günde, her 15 cm'lik kap için 200 µM asik asit, 20 ng/mL beyin türevli nörotrofik faktör, 100 ng/mL fibroblast büyüme faktörü sekiz ve 20 ng/mL sonic hedgehog içeren 20 mL N2 diferansiyasyon besiyerini hücrelere dikkatlice ekleyin.

Ardından 14. günden 17. güne kadar hücreleri her iki ila üç günde bir; yalnızca 200 µM askorbik asit, 20 ng/mL beyin türevli nörotrofik faktör ve 100 ng/mL fibroblast büyüme faktörü içeren N2 farklılaşma ortamı ile besleyin. Nöral krest hücrelerinin yeniden ekilmesi (replating) için kullanılmak üzere 16. ve 17. günlerde poly-L-ornitin, laminin 1 ve fibronektin ile kaplanmış plaklar hazırlayın.

18. gündeki FACS analizinden sonra, hücreler floresan aktivasyonlu hücre ayırma yöntemiyle ayrıştırıldıktan sonra, nöral krist hücrelerini sayın ve ardından beş dakika boyunca 115 G'de santrifüjleyin. Hücre peletini, mililitrede 10 nanogram eklenmiş N2 diferansiyasyon besiyerinde yeniden süspande edin.

20 ng/mL FGF2, EGF ve 10 µM Y 2 7 6 3 2 di hydrochloride içeren hücre süspansiyonunu, 10 µL başına 30.000 hücre konsantrasyonunda hazırlayın. Daha önce poli-L-ornitin, laminin 1 ve fibronektin ile hazırlanmış kültür kaplarını iyice kurulayın. Ardından, her 10 cm'lik kap başına hücre süspansiyonundan yaklaşık 50 ila 70 damla ekleyin.

Her bir 10 cm'lik kaba, damlacıkları bozmadan, 10 ng/mL FGF2, 20 ng/mL EGF ve 10 µM Y27632 dihidroklorür ile desteklenmiş 20 mL N2 diferansiyasyon ortamı ekleyip hücreleri oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika inkübe edin.

Ardından hücreleri, %5 karbon dioksit inkübatöründe 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, beraberindeki metin protokolüne göre nöral krist hücrelerini sürdürün ve pasajlayın; nöral krist hücreleri, bu yeni besleyici hücre içermeyen in vitro diferansiyasyon protokolü kullanılarak insan pluripotent kök hücrelerinden 18 günde türetilmiştir.

18. gündeki faks analizi, hem HNK-1 hem de P75 için pozitif olan hücreleri belirleyerek nöral krest hücrelerinin varlığını doğrulamıştır. Hem besleyici hücre içermeyen farklılaşma protokolünde hem de besleyici hücreye bağımlı protokolde, nöral krest hücreleri bir nöral rozet aşamasından geçmiştir. Ek olarak, fakla ile ayrıştırılan hücreler özdeş morfolojiye sahiptir ve nöral krest belirteçleri olan HNK-1 ve P75'i eksprese etmiştir; bu iki farklılaşma protokolünden türetilen nöral krest hücrelerinin global gen ekspresyonunun karşılaştırılması, her iki hücre setinin birbirine yakın şekilde kümelendiğini ortaya koymuştur.

Besleyici hücre içermeyen protokol kullanılarak elde edilen nöral krest hücrelerinin migrasyon kapasitesinin analizi, hücrelerin 48 saat sonra çizik bölgesine başarılı bir şekilde göç ettiğini göstermiştir. Bu hücrelerin ayrıca, dört günlük ek farklılaşmanın ardından mash one ve touch one için pozitif boyanma ile doğrulandığı üzere, otonom sinir sistemi hücrelerine farklılaşma potansiyeline sahip olduğu görülmüştür. Bu videoyu izledikten sonra, insan pluripotent kök hücrelerinin nasıl nöralize edileceği ve in vitro ortamda nöral krest progenitör hücrelerinin nasıl elde edileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.