Name: Sıçan Pulmoner METASTAZLARINDA Mikrosirkülasyonda Kan Akışı Hızının Otomatik Ölçüm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Keşfedin sıçanlarda pulmoner metastazlarda mikrosirkülasyon kan akış hızını otomatik ölçüm yöntemini. Kapalı göğüs intravital mikroskopi ile tümör mikroçevresini gerçek zamanlı inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Timothy McMahon ve Dr. Siqing Shan'ın bilimsel tavsiyeleri takdire şayandır. Sunucular, sırasıyla floresan etiketli Fare Sarkomu ve metastatik MDAMB-231 hücrelerinin cömert hediyesi için Dr. David Kirsch ve Patricia Steeg'e teşekkür eder. Bu çalışma kısmen ABD Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı (DARPA) Başbakan Ödül Numarası N66001-10-C-2134 ve kısmen de Duke Üniversitesi Tıp Merkezi Radyasyon Onkolojisi Anabilim Dalı tarafından finanse edildi.

NOT: Bu protokol açıklanan tüm hayvan ilgili prosedürler önceden Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (DUIACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Kanser Hücre Kültürü ve Enjeksiyon <ol><li> Floresan etiketli metastatik kanser hücrelerini Yetiştirmek (örn insan MDAMB231-GFP meme kanseri hücreleri, Dr. Patricia Steeg, NCI ve YFP etiketli fare sarkomu hücreleri, Dr David Kirsch, Duke Üniversitesi Tıp Merkezi&#39;nde Radyasyon Onkolojisi Bölümü&#39;nden hediye hediye) Uygun bir kültür ortamında (örneğin, Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı,% 10 fetal büyükbaş hayvan serumu ve% 1 penisilin / streptavidin ile (DMEM)), 37 ° C &#39;de yaklaşık olarak% 90, birbirine karışana kadar. </li><li> Hücreleri Trypsinize PBS ile onları 2 kez yıkayın, saymak, ve sonra bir 27 G iğne ile bir şırınga kullanarak, hayvan başına 5 milyon hücre izofluran-anestezi 10 haftalık dişi çıplak sıçanların kuyruk damarlar içine enjekte edilir. Cerrahi düzey anesthesia ayak tutam tepki eksikliği tarafından doğrulanmadı. </li></ol> Metastaz kullanma mikroBT 2. İzleme <ol><li> Metastaz çapı çapı yaklaşık 2 mm varlığını tespit etmek için, bir mikro-CT / mikro ışınlayıcı kullanılarak haftada bir sıçan inceleyin. Daha önce açıklandığı gibi 12 mikro-BT devreye alınmıştır. <ol><li> Görüntüleme önce% 3 izofluran anestezisi Konu fareler. Ayak tutam derin anestezi onaylayın. </li><li> Anestezi başlangıcından sonra, hızla görüntüleme odasında görüntüleme beşiğine sıçan aktarmak ve% 2.5-3 bir izofluran-hava karışımı bir burun-koni aracılığıyla bağlayın. Görüntüleme beşiği harici pozisyon kontrolleri ve lazer sınırlayıcı kullanarak, kendi toraks mikroBT tarayıcının foton ışın konumlandırılmış bir şekilde beşikte sıçan konumunu ayarlayın. Gama ışınlarından araştırmacı kalkan, görüntüleme odasının kapısını kapalı olduğundan emin olun. </li><li> Yine kullanarak hayvanın konumunu kontrolrenkli video kamera. Düşük çözünürlüklü BT görüntüleme deneme sürüşü gerçekleştirin ve göğüs boşluğunun xyz boyutlarına görüş alanını ayarlamak için çıkan görüntü kullanın. </li><li> Görüntü sıçan 40 kVp bir 2 mm Al filtre kullanılarak toraks, 2.5 mA ve 7 FPS 0.008 Vokseller ve kafesine hayvan dönün. Bir hayvanın Görüntüleme en fazla 15 ya da 20 dakika sürer. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin. Sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayın. </li><li> Intratorasik kan damarları tarafından izah edilemez nispeten radyo-opak nesnelerin görünümünü tarafından metastaz onaylayın (Şekil 1A) </li></ol></li></ol> 3. Pencere Odası Cerrahisi <ol><li> Anestezi, vital bulgular ve kuyruk ven kateterizasyonu <ol><li> Metastatik hastalık varlığı ile hayvanları seçin. Bir karın içi d hayvan enjekte50 mg / kg pentobarbital ose. Devam etmeden önce ayak tutam cerrahi düzey anestezi onaylayın. Not: Anestezi protokolleri ilgili deney düzeneği uygun olmalıdır. Kolay yeniden doz seçeneği sunarken Pentobarbital, uzun prosedürler için derin anestezi uyarmak için, uzun etkili anestetik olarak burada seçildi. Ancak, doz aşımı hayvanların kaybı pentobarbital anestezi ile ortak bir sorundur. Pentobarbital daha büyük bir dereceye kadar otonom refleksleri koruyan Başka bir seçenek de, ancak sadece tek bir yeniden dozaj çevrimi için izin iksilazin ya da medetomidin gibi sedatif ile kombinasyon halinde ketamin olup. </li><li> Bir clipper kullanarak, metastatik hastalık vardır, ve boyun bölgesinde vücudun yan tarafında hayvanlar Tıraş. Cilt kalan tüm gevşek saç silin. Gevşek saç kaldırıldıktan sonra, kurumasını önlemek için, gözlere veteriner merhem uygulayın. NOT: Atimik çıplak sıçanlar requi artık saç olabilircerrahi işlemlerde devam etmeden önce res kaldırma. Cerrahi prosedürler ve görüntüleme müdahale edebilir gibi, iyice tüm saç kaldırmak için çok önemlidir. </li><li> 37 ° C su sirküle ısıtma yastığı yerleştirilmiş bir metal plaka üzerinde bir yatar pozisyonda hayvan Fix. Ön ve arka ekstremite bant ile plaka üzerine sabitlenir. NOT: Bu kontrol ve cerrahi ve deneysel prosedürler boyunca, bir pulse oksimetre ile kalp oranları ve arteriyel kan oksijenlenme gibi vital bulguları, kayıt yararlıdır. </li></ol></li><li> Trakeal entübasyon <ol><li> Trakea uzunlamasına kas ventral median ayrılması ardından çapraz servikal cilt kesisi, ilk, hayvanın havalandırma için bir kateter yerleştirmek yapmak için. </li><li> Trakea dorsal tarafı ile dikiş için bir geçiş oluşturmak için keskin bir forseps ile tekrarlanan açılış-to-kapama eylemini kullanın. </li><li> T trakea içine küçük bir kesi yapınO ventral yüzü, yaklaşık olarak ikinci ve üçüncü trakeal halka arasında, yarı dairesel daha fazla olamaz. Trakeal kateterin tespit sağlamak için, dorsal yüzeyi üzerinde açığa trakea yeterince uzun bir bölümü bırakın. </li><li> Trakea içine 2,5-3,0 mm &quot;Y&quot; trakeal kanül yerleştirin ve 4-0 monofilament sütür ile sıkın. Pozitif akciğer basıncını sağlamak için, kanül su 6 cm ile doludur son kanalına bağlı bir şişe basınç devirli ventilatöre bağlı olduğundan emin olun. Deneysel aksi istenen sürece akan gaz,% 100 oksijen olmalıdır. </li><li> Bir 25-27 G iğne ile bir kateter yerleştirin ve sıçan kuyruğu damarlar birine heparinli serum fizyolojik ile doldurulur, ve bant ile yerde sabitleyin. NOT: arka arkaya kuyruk damarından heparinli tuz az miktarda enjekte edilerek işlem boyunca kuyruk damarı kateterinin açıklığını sağlamak. Ayrıca, oro-entübasyon, bir trakeal rehberlik yanianestezi verilen hayvanın ağız yoluyla ve nefes borusu içine gırtlak geçen tüp, burada açıklanan traketomi edilen prosedüre de bir olası alternatiftir. Ancak, bu yöntem trakea zarar görmesini önlemek için, ve aynı zamanda yemek borusu yanlışlıkla kanül engelleyecek, özel eğitim ve deneyim gerektirir. </li></ol></li><li> Pulmoner pencere Uygulaması <ol><li> Künt diseksiyon kullanarak cilt ayırma sonra bir kesi oluşturarak, tarafından, metastatik hastalık bulunduğu göğüs tarafındaki deriyi çıkarın. Not: Cilt çıkarıldı ve dekolmanı sonraki kaldırılabilir </li><li> Bindirilirken kas (pektoralis, serratus ve latissimus dorsi) iki kat diseksiyon, ama sağlam interkostal kasları bırakarak devam edin. Tipik olarak, iki bitişik kaburga kısımları bertaraf eder, çap olarak yaklaşık 1.5 cm göğüs boşluğunda bir delik oluşturur. İdeal olarak, altıncı ve yedinci r bölgenin perforasyon bulunibs. </li><li> Osteotomi: <ol><li> Akciğer yüzeyine kanama ve zararı en aza indirmek için, sıkı kesme sırasında bir dişli cerrahi forseps ile kesilecek kaburga tutun. Cerrahi makas kullanılarak, dış işaret kalan kaburga kemiği sivri bir kenar bırakan, yaklaşık 45 ° &#39;lik bir açı ile, ilk kaburga medial yan kesti. </li><li> Daha sonra, yeniden akciğer yüzeyine zarar görmesini önlemek için, dışarı doğru bakan kabartma kemikten sivri bir kenar bırakan, benzer bir şekilde, kaburga kemiği yanal kenarını. </li><li> Daha sonra interkostal kasları kesmek ve kesilmiş parça kaldırın, komşu kaburga için işlemi tekrarlayın. Bu prosedür sırasında, akciğer yüzey ve göğüs kafesi arasında mekanik bir etkileşim en aza indirecek bir şekilde akciğer basınç sağlar. Uygun ventilatöre ilham basıncını düzenleyerek bunu yapın. </li></ol></li><li> Pencerenin yerleştirilmesi: <ol><li> Bir coverglass oluşan bir özel yapılmış akciğer penceresini takınbir pleksiglas soketi (Şekil 1B) eklenmiş. , Yapıştırma ya da vakum yağ çok az miktarda uygulanarak sokete pencere takın. Yüzey metastazları yakın pencerenin merkezine yer almaktadır bir şekilde pencereyi yerleştirin. Gerektiği taktirde ilgili tarafına hafifçe delik genişletilirse, pencerenin merkezi Mikrometastaz getirmek için eklenen bir delik ayarlayın. NOT: Plevral yüzeyde Metastatik hastalık çatlaklar boyunca ağırlıklı olarak görünen akciğer yüzeyinin aksi pembe-to-somon renkli sağlıklı parçalarının içinde açıkça tanınabilir beyaz noktalar veya alanlar olarak tespit edilebilir. Mikrometastazlar plevra dış diğer alanlarda oluşabilir iken, incelenen hücre çizgileri hemen hemen her zaman metastatik hastalık radyolojik tespit edilebilir kez delinmiş alanda mikrometastazları yüzey görüntüler. </li><li> Perforasyon içine soketi takarken, ve l viseral plevra ile doğrudan temas oluşturduktan sonraung, 4.0 monofilament sütür (Şekil 1C) kullanarak, çevredeki interkostal kas pencere çerçevesinin kenarlarını dikin. Kaçmak ve bir mühür oluşturmak için artık havayı yardımcı ventilatöre ilham basınç hafif bir artış kullanın. Not: sıçanların solunum hızı 70 ile 90 bpm arasında solunum hızını ayarlamak için tavsiye vb anestezi, heyecan veya anksiyete durumu, solunan havanın oksijen konsantrasyonu (FiO2), durumuna bağlı olarak, büyük ölçüde değişebilir. ilham basıncı dikkatle ayarlanmalıdır ve yaklaşık fazla ayarlanmalıdır. 8 cm H2O (0.6 mm Hg), akciğer yüzeyine zarar görmesini önlemek için. </li></ol></li><li> Flöresanlı bir mikroskop altında, bir termostatik (elektrik) ısıtma battaniyesi üzerine yerleştirilen bir çelik plaka ile Z-yönlü hareketi (Şekil 1D) ortadan kaldırmak için tasarlanmıştır özel olarak tasarlanmış süzgeç hayvan yerleştirin. Hayvanın vücudu kontrolrektal termistör kullanarak sıcaklığı. Hayvan süzgeç vidalarını ayarlayın ve ventilatöre ilham basıncı yanal hareket optimal kontrolü sağlamak için. Not: ikili, dorso-ventral ve kranyokaudal: memelilerde Doğal solunum akciğer hareketi ve göğüs uzantısı üç yön içerir. Mümkün olduğunca doğal bir solunum hareketi korumak için, gerekli ölçüde Z yönlü sıkıştırma en aza indirmek için önemlidir. Z-boyutlu emniyet kan akışını ve diğer parametreleri etkileyebilir eserleri tanıtmak potansiyeline sahip olduğundan, aynı hayvanda tekrarlayan ölçümler dizi boyunca sürekli koşullarını tutmak için tavsiye edilir. </li></ol></li></ol> 4. Görüntüleme ve Ölçüm Mikrosirkülasyonda Kan Akımının <ol><li> Kalp ponksiyonu ile kırmızı kan hücreleri toplamak ve daha önce tarif edildiği gibi, DII (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 = 3 = tetrametil-indokarbosiyanin perklorat) ile etiket &lt;sup&gt; 10. </li><li> Pencere bölmesi ameliyatı yapılır önce cam pencere için ilk geçiş yapışma etkilerini önlemek için, sıçanın kuyruk venine işaretli kırmızı kan hücrelerinin 300 ul enjekte edilir. Ven içine hava giriş başka enjeksiyon inhibe gibi, şırınga ya da sonda herhangi bir hava kabarcığı ortadan kaldırır. </li><li> Görüntü kan sıcaklığı -40 ° C soğutma çip bir mikroskop CCD kamera ile akış ve yaklaşık 100X toplam çözünürlük (10X mikroskop objektif yani, ve 10X ön kamera göz). Standart Rodamin / TRITC filtre setleri (uyarma 450-490 nm, emisyon&gt; 515 nm) kullanın. Ortaya çıkan görüntü dizilerinin gerçek kare hızı ve piksel çözünürlüğü kaydedin. Yığının başına rekor en az 200 (ideal etrafında 300) görüntüleri, akış hızı başarılı analizini sağlamak. </li><li> Tuzlu su ip yaklaşık 1 ml her bir saat enjekte edilerek hayvanda sıvı kaybı doldurun. NOT: Bir müdahale içeren deneysel ayarları, örneğinBir akciğer kanseri metastazı kan akış hızını değiştiren bir ilaç, pulmoner metastatik kanser kan akış hızı tekrarlanan ölçümler gerektirir. Bu genişletilmiş deneyler için, yeterli sıvı ile hayvan doldurmak için önemlidir. </li><li> Kuyruk venine 3N KCI 3 ml infüzyon ile hayvanlara Euthanize </li><li> Tüm kan akışı için akış hızı gri tonlu ve renkli kodlanmış haritalar 10,11 izleri yaratacak bir yayınlanan kamuya açık Matlab tabanlı bir bilgisayar algoritması kullanarak görüntü yığınlarını değerlendirin. Daha sonra, kan hücrelerinin hiçbir hareket gösterir aktif damarsal yani değerleri kapalı eşikleme sonra, örneğin Görüntü J gibi ticari veya kamuya açık görüntü analiz yazılımı kullanarak ortaya çıkan gri tonlu görüntüleri değerlendirir. </li></ol>

<ol><li>Billingsley, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+metastases+from+soft+tissue+sarcoma%3A+analysis+of+patterns+of+diseases+and+postmetastasis+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Pulmonary metastases from soft tissue sarcoma: analysis of patterns of diseases and postmetastasis survival.</a> Ann Surg. 229, 602-610 (1999).</li>
<li>Rashid, O. M., Takabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+the+role+of+surgery+in+the+management+of+breast+cancer+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Dis%22%5BJournal%5D)">The evolution of the role of surgery in the management of breast cancer lung metastasis.</a> J Thorac Dis. 4, 420-424 (2012).</li>
<li>Mayer, A., Vaupel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2C+lactate+accumulation%2C+and+acidosis%3A+siblings+or+accomplices+driving+tumor+progression+and+resistance+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia, lactate accumulation, and acidosis: siblings or accomplices driving tumor progression and resistance to therapy.</a> Advances in experimental medicine and biology. 789, 203-209 (2013).</li>
<li>Okunieff, P., O'Dell, W., Zhang, M., Zhang, L., Maguire, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+oxygen+measurements+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Tumor oxygen measurements and personalized medicine.</a> Advances in experimental medicine and biology. 765, 195-201 (2013).</li>
<li>Palmer, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optical+molecular+imaging+and+analysis+in+mice+using+dorsal+window+chamber+models+applied+to+hypoxia%2C+vasculature+and+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters.</a> Nature protocols. 6, 1355-1366 (2011).</li>
<li>Palmer, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+tumor+hypoxia+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of tumor hypoxia dynamics.</a> Journal of biomedical optics. 15, (2010).</li>
<li>Funakoshi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+lung+metastasis+for+intravital+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">A new model of lung metastasis for intravital studies.</a> Microvasc Res. 59, 361-367 (2000).</li>
<li>Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+assessment+of+pulmonary+vascular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging assessment of pulmonary vascular responses.</a> Proc Am Thorac Soc. 8, 458-465 (2011).</li>
<li>Tabuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precapillary+oxygenation+contributes+relevantly+to+gas+exchange+in+the+intact+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung.</a> Am J Respir Crit Care Med. 188, 474-481 (2013).</li>
<li>Hanna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+measurement+of+blood+flow+velocity+and+direction+and+hemoglobin+oxygen+saturation+in+the+rat+lung+using+intravital+microscopy.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American journal of physiology.</a> Lung cellular and molecular physiology. 304, 86-91 (2013).</li>
<li>Fontanella, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+hemodynamics+in+the+lung%2C+brain%2C+and+dorsal+window+chamber-grown+tumors+using+a+novel%2C+automated+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of hemodynamics in the lung, brain, and dorsal window chamber-grown tumors using a novel, automated algorithm.</a> Microcirculation. , (2013).</li>
<li>Newton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commissioning+a+small-field+biological+irradiator+using+point%2C+2D%2C+and+3D+dosimetry+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+physics%22%5BJournal%5D)">Commissioning a small-field biological irradiator using point, 2D, and 3D dosimetry techniques.</a> Medical physics. 38, 6754-6762 (2011).</li>
<li>Vaupel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironmental+physiology+and+its+implications+for+radiation+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+radiation+oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology.</a> Seminars in radiation oncology. 14, 198-206 (2004).</li>
<li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> J Appl Physiol. 104, 338-346 (2008).</li>
<li>Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+for+the+study+of+pulmonary+microcirculation%3A+determination+of+pulmonary+edema+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats.</a> J Surg Res. 57, 385-393 (1994).</li>
<li>Manzoor, A. A., Schroeder, T., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-stop-shop+tumor+imaging%3A+buy+hypoxia%2C+get+lactate+free%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">One-stop-shop tumor imaging: buy hypoxia, get lactate free.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 1616-1619 (2008).</li>
<li>Evans, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+analytical+methods+as+applied+to+the+evaluation+of+vasculature+and+hypoxia+in+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+research%22%5BJournal%5D)">Imaging and analytical methods as applied to the evaluation of vasculature and hypoxia in human brain tumors.</a> Radiation research. 170, 677-690 (2008).</li>
<li>Radiloff, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+theophylline+and+endothelin+receptor+antagonism+improves+exercise+performance+of+rats+under+simulated+high+altitude%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">The combination of theophylline and endothelin receptor antagonism improves exercise performance of rats under simulated high altitude.</a> Journal of applied physiology. 113, 1243-1252 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bir model İntra vital mikroskopik ve hesaplama kan akışı analizi kullanılarak mikro dolaşım kan akışı ve sıçanların akciğer metastazı Diğer dinamik süreçleri, görüntü değişikliklerine mümkün olduğu gösterilmiştir. Diğer yöntemler kemirgenler açık ribcages maruz akciğerler üzerinde mikroskopi gerçekleştirmek için var iken, bu model aynı zamanda bir kapalı göğüs ortamda bir göğüs duvarı perforasyon ile görüntü pulmoner metastazlar için ilk. Bu yöntemle kullanarak, fizibilite pulmoner metastaz mikrosirkülatuar kan akımında...

Akciğer, metastatik hastalığın en önemli hedef organlarından biridir ve bu durumun kemoterapi ve radyasyon tedavisi ile başarılı bir şekilde tedavi edilmesi zor olduğundan, bir tedavi hala nadirdir1,2. Katı primer ve metastatik tümörlerin mikrobölgesel hipoksi, difüzyon kısıtlılığı ve verimsiz tümör vaskülatürü gibi spesifik patofizyolojik ve mikrodolaşım özellikleri, antikanser tedavisine dirençlerine büyük ölçüde katkıda bulunur3,4. Mikroskobik ölçek ve mikrovasküler kan akışı gibi parametrelerin dinamik doğası nedeniyle, canlı hayvandaki tümörün intravital mikroskobu alanında çok önemli bir araştırma aracı haline gelmiştir5. Açık bir göğüs kafesi içindeki metastatik akciğer de dahil olmak üzere farklı organ bölgelerindeki tümörlere intravital mikroskopi modelleri uygulanmış olsa da, fizyolojik olarak koruyucu, kapalı göğüs ortamında pulmoner metastazların araştırılması için henüz bir protokol geliştirilmemiştir6,7. Böyle bir çaba, özellikle akciğerin genel işlevini etkilemeden göğüs kafesine cerrahi olarak erişme gerekliliği tarafından engellenmektedir7-9. Son zamanlarda, floresan intravital mikroskopi10 kullanılarak, canlı sıçanlarda yakın göğüs ortamında pulmoner mikrodolaşım kan akışını görüntülemek için bir yöntem tanıtıldı. Bu protokol, hayvanı fizyolojik olarak stabil tutarken ve akciğerin bütünlüğünü korurken, bilgisayarlı analiz kullanarak enjekte edilen, floresan olarak işaretlenmiş kırmızı kan hücrelerinden kan akış hızının sistematik olarak ölçülmesini sağlar11. Bu çalışmada, bu teknolojinin, immün sistemi baskılanmış sıçanda plevral yüzeydeki kuyruk veni ile aşılanmış pulmoner metastazlarda mikrodolaşım kan akışını görüntülemek ve ölçmek için nasıl değiştirilebileceği gösterilmiştir. Bu model aynı zamanda metastatik akciğer tümörlerini kapalı göğüs intravital mikroskopi ortamında inceleyen ilk modeldir.

<table><tbody><tr><td>Atimik çıplak sıçanlar</td><td>Charles River</td><td>Suş kodu 316</td><td>Dişi 10 haftalık atimik çıplak sıçanlar</td></tr><tr><td>mikro-CT / mikro-Işınlayıcı&nbsp;</td><td>Hassas X-ray Inc.</td><td>Xrad 225Cx</td><td>Metastazları tespit etmek için MicroCT kullanın</td></tr><tr><td>DiI (1,1=-dioktadesil-3,3,3=,3=-tetrametil-indokarbosiyanin perklorat)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495-100MG</td><td>100 ul paketlenmiş kırmızı kan hücrelerini 200 geçirmez etanol, 2 ml% 5 dekstroz çözeltisi içinde 100 ul paketlenmiş kırmızı kan hücresi ile karıştırın ve 10 ml'lik son hacme kadar tuzlu su ile doldurun</td></tr><tr><td>Kemirgen ventilatörü</td><td>Kent Scientific</td><td>TOPO Küçük Hayvan Vantilatörü</td><td>Pnömotoraks uygulandıktan sonra cihaz pozitif akciğer basıncını korumak için önemlidir</td></tr><tr><td>Zeiss Axioskop floresan mikroskobu intravital</td> görüntüleme için dik <td>Zeiss</td><td>Aksiyoskop</td><td>Mikroskobu</td></tr><tr><td>Andor CCD kamera Andor</td><td></td><td>iXonEM 885</td><td>Kan akışının canlı görüntülenmesi için CCD kamera</td></tr><tr><td>Nabız oksimetresi</td><td>StarrLife</td><td>MouseOx</td><td>Nabız oksimetresi</td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop</td><td>Floresan mikroskobu</td></tr></tbody></table>

sıçan pulmoner metastazlarinda mikrosirkülasyonda kan akışı hızının otomatik Ölçüm

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Akciğer, metastatik hastalıkların ana hedef organı olduğundan, pulmoner metastazların fizyolojisini incelemek için hayvan modelleri büyük önem taşımaktadır. Bununla birlikte, mikroskopla akciğere erişimin zorluğu nedeniyle, akciğer metastazlarını mikrodolaşım düzeyinde dinamik bir şekilde araştırmak için bugüne kadar çok az yöntem mevcuttur. Burada, kapalı göğüs pulmoner penceresi ve kan akış hızı ve yönünün otomatik analizi kullanılarak sıçanlarda yüzeysel pulmoner metastazların mikrosirkülasyonunu fonksiyonel olarak görüntülemek ve ölçmek için intravital bir mikroskopi yöntemi sunulmaktadır. Bu yöntemin faydası, farmakolojik müdahaleye yanıt olarak kan akış hızındaki artışları ölçmek ve katı tümörlerin iyi bilinen kıvrımlı vaskülatürünü görüntülemek için gösterilmiştir. Bu, kapalı göğüs modelinde pulmoner metastazlar üzerinde intravital mikroskopinin ilk gösterimidir. En aza indirilmiş invazivliğinin yanı sıra göreceli kolaylığı ve pratikliği nedeniyle, bu teknoloji, pulmoner tümör araştırmaları konusunda uzmanlaşmış laboratuvarlarda yaygın kullanım potansiyeline sahiptir.

Katı tümörlerde damar kıvrımlarında daha fazla derece ve daha yüksek intervasküler mesafeleri 13 gösteren normal kan akımının önemli ölçüde farklıdır bilinmektedir. Normal akciğer mikro (Şekil 2A, üst panel) ile karşılaştırıldığında duruma göre, deneysel akciğer, meme kanseri ve sarkom metastazlarında kan akışı parçalar düzensiz şekiller ve geniş intervasküler boşluklar (Şekil 2A, iki alt paneller) sahiptir. Bir önceki çalışmada, pulmoner pencere yöntemi yeteneği, normal akci...

Sıçanlarda plevral yüzeyin akciğer kanseri metastazlarında mikrodolaşım kan akış hızını otomatik bir şekilde, kapalı göğüs pulmoner intravital mikroskopi kullanarak ölçmek için bir yöntem sunulmuştur. Bu model, kemirgenlerde pulmoner metastazlar üzerinde fizyolojik araştırmalar yapmak için yaygın bir araç olarak kullanılma potansiyeline sahiptir.

Sıçan Pulmoner METASTAZLARINDA Mikrosirkülasyonda Kan Akışı Hızının Otomatik Ölçüm

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Bu prosedürün genel amacı, akciğer metastazı taşıyan bir sıçanda intravital mikroskopi için bir torasik pencere oluşturmaktır. Bu işlem; önce metastaz taşıyan hayvanın anestezi altına alınması, entübe edilmesi ve basınçlı ventilasyon için küçük hayvan ventilatörüne bağlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, hayvanın kuyruk venine floresan işaretli kırmızı kan hücreleri enjekte edilir.Ardından, akciğer yüzeyine zarar vermeden cerrahi olarak toraks boşluğuna erişilir, metastaz tanımlanır ve bir pencere yerleştirilir. Son olarak, hayvanın mikroskobik görüntülemesi gerçekleştirilir. Neticede, canlı sıçanda akciğerin cerrahi olarak açılması ve akut mikroskopi için bir pencerenin yerleştirilmesi, akciğer metastazlarındaki mikrosirkülatör kan akışının otomatik olarak ölçülmesine olanak tanır.Bu tekniğin, göğüs mikro CT görüntüleme, invaziv olmayan epitorasik mikroskopi ve kanserli akciğerin mikro PET gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, pulmoner metastazların mikrosirkülasyonunun yüksek zamansal ve mekansal çözünürlükte gerçek zamanlı ölçümlerine olanak tanımasıdır. Bu yöntem, tedavilerin veya kanser ilerlemesinin kan akışını ve nihayetinde akciğer metastazlarındaki hipoksiyi nasıl değiştirebileceği gibi, pulmoner metastaz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, bu metastatik tümörlerin mikrosirkülatuar ve metabolik mikroçevresinin dinamiklerine dair benzeri görülmemiş bir bakış açısı sağlaması nedeniyle, pulmoner metastatik kanserin teşhis ve tedavisine kadar uzanmaktadır.Bu yöntem, pulmoner metastazların ve mikrosirkülasyonun dinamiklerini anlamanın önünü açacak ve böylece mevcut tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, akciğerin otonom hareketlerini minimize edecek şekilde ayarları düzenlemek deneyim gerektirdiğinden zorluk yaşayabilirler. Metin protokolüne göre bir sıçanda metastatik kanser indükleyip doğruladıktan ve intraperitonal dozda pentobarbital ile anestezi uyguladıktan sonra, sedasyonu doğrulamak için ayak parmağı sıkıştırma testi yapın.Hayvanın metastatik hastalığın bulunduğu vücut tarafını ve boyun bölgesini tıraş edin ve görüntülemeye engel olmaması için ciltteki tüm kalıntı tüyleri silerek temizleyin. Gözlerin kurumasını önlemek için veteriner pomadı uygulayın. Hayvanı, 37 °C su sirkülasyonlu ısıtma pedi üzerindeki metal bir plaka üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve ön ile arka ekstremiteleri sabitlemek için bant kullanın.Sıçana entübasyon prosedürü boyunca yaşamsal bulguları kontrol etmek ve kaydetmek için bir pulse oksimetre takın. İşleme transversal bir servikal cilt insizyonu yaparak başlayın. Ardından, trakeanın ventralindeki longitudinal kas grubunu keskin bir pensle medyal olarak ayırın.İkinci ve üçüncü trakea halkası arasındaki ventral tarafta, trakeanın dorsal tarafına doğru sütür için bir geçit oluşturmak üzere tekrarlayan bir açma-kapama işlemi uygulayın. Trakeada küçük bir insizyon yapın. Kateterin sabitlenmesini sağlamak için trakeanın dorsal yüzeyinde yeterli uzunlukta bir bölümün açıkta kalmasını sağlayın.Ardından, trakeaya 2,5 ila 3,0 milimetrelik bir Y trakeal kanül yerleştirin ve sabitlemek için dört sıfır monofilament sütür kullanın. Pozitif pulmoner basıncı korumak için, kanülü, ekspirasyon kanalına bağlı ve içi altı santimetre su ile dolu bir şişe bulunan basınç döngülü bir ventilatör aracılığıyla %100 oksijene bağlayın. Daha sonra, 25 ila 27 gauge bir iğne ve heparinli salinle doldurulmuş bir şırınga kullanarak, kuyruk venlerinden birine bir kateter yerleştirin ve bandajla sabitleyin; metot protokolüne göre önceden toplanmış ve DII ile etiketlenmiş eritrositleri kullanarak, pulmoner pencere oluşturmak için sıçanın kuyruk venine 300 µL enjekte edin.Göğsün kanserli tarafında bir insizyon yapın ve küt diseksiyon kullanarak cildi ayırın. Üst üste binen iki kas tabakasını disseke edin ve altıncı ve yedinci kaburga bölgesindeki interkostal kasları sağlam bırakın. Osteotomi gerçekleştirmek için göğüs boşluğunda yaklaşık 1,5 santimetre çapında bir perforasyon oluşturun.Akciğer yüzeyi ile göğüs kafesi arasındaki mekanik etkileşimin minimize edilmesi için ventilatördeki inspirasyon basıncını ayarlamaya başlayın. Kesilecek kaburgayı sıkıca tutmak için bir diş cerrahi penseti ve cerrahi makas kullanarak altıncı ve yedinci kaburgaların bölümlerini çıkarın. Kaburganın medial tarafını, keskin kenarı dışa bakacak şekilde yaklaşık 45 derecelik bir açıyla kesin.Kemiğin lateral tarafını benzer şekilde, yine sivri tarafı dışarıda kalacak şekilde kesin. Akciğerin zarar görmesini önlemek için, interkostal kasları kesmeden önce osteotomiyi bitişik kaburga ile tekrarlayın ve eksize edilen parçayı çıkarın. Bir lamel camı pleksiglas bir yuvaya tutturmak için yapıştırıcı veya az miktarda vakum gresi kullanarak özel yapım uzun bir pencere oluşturun.Ardından, gerekirse bir taraftaki deliği genişleterek, yüzey metastazları pencerenin merkezine yakın olacak şekilde pencereyi yerleştirin. Soketi perforasyona yerleştirip akciğerin visseral pleurası ile doğrudan temas sağladıktan sonra, pencere çerçevesinin kenarlarını çevreleyen interkostal kasa dikmek için dört sıfır monofilaman sütür kullanın. Rezidüel havanın çıkmasına yardımcı olmak ve bir sızdırmazlık sağlamak için ventilatördeki inspirasyon basıncını artırın.Ardından, hayvanı Z yönündeki hareketi engellemek için özel olarak tasarlanmış bir sabitleyiciye yerleştirin ve floresan mikroskobu altında ısıtmalı bir çelik plaka üzerine konumlandırın. Daha sonra, hayvanın vücut sıcaklığını kontrol etmek için rektal bir termistör yerleştirin. Yanal hareketin optimal kontrolünü sağlamak için hayvan sabitleyicisinin vidalarını ve ventilatördeki inspirasyon basıncını ayarlayın.Görüntüleme ve mikro sirkülasyon kan akışı ölçümleri için. -40 °C çip soğutma sıcaklığında bir CCD kamera ve 10x objektif kullanın. Standart rod Domine Trit C filtre setleri ile, elde edilen görüntü dizilerinin gerçek kare hızını ve piksel çözünürlüğünü kaydedin.Görüntüleme oturumu sırasında hayvandaki sıvı kaybını gidermek için akış hızının başarılı bir şekilde analiz edilmesini sağlamak amacıyla her yığın başına en az 200 görüntü kaydedin. Kan akış hızını sabit tutmak için her saat başı yaklaşık bir mililitre salin ile intraperitonal enjeksiyon yapın.Görüntüleme tamamlandıktan sonra hayvanı metin protokolüne uygun olarak sakince uyutun. Solid tümörlerdeki vaskülarizasyonun normal kan akışından önemli ölçüde farklı olduğu, daha yüksek derecelerde tortuozite ve daha geniş intervasküler mesafeler sergilediği bilinmektedir. Buna göre, burada gösterildiği gibi, deneysel pulmoner meme kanseri ve metastazlarındaki kan akış izleri, normal mikrosirkülasyon ile karşılaştırıldığında düzensiz şekillere ve geniş intervasküler boşluklara sahiptir.Bu çalışmada, sağlıklı akciğerlerde gösterilene benzer şekilde, efedrin ve endotelin reseptör antagonisti kombinasyonu ile dozajlama, fare sarkomunda kan akış hızını artırmıştır. Her bir veri noktası, beş hayvandan elde edilen veriler üzerinden ortalaması alınan, beş dakikalık aralıklarla yapılan üç ölçümün birleştirilmiş bireysel ortalamalarını temsil etmektedir. İlk enjeksiyon, tümör bölgesindeki kan akış hızını 0,61 ± 0,12 mm/s değerinden 0,74 ± 0,19 mm/s değerine anlamlı şekilde artırmıştır.İkinci enjeksiyon ise yüksek akış hızını 0,74 ± 0,19 mm/s seviyesinde tutmuştur. Bu prosedür uygulanırken, göğüs kafesi kesilirken belirgin sivri yapıların oluşmasını önlemeye dikkat etmek önemlidir; çünkü bu durum, işlem sonrası akciğerde yaralanmaya ve kanamaya yol açacaktır. Bu teknik, pulmoner metastaz araştırmaları alanındaki araştırmacıların; difüzyon, sitotoksik ilaç iletiminin kısıtlanması, difüzyon kısıtlı hipoksi ve sıçan tabanlı akciğer metastazı modelleri gibi anti-kanser ilaç geliştirme ile ilgili uç noktaları keşfetmelerine olanak sağlamıştır.Bu videoyu izledikten sonra, sıçanın metastaz içeren veya sağlıklı akciğerine cerrahi erişimin nasıl sağlanacağı ve üzerinde mikroskobik görüntülemenin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

automated-measurement-microcirculatory-blood-flow-velocity-pulmonary

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Fizyolojik anjiyogenez ve yoksun Normal erişkin vaskülarize memeli doku çalışma için kullanılan cerrahi müdahaleye maruz kalmamış: (i) başlatılması ve test ajanların intraperitoneal uygulanması aşağıdaki anjiyogenez geliştirilmesi; ve sistemik uygulanması aşağıdaki (ii) anjiyogenez değişiklik Test ajanlar seçilir.

Rat mezenter Anjiyogenez Testi

Hipoksik pulmoner vazokonstriksiyon (HPV), alveolar hipoksi akciğer perfüzyonunun ventilasyonla eşleştiği önemli bir fizyolojik olgudur. HPV'ye katkıda bulunan başlıca vasküler segment, intra-acinar arterdir. Burada, 20-100 μm çapındaki murine pulmoner damarların HPV analizi için protokolümüzü açıklıyoruz.

Murine Hassas Kesim Akciğer Dilimleri Kullanılarak Pulmoner Arterlerin Hipoksik Pulmoner Vazokonstriksiyonunun Videomorfometrik Analizi

İzole edilmiş perfüze akciğer kan hazırlama akciğer yüzeyindeki mikro damar ağları görselleştirmek için bu mümkün kılar. Burada, gerçek zamanlı flüoresan görüntüleme kullanılarak izole edilmiş akciğerlerde bir mikro damarların geçirgenliğini ölçmek için bir yaklaşımı tarif eder.

İzole Kan-perfüze Sıçan Akciğer Hazırlık Tek Mikrodamar Geçirgenliği miktarının

Modifiye edilmiş Landis tekniği, mikroperfüzyon teknikleri kullanılarak kontrol ve test koşulları altında normal ve genetik olarak modifiye edilmiş sıçanların mezenterindeki tek tek mikro damarların hidrolik iletkenliğinin eşleştirilmiş ölçümünü sağlar. Fizyolojik koşullar altında mikrodamar geçirgenliğini ve transvasküler değişimi düzenleyen mekanizmaları değerlendirmek için uygun bir yöntem sağlar.

Şekilde, mikro Tekniği Sıçan mezenter mikrodamar geçirgenliği Yönetmelik Araştırma

Bu el yazması, tümör hipoksisinin metastaz üzerindeki etkilerinin doğrudan test edilmesine ve etki mekanizmalarının deşifre edilmesine izin veren bir hayvan modelinin geliştirilmesini açıklamaktadır. Burada açıklanan deneyler Ewing sarkomuna odaklansa da, benzer bir yaklaşım diğer tümör tiplerine de uygulanabilir.

Tümör metastaz üzerinde Hipoksi Test Etkisinin Vivo Modeli

Burada, septal arter kanüle edildiği ve basınçlandırıldığı için kılcal yataklar ve perisitler de dahil olmak üzere damar ağacı bileşenlerinin yanı sıra basıncı koruyan arteriyel perfüzyon basıncının ve akışının eks vivo izlenmesi ile canlı murine kalp dokusundaki koroner mikrositülasyonu incelemek için bir protokol sunulmaktadır.

Fare Kalbinde Kılcal Damarlar, Arterioles ve Perisitlerin Dinamik Ölçümü ve Görüntülenmesi

Burada, akciğerin yüksek çözünürlüklü, intravital görüntülemesini sağlayan murine toraks için kalıcı olarak indwelling optik pencerenin cerrahi implantasyonu için bir protokol sunuyoruz. Pencerenin kalıcılığı, akciğerdeki dinamik hücresel süreçlerin, özellikle de yayılan tümör hücrelerinin metastatik ilerlemesi gibi yavaş gelişen süreçlerin incelenmesine çok uygun hale getirir.

Akciğere Kanser Metastazını Araştırmak İçin Kalıcı Bir Pencere

Bu protokol, ışık tabakası floresan mikroskobu kullanılarak kantitatif tam montajlı üç boyutlu vasküler görüntüleme için hızlı bir yöntem sunar. Yöntemin etkinliği, civciv embriyo modelinin faringeal ark arter sistemi kullanılarak, hesaplamalı akışkanlar dinamiği yoluyla ölçülen hemodinamik kuvvetler ile gösterilmiştir.

Kantitatif Çalışmalar için Küçük Hayvan Damar Sisteminin Hızlı Tam Montajlı Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Protokol, farelerde akciğer arter basıncını tespit etmek için doğru kalp kateterizasyon yönteminin kullanılması deneyimine ayrıntılı bir giriş sunar; bu da doğru veri elde edilmesine ve deneyin başarı oranını artırmaya yardımcı olur. Bu yöntem, farklı laboratuvarlarda deneylerin tekrarlanabilirliğini de artırır.

Sağ kalp kateterizasyonu kullanılarak sıçanlarda pulmoner arter basıncının ölçülmesi

Endotelyal endotel / glycocalyx yüzey tabakası ideal intravital mikroskobu kullanılarak incelenmiştir. Intravital mikroskop teknik gibi akciğer gibi hareketli bir organ zordur. Biz eş zamanlı aydınlık ve floresan mikroskop serbestçe-hareket eden endotel yüzey tabakasının kalınlığını belirlemede nasıl kullanılabileceğini...

Fare Pulmoner Endotelyal Yüzey Katman in vivo ölçümü olarak

Keşfedin sıçanlarda pulmoner metastazlarda mikrosirkülasyon kan akış hızını otomatik ölçüm yöntemini. Kapalı göğüs intravital mikroskopi ile tümör mikroçevresini gerçek zamanlı inceleyin.

Sıçan Pulmoner METASTAZLARINDA Mikrosirkülasyonda Kan Akışı Hızının Otomatik Ölçüm

Daha fazla video keşfet