Fare Modeli Inferior Vena Cava İnterpozisyon Greft İmplantasyonu

Bu işlemin genel amacı, doku mühendisliği yapılmış vasküler greftlerde neo doku oluşumu ve stenoz gelişiminin hücresel ve moleküler mekanizmalarını araştırmaktır. İlk olarak, biyolojik olarak parçalanabilen boru şeklindeki iskeleler, poliglikolik asit dokunmamış keçe örgünün bir epsilon kapaklı lakton ve L laktid kopolimeri ile kaplanmasıyla monte edilir. Sonraki adımlar, kemik iliğini hasat etmek ve mononükleer hücreleri yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile izole etmektir.

Daha sonra yaklaşık 1 milyon hücre iskele üzerine ekilir ve gece boyunca kuluçkaya yatırılır. Son adım, tohumlanan iskeleyi inferior vena kava interpozisyon grefti olarak implante etmektir. Sonuç olarak, sonuçlar immünohistokimya yoluyla doku mühendisliği yapılmış vasküler greftte hücre infiltrasyonunu ve hücre dışı matriks birikimini gösterebilir.

Bu tekniğin çıkarımları, stenoz ve doku mühendisliği yapılmış vasküler greftlerin oluşumuna neyin neden olduğunu daha iyi anlamak ve daha sonra bu bilgiyi daha iyi bir doku mühendisliği vasküler greft tasarlamak için kullanmaktır. Klinik çalışmamızdan, doku mühendisliği kanalını alan hastaların yaklaşık dörtte birinin daralma geliştirdiğini öğrendik. Amacımız bu sorunu ortadan kaldırmaktır.

Bu yöntem konjenital kalp hastalığına uygulanabilmesine rağmen, kolon baypas ameliyatına veya alter venöz özellik için kondüksiyona da uygulanabilir. Genellikle bu yöntemle yeni tanışan kişiler, ven ozmozu sırasında gerekli olan ince mikrocerrahi teknikler nedeniyle zorlanıyorlardı. Bu yöntem için ilk olarak, insan klinik çalışmamızda kullanılan doku mühendisliği vasküler greftlerde yeni doku oluşumunu ve stenoz gelişimini önlemenin yollarını karakterize etmenin daha iyi bir yolunu ararken aklımıza geldi.

İlk olarak, epsilon kapaklı lakton ve L Laktid kopolimerini karıştırmaya başlayın. Bunun tamamen çözülmesi 60 ila 90 dakika sürer. Bu arada, dondurucudan bir poliglikolik asit tabakası alın ve ondan birkaç beşe sekiz milimetrelik bölüm kesin.

Ardından, filtreyi 10 mikrolitrelik bir pipet ucundan kesin ve distal ucuna 19 gauge bir iğne sokun. Forseps kullanarak, iğnenin etrafına bir parça poliglikolik asit keçesi sarın. Ardından, körelmiş 18 gauge bir iğne kullanarak, keçeyi 19 gauge iğnenin etrafındaki pipet ucunun distal ucuna dikkatlice itin.

Kopolimer çözeltisi hazır olduğunda, poliglikolik asit keçesini çözelti ile doyurmak için pipet ucunun üstüne 40 mikrolitre yükleyin. Tüm hava kabarcıkları çıkana kadar hava kabarcıklarını bir pipetleyici ile dışarı itin. Hazırlanan tüm greftleri iğne başları aşağı gelecek şekilde 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 20 dakika boyunca eksi 80 santigrat derecede bekletin.

Daha sonra greftleri 24 saat boyunca vakum altında liyofilize edin. Ertesi gün tüplerin kapağı açıkken greftleri iğnelerden izole edin. Dört ila beş milimetrelik temiz bir bölüm için greftin her iki ucunu da kesin.

Daha sonra bu greftleri iğnelerinin etrafına geri kaydırın, böylece şekillerini korurlar. Grefti kurumuş bir yerde saklayın ve hücrelerle oturmadan önceki gece saklayın. Bunları ötenazi uygulanmış bir fareden alınan bir biyogüvenlik başlığında UV ışığı altında saklayın.

Tüm femurları ve tibiaları 10 mililitre RPMI ile bir tabağa toplayın, her iki ucunu da her kemikten kesin. Ve ikinci bir tabakta, 25 gauge bir iğneden tüm kemiklere RPMI enjekte ederek iliği yıkayın. Toplam üç mililitre RPM kullanın.

RPMI'deki tüm kemik iliğini 15 mililitrelik tek bir tüpte topluyorum ve toplam hacmi beş mililitre yapmak için tabağı iki mililitre RPMI ile duruluyorum. Bu koleksiyondaki hücreleri sayın. Daha sonra, 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne beş mililitre fial yükleyin ve yavaşça beş mililitre kemik iliği ile doldurun.

RPMI ile daha sonra tüpü 30 dakika boyunca 528 G'de ve 24 santigrat derecede döndürün. Mononükleer hücreleri içeren tüpten orta tabakayı toplayın. Bu katmanı PBS'de bire bir seyreltin.

Hücre çözeltisini aşağı doğru döndürün ve peleti beş mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Ardından dönüşü tekrarlayın. Hücre peletini yaklaşık 200 mikrolitre RPMI ile seyreltin ve hücreleri iki kez sayın.

Greft için 10 mikrolitre RPMI başına 1 milyon hücreye konsantre etmek için ortalama değeri kullanın. Altı ila sekiz haftalık bir C 57 siyah altı dişi kullanın. Fareyi tartın ve anestezi öncesi analjezik olarak ketoprofen uygulayın.

Daha sonra daha düşük bir kadran enjeksiyonu ile uyuşturun. Anesteziyi bir ayak parmağı tutamıyla onayladıktan sonra, karın kıllarını kırpın, gözleri yağlayın ve fareyi steril poli astarlı bir havluyla sarılmış bir ped üzerine ameliyat için konumlandırın. Cerrahi alanı üç alternatif betadin ve alkol fırçası ile silin.

Ardından fareyi örtün ve sadece karın bölgesini açıkta bırakın. Ameliyata orta hat laparotomisi ile başlayın. Ksifoidin altından supra kasık bölgesine bir kesi yapın.

Daha sonra, bağırsakları tuzlu suyla nemlendirilmiş bir gazlı bezle değiştirin ve sarın. Daha sonra infrarenal aort ve vena cva'dan berrak dokunun künt bir diseksiyonunu yapın. Aort ve vena cva'nın distal taraflarını ve proksimal taraflarını klempleyin.

Sıkıca kenetlendikten sonra iki kabı ayırın. Şimdi implantasyona devam edin. Şimdi vena cva'yı kesin ve gerekirse abdominal aort dallarını 10 düğümlü monofilament ile bağlayın.

İmplantasyon boyunca transektten önce konik iğneler üzerine dikiş. Trombozu önlemek için grefti sık sık heparin solüsyonu ile yıkayın. Greftin her iki tarafındaki ilk iki dikiş, tüm sürecin en önemli adımlarıdır.

Dikkatli bir şekilde yerleştirilmediklerinde, IVC'nin ön ve arka katmanlarını ayırmak zordur. Katmanlar net bir şekilde tanımlanmazsa, yanlışlıkla birbirine dikilme olasılığı daha yüksektir. Fazla greft materyalini kesin ve grefti her iki ucunda dikişlerle sabitleyin.

10 t kullanarak dört veya beş dikiş ekleyin. Greftin ön tarafı boyunca dikiş. Ters çevirin ve implantasyon tamamlandıktan sonra arka taraf boyunca da aynısını yapın.

Proksimal klempi çıkarın ve kanamayı emilebilir bir hemostat ajanı ile kontrol edin. Kanama tamamen bittiğinde distal klempi çıkarın ve kanama kontrolünü tekrarlayın. Hayvandan önce greftten kan aktığından emin olun.

Altı au siyah poli akrilamid monofilament sütür kullanarak. Cildi iki kat halinde kapatın. Şimdi dehidrasyonu önlemek için deri altına yarım mililitre salin enjekte edin.

Ardından, fareyi sıcak bir ped ile bir kurtarma kafesine aktarın: Ambulatuvar olduğunda, fareyi ev kafesine aktarın ve 48 saat boyunca ibuprofen sağlayın. İskelenin bir SEM'i, iç çapın yaklaşık bir milimetre ve duvar kalınlığının yaklaşık 0.17 milimetre olduğunu göstermektedir. İskelenin gözenekliliği %78.5 ve ortalama gözenek boyutu 45 mikron idi.

İmplantasyondan hemen sonra, doku mühendisliği yapılmış vasküler greft mikroskop altında görüntülendi. İki hafta sonra tekrar görüntülendi. Hala formunu korudu.

Greftin bozulduğu ve yavaş yavaş yeni doku ile değiştirildiği açıktır. İki hafta boyunca, hücre tohumlama, aslında greft açıklığını %25 oranında iyileştirdi, greft histolojik analiz için çıkarıldı. H ve d boyaması, iskele boyunca neo doku, kalp ve mason lekesi ortaya çıkardı.

Trireme intimal tabakalarda elastin ve medial tabakalarda kollajen gösterdi. CD 31 boyamasında inal tabakada endotel hücre astarı ortaya çıktı. Alfa SMA boyama, greftin aynı zamanda birleşik düz kas ile doldurulduğunu gösterdi.

F four 80 boyamada görüldüğü gibi makrofaj infiltrasyonu bile belirgindi. Bu videonun sonunda, kemik iliğinden türetilmiş mononükleer hücreleri izole etmek ve bunları iskeleye tohumlamak için küçük ölçekli biyolojik olarak parçalanabilen bir iskele üretme yöntemleri de dahil olmak üzere, küçük ölçekli bir doku mühendisliği yapılmış vasküler greftin nasıl üretileceğini daha iyi anlamış olmalısınız. Ve son olarak, doku mühendisliği yapılmış vasküler grefti aynalama modelinde implante etmek için mikrocerrahi teknikleri kullanma yöntemlerini size göstermeliyiz.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik 30 ila 45 dakika içinde yapılabilir. Koroner arter baypas cerrahisi için doku mühendisliği yapılmış vasküler greftlerin gelişimini araştırmak için aort yorumlama, greft implantasyonu gibi diğer yöntemler daha sonra gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denemek önemli olsa da, akut trombozu önlemek için cerrahi alanı nemli tutmayı ve grefti sık sık yıkamayı unutmamak önemlidir, bu teknikler doku mühendisliği alanındaki araştırmacıların tırnak dokusu oluşumunu ve doku mühendisliği vasküler greftte darlığın önlenmesini araştırmalarının yolunu açmıştır.