Davranış Deneyim ardından Beyin Örneklerden Deşifre Dynamics Kapsamlı Analizi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, davranışsal deneyim sonrası farelerin transkripsiyonel dinamiklerini ve belirlenmiş beyin çekirdeklerini incelemektir. Bu işlem, öncelikle hayvanların alıştırılması ve salin enjeksiyonundan sonra lokomotor aktivitelerinin kaydedilmesiyle gerçekleştirilir. Hayvanlar alıştıktan sonra, tek doz kokain sonrası lokomotor aktivite kaydedilir, ardından nucleus accumbens'ten örnekler toplanarak RNA izolasyonu ve cDNA hazırlama işlemleri için kullanılır.

Ardından, davranışla tetiklenen gen ekspresyonunu incelemek amacıyla qPCR analizi gerçekleştirilir. Nihayetinde, kokain deneyimini takiben transkripsiyonel dinamikleri gösteren sonuçlar elde edilir. Protokolü; laboratuvar yöneticisi Dr. Hatu, laboratuvardan lisansüstü öğrencisi Dum Muer ve laboratuvardan lisans öğrencisi Duran, üç ardışık gün boyunca uygulamalı olarak gösterecektir. Her fare, tutma ve enjeksiyon prosedürlerine alıştırılır; fareler, deney başlatılmadan önce kafeslere yerleştirilir, böylece farelerin gelecekte kafesler arası transferi yapılmaz ve fareler asla uzun süre yalnız bırakılmaz.

Test başlangıcından 30 dakika önce, hayvanların ortama alışmasını sağlamak amacıyla tüm test kafesleri davranış odasına taşınmalıdır. 250 microliters serum fizyolojik intraperitoneal enjeksiyonunu uygulayın; enjeksiyonun hemen ardından fareyi, lokomotor aktiviteyi 15 dakika boyunca izlemek için bir davranış odasına yerleştirin. Fare, davranış odasında 20 dakika boyunca tutulabilir.

İkinci ve 17. dakikalar arasında izlenen bir aktivite. Bu adımları sonraki iki gün boyunca günün aynı saatinde tekrarlayın. Dördüncü günde, gruba bağlı olarak tek bir doz kokain veya salin enjekte edin ve fareyi hemen hazneye yerleştirerek, kokain maruziyetini takiben seçilen zaman noktalarında 20 dakika boyunca lokal motor aktiviteyi izleyin; ardından beyni çıkarıp soğutmak ve sertleştirmek için bir ila iki dakika boyunca buz gibi soğuk A CSF çözeltisine yerleştirin.

Serebellum çıkarıldıktan ve fazla sıvı emildikten sonra, beyni rostral kısmı yukarı bakacak şekilde bir vibram tablasına yapıştırın. Hazneyi buz gibi soğuk A CSF ile doldurun ve nucleus accumbens net bir şekilde tanımlanana kadar 200 mikronluk kesitler alın. Kesim işlemi sırasında corpus callosum'un şekline, anterior komissürün ve ventriküllerin konumuna ve şekline dikkat edin.

Doğru bölge belirlendikten sonra, nucleus accumbens'in bir stereoskop altında diseke edileceği 400 mikron kalınlığında iki kesit alın. Nucleus accumbens'i kesitlerden ayırmak için ince bir bıçak kullanın. Doğru bölgede bıçakla yapılan dört hızlı geçiş, uygun dokuyu anında izole etmelidir.

İzole edilen dokuyu 900 µL lizis reaktifi içine yerleştirin ve RNA ekstraksiyonuna kadar -80 °C'de saklayın; ekstraksiyona başlarken tüpleri 37 °C'de çözdürün ve homogenize edin. 25 gauge iğne kullanırken, ilk birkaç tur zor olabilir ve dokuyu küçük parçalara ayırarak homogenize etmek için tüp çeperine doğru itmek gerekebilir. Uygun homogenizasyonu sağlamak için lizatı bir kaya shredder mini spin kolonuna pipetleyin ve santrifüjleyin.

Lizatı yeni bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin ve üreticinin talimatlarına göre RNA'yı ekstrakte edin. RNA saflaştırmasının ardından, cDNA'ya ters transkripsiyon ile analiz için seçilen gen grubuna yönelik primerler kullanılarak örneklerin hedefe özgü ön amplifikasyonu gerçekleştirilir. Bu prosedürler, protokolün metin versiyonunda açıklanmıştır.

Kapsamlı QPCR analizi için ticari mikroakışkan çipler, 48 örneğin 48 prob setiyle analizine olanak tanıyan 48'e 48 formatında veya 96 örneğin 96 prob ile analiz edildiği 96'ya 96 formatında mevcuttur. Çoğu durumda, çip seçimi öncelikle analiz edilen örnek sayısına bağlıdır.

Öncelikle, deney için seçilen çipe göre numune karışımını hazırlayın. 20 XDNA bağlayıcı boya numune yükleme reaktifini pipetlerken dikkatli olun. Numune karışım çözeltilerini minimum 20 saniye boyunca çalkalayın ve en az 30 saniye boyunca santrifüjleyin.

Hazırlanan reaksiyonlar, çip yüklemeye hazır olana kadar dört derece Celsius'ta kısa sürelerle saklanabilir. Ardından, assay karışımını hazırlayın, örnek karışımını iyice çalkalayın ve tüm bileşenleri çöktürmek için santrifüjleyin. Daha önce gösterildiği gibi, dinamik dizi IFC çipi; örnekler ve assay'ler için girişlerin yanı sıra, mikroakışkan odaları basınçlandırmak için kullanılan kontrol hattı sıvısı için belirlenmiş girişlere sahiptir.

İlk olarak, çip üzerindeki her bir akümülatöre kontrol hattı sıvısı enjekte edin. Ardından, çipi IFC kontrol cihazına yerleştirip uygun betiği çalıştırarak çipi hazırlayın. Betik tamamlandığında, hazırlanmış çipi IFC kontrol cihazından çıkarın ve her bir analizden beş µL pipetleyin.

Çip üzerinde karıştırın. Her bir örnek karışımından beş µL'yi ilgili girişlerine ekleyin ve IFC kontrolör yazılımını kullanarak çipi IFC kontrolöre geri yerleştirin. Örnekleri ve analizleri çipe yüklemek için betiği çalıştırın.

Yükleme karıştırma betiği tamamlandığında, yüklü çipi IFC kontrolöründen çıkarın. Ardından, çipi termal döngüleyiciye yerleştirin ve erime eğrisi analizini içeren yeni bir çip çalışması başlatın. Termal döngüleyici yazılımını kullanarak reaksiyon odalarının doğru şekilde tanındığından emin olun ve reaksiyonun tamamlanmasına izin verin.

Tek bir akut kokain enjeksiyonu sonrası lokomotor aktivitede artış belirginleşmiştir. Bu koronal kesitte, nucleus accumbens sınırlarını belirlemek için yapılan kesilerin yerleri kalın beyaz çizgilerle işaretlenmiştir. Diseksiyon sırasında, c-fos ve phos B'ye yönelik primerlerin amplifikasyon eğrileri, primer çiftlerinin hedef transkriptlerini yaklaşık %100 verimlilikle amplifiye ettiğini göstermektedir.

Her döngüde sonuçlar, nucleus accumbens'te kokainin tetiklediği CFO'lar ve phos B ekspresyonunun, maruziyetten bir ve iki saat sonra en yüksek seviyeye ulaştığını göstermektedir. Bu prosedürün ardından, henüz karakterize edilmemiş yeni transkriptleri tanımlamak amacıyla yeni nesil dizileme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.