Davranış Deneyim ardından Beyin Örneklerden Deşifre Dynamics Kapsamlı Analizi
August 26th, 2014
Bu el yazması, davranışsal paradigmaları takip ederek kemirgenlerin belirli beyin çekirdeklerinde indüklenen transkripsiyonel programların analizi için kapsamlı profilleme uygulayan bir protokolü açıklamaktadır. Burada, bu yaklaşım, mikroakışkan qPCR dizileri kullanılarak, akut kokain maruziyetini takiben farelerin nükleus accumbens'inde (NAc) indüklenen genlerin profillenmesi bağlamında gösterilmektedir.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, davranışsal deneyimi takiben farelerin transkripsiyonel dinamiklerini ve tanımlanmış beyin çekirdeklerini incelemektir. Bu, önce hayvanları alışkanlık haline getirerek ve salin enjeksiyonundan sonra lokomotor aktivitelerini kaydederek elde edilir. Alıştıktan sonra, tek bir kokain dozundan sonra lokomotor aktivite kaydedilir, daha sonra nucleus accumbens'ten örnekler toplanır ve RNA izolasyonu ve CDNA hazırlığı için kullanılır.
Daha sonra, davranış tarafından indüklenen gen ekspresyonunu incelemek için QPCR analizi yapılır. Nihayetinde, kokain deneyimini takiben transkripsiyonel dinamikleri gösteren sonuçlar elde edildi Protokolü gösterenler, laboratuvar yöneticisi Dr.Hatu, laboratuvardan bir yüksek lisans öğrencisi olan Dum Muer ve laboratuvardan bir lisans öğrencisi olan Duran olacak Arka arkaya üç gün boyunca. Her fare, taşıma ve enjeksiyon prosedürlerine alıştırılır, deneyi başlatmadan önce fareleri kafeslere yerleştirir, böylece fareler gelecekte kafesler arasında transfer edilmeyecek ve fareler asla uzun bir süre tecrit altında bırakılmayacaktır.
Testin başlamasından 30 dakika önce, hayvanların çevreye alışmasını sağlamak için tüm test kafesleri davranış odasına aktarılmalıdır. Enjeksiyondan hemen sonra 250 mikrolitre salin intraperitoneal enjeksiyonu uygulayın, lokomotor aktiviteyi 15 dakika boyunca izlemek için fareyi bir davranış odasına yerleştirin. Fare, 20 dakika boyunca davranış odasına yerleştirilebilir.
İki dakikadan 17. dakikaya kadar izlenen bir etkinlik. Sonraki iki gün boyunca bu adımları günün aynı saatinde tekrarlayın. Dördüncü günde, gruba bağlı olarak tek bir kokain veya salin enjeksiyonu uygulayın ve kokain maruziyetini takiben seçilen zaman noktalarında 20 dakika boyunca yerel motor aktiviteyi izlemek için fareyi hemen odaya yerleştirin, beyni çıkarın ve buz gibi soğuk bir yere koyun, Soğuması ve sertleşmesi için bir ila iki dakika boyunca bir BOS çözeltisi.
Beyinciği çıkardıktan ve fazla sıvıyı emdikten sonra, beyni, rostral kısmı yukarı bakacak şekilde bir vibram aşamasına yapıştırın. Hazneyi buz gibi soğuk A BOS ile doldurun ve çekirdek accumbens açıkça tanımlanana kadar 200 mikronluk kesitler kesin. Keserken korpus kallozumun şekline, ön komisürün ve ventriküllerin konumuna ve şekline çok dikkat edin.
Doğru bölge tanımlandıktan sonra, çekirdek accumbens'in bir stereoskop altında kesileceği 400 mikronluk iki bölümü dilimleyin. Nucleus accumbens'i dilimlerden ayırmak için ince bir bıçak kullanın. Bıçağın doğru bölgeye dört hızlı geçişi, uygun dokuyu hemen izole etmelidir.
İzole edilen dokuyu 900 mikrolitre lizis reaktifine yerleştirin ve tüpleri 37 santigrat derecede çözmeye başlamak ve homojenize etmek için RNA ekstraksiyonuna kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. 25 gauge bir iğne kullanarak, ilk birkaç tur zor olabilir ve dokuyu küçük parçalar halinde homojenize etmek için tüpün duvarına doğru itmeyi gerektirebilir. Uygun homojenizasyonu sağlamak için, lizatı bir kaya parçalayıcı mini döndürme kolonuna ve santrifüje pipetleyin.
Lizatı yeni bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin ve RNA'yı üreticinin talimatlarına göre çıkarın. RNA saflaştırmasını takiben, CDNA'ya ters transkripsiyon gerçekleştirilir ve ayrıca analiz için seçilen gen grubuna yönelik primerlerle numunelerin hedefe spesifik preem amplifikasyonu gerçekleştirilir. Bu prosedürler protokolün metin versiyonunda açıklanmıştır.
Kapsamlı QPCR analizi için ticari mikroakışkan çipler 48 x 48 olarak mevcuttur. 48 prob seti ile 48 numunenin analizine olanak tanıyan veya 96 numunenin 96 prob ile analiz edildiği 96x96 formatında. Çoğu durumda, çip seçimi öncelikle analiz edilen numune sayısına bağlıdır.
İlk olarak, deney için seçilen çipe göre numune karışımını hazırlayın. 20 XDNA bağlayıcı boya numune yükleme reaktifini pipetlerken dikkatli olun. Numune karışım çözeltilerini en az 20 saniye çalkalayın ve en az 30 saniye santrifüjleyin.
Hazırlanan reaksiyonlar, çip yüklemeye hazır olana kadar dört santigrat derecede kısa süreler için saklanabilir. Ardından, tahlil karışımını hazırlayın, numune karışımını iyice çalkalayın ve tüm bileşenleri döndürmek için santrifüjleyin. Daha önce gösterildiği gibi, dinamik dizi IFC çipi, numuneler ve tahliller için girişlerin yanı sıra mikroakışkan odaları basınçlandırmak için kullanılan kontrol hattı sıvısı için belirtilen girişlere sahiptir.
İlk olarak, çip üzerindeki her bir akümülatöre kontrol hattı sıvısı enjekte edin. Ardından, çipi IFC denetleyicisine yerleştirerek ve uygun komut dosyasını çalıştırarak hazırlayın. Komut dosyası bittiğinde, astarlanmış çipi IFC kontrol cihazından çıkarın ve her tahlilden beş mikrolitre pipetleyin.
Çipin üzerine karıştırın. Her numune karışımından beş mikrolitre ekleyin, girişlerine ekleyin ve IFC kontrol yazılımını kullanarak çipi IFC kontrol cihazına geri koyun. Örnekleri ve tahlilleri çipe yüklemek için komut dosyasını çalıştırın.
Yük karışımı komut dosyası tamamlandığında, yüklenen yongayı IFC denetleyicisinden çıkarın. Ardından, çipi termal döngüleyiciye yükleyin ve erime eğrisi analizi içeren yeni bir çip çalışması oluşturun. Termal döngüleyici yazılımını kullanarak, reaksiyon odalarının doğru bir şekilde tanındığından emin olun ve reaksiyonun tamamlanmasına izin verin.
Tek bir akut kokain enjeksiyonundan sonra lokomotor aktivitede bir artış belirgindi. Bu koronal bölümde, kalın beyaz çizgiler, nucleus accumbens'in sınırlarını tanımlamak için yapılan kesiklerin yerini işaretledi. Diseksiyon sırasında, CFO'lara ve fos B'ye yönelik primerlerin amplifikasyon eğrileri, primer çiftlerinin hedef transkriptlerini yaklaşık %100 verimlilikle amplifiye ettiğini göstermektedir.
Her döngüde, sonuçlar kokainin neden olduğu CFO'ların ve çekirdek akumbenlerde fos B ekspresyonunun maruziyetten bir veya iki saat sonra en yüksek olduğunu göstermektedir. Bu prosedürü takiben, yeni karakterize edilmemiş transkripti tanımlamak için yeni nesil dizileme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu el yazması, davranış paradigmalarının ardından kemirgenlerin belirli beyin çekirdeklerinde transkripsiyonel programları analiz etmek için bir protokol tanımlamaktadır. Yaklaşım, farelerin akut kokain maruziyeti sonrası akubens çekirdeğinde (NAc) indüklenen genleri profillendirme ile gösterilmektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Davranış analizi
- Gen ekspresyonu profillendirme
Arka Plan
- Transkripsiyonel dinamikler, davranışa yönelik beyin tepkilerini anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Akubens çekirdeği, ödül ve bağımlılıkla ilgili önemli bir bölgedir.
- Kokain maruziyeti, beyindeki gen ekspresyonunu değiştirir.
- Mikrodifüzyonlu qPCR dizileri, ayrıntılı gen profillendirmesine olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Kokain maruziyeti sonrası akubens çekirdeğindeki transkripsiyonel değişiklikleri incelemek.
- RNA izolasyonu ve gen ekspresyon analizi için bir protokol oluşturmak.
- Kemirgenlerde davranışın gen ekspresyonu üzerindeki etkisini anlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Fareleri elle tutma ve salin enjeksiyonu ile alıştırma.
- Kokain uygulaması sonrası lokomotor aktivitenin kaydedilmesi.
- RNA izolasyonu için akubens çekirdeği örneklerinin toplanması.
- Gen ekspresyon değişikliklerini değerlendirmek için QPCR analizi.
Ana Sonuçlar
- Kokain maruziyeti sonrası transkripsiyonel dinamikler gözlendi.
- NAc'de indüklenen belirli genler tanımlandı.
- Protokol, gen ekspresyonunun etkin profillendirilmesini gösterdi.
- Sonuçlar, bağımlılığın moleküler temelini anlamak için katkıda bulunuyor.
Sonuçlar
- Çalışma, davranışsal uyaranlara yanıt olarak gen ekspresyonunu analiz etmek için sağlam bir protokol sağlamaktadır.
- Bulgular, bağımlılık araştırmalarında transkripsiyonel tepkiler hakkındaki bilgiyi artırmaktadır.
- Bu yaklaşım, sinirbilimdeki diğer davranışsal paradigmalara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to quantitatively assess transcriptional dynamics in defined brain regions following behavioral or pharmacological perturbations, supporting target validation in neuropsychiatric drug discovery. By providing reproducible, quantitative gene expression readouts from limited tissue samples, it enhances predictive confidence in early-stage mechanistic studies and informs go/no-go decisions for CNS-targeted therapeutics. The approach is particularly valuable for de-risking hypotheses related to addiction, reward pathways, and behavioral phenotypes prior to investment in lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional programs in nucleus accumbens to validate functional relevance of genes implicated in cocaine-induced behavioral responses.
- Operational Value: Supports robust target hypothesis testing using microfluidic qPCR to quantify gene expression changes with high sensitivity from limited brain tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream screening by establishing baseline transcriptional profiles following acute pharmacological challenge.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through standardized RNA isolation, reverse transcription, and microfluidic qPCR workflows applicable across multiple samples.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant transcriptional readouts in a well-established model of psychostimulant response, supporting biomarker alignment and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by delivering quantitative, multiplexed gene expression data suitable for cross-platform confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven target validation and assay development prior to lead identification efforts in CNS drug discovery programs.
- Discovery Biology: Enables mechanistic interrogation of transcriptional dynamics following behavioral experience, supporting pathway clarification and target de-risking.
- Screening: Generates quantitative, multiplexed outputs that support assay readiness and reproducibility for compound screening campaigns.
- Analytics: Delivers normalized gene expression measurements from microfluidic qPCR arrays, enabling statistical comparison across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Connects acute behavioral responses to molecular signatures in reward circuitry, supporting translational validity in addiction models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable transcriptional profiling platform applicable across diverse behavioral paradigms and pharmacological challenges in neuroscience research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking behavioral phenotypes to defined transcriptional responses in key brain regions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of gene expression analysis through standardized microfluidic qPCR protocols suitable for multi-sample processing.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of CNS targets through mechanistic insight before costly lead optimization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets by providing quantitative evidence of pathway engagement following pharmacological challenge.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience techniques including behavioral testing, brain dissection, and RNA handling.
- Depends on access to microfluidic qPCR platforms and associated instrumentation for high-throughput gene profiling.
- Necessitates standardized protocols for sample collection, RNA isolation, and cDNA synthesis to ensure cross-experiment consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different brain regions, species, or behavioral paradigms beyond cocaine-induced nucleus accumbens responses.
- Practical limitations include tissue yield constraints from small brain nuclei and the need for careful normalization to account for sample variability.
