Name: Davranış Deneyim ardından Beyin Örneklerden Deşifre Dynamics Kapsamlı Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Öğrenin farelerde kokain maruziyeti sonrası nükleus akumbens'te transkripsiyonel dinamikleri analiz etmek için qPCR yöntemini. Bu protokol davranışsal nörobilim ve bağımlılık araştırmalarında gen ifadesi değişikliklerini incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı Hibesi (ISF # 393/12), İsrail Araştırma Mükemmeliyet Merkezleri Hibesi (I-CORE 1796/12), Alman-İsrail Vakfı Hibesi (GIF # 2299-2291.1/2011) ve Marie Curie Kariyer Entegrasyon Bursu (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201) tarafından finanse edilmiştir. Projedeki ilk adımlar, AC'ye yapılan bir AXA doktora sonrası bursu ile finanse edildi. Edmond ve Lily Safra Beyin Bilimleri Merkezi tarafından sağlanan cömert başlangıç fonlarını takdir ediyoruz.
Citri laboratuvarı üyeleri tarafından yapılan eleştirel okuma büyük beğeni topluyor.

NOT: Protokol Kudüs İbrani Üniversitesi hayvan bakım yönergeleri takip eder. ACSF Çözüm 1. Hazırlık <ol><li> Su ya da uygun bir NaCI ilavesiyle ~ 300 mOsm / L ozmolarite getiren, Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi. ACSF çözelti hazırlayın GKD 2 O 1 L (&gt; 18 M saflık) konur. </li></ol> 2. Ekipman ve Oda Kurma Kokain kaynaklı lokomotor davranış izlenmesi için donatım bir iç ışık kaynağı, fan ve kamera (veya kızılötesi sensörler) ile kablolu davranış odaları (50 x 45 cm) oluşur ve bir iç pleksiglas kutu (30 x 30 cm) olarak ile donatılmıştır bu fareler, lokomosyon takip edilmektedir serbestçe dolaşımına izin verildi. Davranışsal testler normal bir aydınlık / karanlık döngüsünde, ışık önce 1 saat için ışıkları sonra 1 saat arasında kapalı yapılmalıdır. Hayvanlar her gün aynı zamanda sürekli olarak eğitilmesi gerekmektedir. <ol><li&gt; Izleme ve farelerin lokomotor davranışını kayıt için uygun bir sistem fotoğraf makinesi veya kızılötesi sistemi bağlayın. </li><li> Koku işaret önyargı önlemek ve uygun dezenfeksiyon sağlamak için, fare imkan ve / veya koku kaldırarak ayıracı tarafından sağlanan dezenfektan ile her deneme sonrasında odaları temizleyin. </li></ol> ÖNEMLİ: tutarken farenin, sessiz, sakin ve dikkatli olun. 3. Hayvan Hazırlık <ol><li> Evi 5 C57BL6 erkek fareler; standartlara ve yerel Animal gereklerine göre, 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü ve yiyecek ve su ücretsiz erişim ile bir odada kafes başına (6-12 haftalık ağırlığı ~ 25-35 gr), Komite rehberlik ve protokolleri önemsiyorum. Deney başlamadan önce, fareler tartmak ve veri giriş. Kokain sonra farelerin ağırlığına göre tatbik edilmektedir. </li><li> İlk deneme başlamadan önce davranışsal oda 30 dakika içine fare içeren tüm kafesleri aktarın. </li><li> Her alıştırmakDeneyde kullanılan farenin, enjeksiyonları taşıma ve davranış kurulumunda izlenmesi deneyci. , Aşağıda tarif edildiği gibi 250 ul tuz çözeltisi, 3 günlük ardışık intraperitonal enjeksiyon ile elde edilir. </li><li> 250 ul serum fizyolojik intraperitoneal uygulayın. Enjeksiyondan hemen sonra, 15 dakika boyunca lokomotor aktivitesini izlemek için bir davranış odasına fare. Her gün aynı saatte, 3 gün üst üste bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Dördüncü gün, iki gruba fareler bölmek. Tuzlu su içinde 2 mg / ml kokain bir stok çözelti hazırlayın. (- 30 gr fare 300 ul alacaksınız ise, 250 ul enjekte 25 g fare için örneğin) fare ağırlığına göre deney grubuna kokain solüsyonu (son 20 mg / kg) tek bir enjeksiyon yönetmek. Kontrol grubuna tuzlu su uygulayın. Enjeksiyondan hemen sonra, lokomotor aktivite izleme (konan tipik bir davranış odası içinde 20 dakika boyunca fare yermüttefiki, ilk 15 dk) izlenmektedir. </li><li> Kokain enjeksiyonundan sonra farklı zaman noktalarında (enjeksiyonu takip eden 0, 1, 2, 4, 8 ve 24 saat) fareler kurban. Önemlisi, referans farenin (0 zaman noktası) Bu gün herhangi bir enjeksiyon almazsınız emin olun. Nedeniyle önemi, bu referans grubunun çoğaltır dahil etmek zorunludur. </li></ol> Nucleus accumbensde 4. Diseksiyon <ol><li> Kokain / tuzlu su enjeksiyonundan sonra uygun bir zamanda fareler izofluran ile anestezi. Izofluran direkt odadan dışarı tahliye edilmelidir. Bu nedenle, işlem, bir kimyasal buhar başlığı içinde yapılmalıdır. </li><li> Arka ayak refleks testi ile anestezi derinliği izlemek. Hayvan tarafından bir geri çekme yanıtı ortaya çıkarmak için pençe sıkıştırın. Bir refleks gösteren, bir hayvan anestezi cerrahi seviyesinde ve bir devlet euthanize değildir. </li><li> Beynin Ekstraksiyon: <ol><li> Dekapitasyon yoluyla fare öldürülür. </li> &lt;li&gt; kafatasının merkezi üzerinde deri çıkarın ve keskin bir makas ile kafatası kesti. </li><li> Omurilik beyin (foramen magnum) girdiği noktada makas yerleştirin ve iki yan keser. </li><li> Aynı noktadan, sagital sütür boyunca uzun bir sagital kesim yapmak. Sola ve sağa koku ampul, klip ulaştıktan sonra. </li><li> Bir forseps, üzerine basın veya beyin zarar vermemeye özen sıkıca kafatasının her yarısını tutup yanına çekerek, dikkatlice kafatası çıkarın. </li><li> Ters bir mikro kaşık spatula ile kranial sinirler kesilmesinin ise beyin çıkarın. </li></ol></li><li> Soğuk ve sertleşmeye 1-2 dakika için bir buz-soğuk çözelti içinde ACSF beyin yerleştirin. </li><li> Rostral parçası Vibratome sahneye, yukarı bakacak şekilde, ACSF beyin çıkarın kağıt havlu ile fazla sıvıyı fitilieyeceklerdir, beyincik ve beyin geri kalanı arasında bir koronal kesim oluşturmak ve beyin tutkal. </li><li> NAC Kesme: <ol&gt; <li> Vibratome dilimleme odasında buz soğuk sıcaklıklarda ACSF çözümler koruyun. Nukleus accumbensde (NAC) kadar 200 mikron en bölümünde açıkça Paxinos ve Franklin Fare Beyin Atlas (bregmaya yaklaşık 1,8 mm anterior göre belirlenmiştir; korpus kallosum, ön komissürün yeri ve şekli şekline dikkat ve ventriküller, aynı zamanda beyin kesitinin genel morfolojisi). Bu noktada, NAC disseke edileceği iki 400 mikron bölümleri oluşturmak. </li><li> Stereoskop altında, dilimlerden NAC bölgeyi incelemek için ince bir bıçak kullanın. NAC tanımı Paxinos ve Franklin fare beyin atlas göre ve uygun doku üzerinde bıçağın dört çabuk geçer tarafından uygun bölümlerde disseke edilebilir. (Şekil 2). </li><li> Hemen NAC bölümler mikrosantrifüj tüp ve mağaza 900 ul Trizol parçalama reaktifi -80 ° C&#39;de RNA ekstra ha kadar yerleştirineylemi. </li></ol></li></ol> 5. RNA Ekstraksiyon ve cDNA Ters Transkripsiyon <ol><li> Çekirdeğini içeren tüpler oda sıcaklığında Trizol liziz reaktif maddesi bölümleri akumbens çözülme ve doku, tamamen homojenize (en az 15-20 kat) altında olana kadar 25 G iğne bağlı 1 ml&#39;lik şırınga ile homojenleştirin. İlk birkaç tur zordur ve iğne ucu girebilir küçük parçalara kırmak amacıyla tüpün duvarına karşı doku itme gerektirir. </li><li> Homojenliği sağlamak için, 1 dakika için 12,000 xg&#39;de QIAshredder küçük spin kolon ve santrifüj içine lizat pipetleyin. </li><li> Pipet yeni mikrosantrfuj tübüne lizat ve üreticinin talimatlarına uygun olarak RNA ekstrakte edin. Kullanılana kadar -80 ° C&#39;de RNA saklayın. </li><li> , RNA konsantrasyonunun ölçülmesi, bir Bioanalyzer veya eşdeğer ekipman kullanarak bütünlüğünü ve kalitesini analiz. R ile cDNA hazırlanması her tur için 100-500 ng RNA kullanınandom heksamer primerleri. </li></ol> 6. Primer Tasarım ve Astar Testi <ol><li> İyi astar seçimi: mRNA QPCR için optimal bir primer çifti için, bu gereksinimleri (Şekil 3) izleyin: <ol><li> 17-28 bazdan daha artık içeren Tasarım astarlar. Onlar mispriming teşvik gibi nükleotid tekrarlar kaçının. </li><li> 56-68 ° C (optimal olarak 60-64 ° C) arasında erime sıcaklığı (Tm) ile tasarım astarlar. Primer çifti olan Tm birbirinden 1 ° C arasında olması gerekir. </li><li> Ürün boyutu ideal 80 ve 150bp arasında olması gerektiğini unutmayın. </li><li> Genomik DNA, kirletici yükselmesini önlemek için, primerlerden en az biri, bir ekson-ekson bağlantısını kapsamaktadır, ya da amplikon (intron kapsayan), büyük bir intronu içerdiğinden emin olun. </li><li> Astar tasarımını geliştirmek için (örnek için bakınız Tablo 2) Primer3 dayalı güvenilir bir yazılım kullanmak. </li></ol></li><li> Pr Testimers: primerlerin özgünlüğünü ve verimlilik sağlamak amacıyla, bir kontrol QPCR Reaksiyon yapılmalıdır: <ol><li> (Tüm ilgili primer çiftleri için cDNA şablonu ihtiva eden) pozitif bir örneğini kullanabilir ve cDNA titre (örneğin 10 ng ~ bir başlangıç ​​konsantrasyonunda, sekiz üç-kat seyreltme) çift paralel reaksiyonlarda. Reaksiyon için kullanılan çözeltiler içindeki kirlenme kontrol eden herhangi bir şablon kontrol, içerir. </li><li> (- 1 / eğim) -1 10 () x 100, uygun eğim eğrisi gibi olduğu - 3.333 (örneğin, 10 (1 - / 3.333) = 2) (Şekil 4): aşağıdaki formül kullanılarak astar verimi olarak hesaplanır. </li><li> Amplifikasyonun özgüllüğünün belirlenmesi. Spesifik amplifikasyon ise hedef dışı amplifikasyon açık bir sapma fr olarak görünür, amplifiye edilmiş ürünlerin erime eğrilerinin her ortak tek bir önemli zirve ile ortaya konmuşturtek bir büyük zirve om. </li></ol></li></ol> 7. QPCR Analizi <ol><li> Ön amplifikasyon: <ol><li> Kapsamlı QPCR analizi, primer çiftlerinin çok sayıda RNA sınırlı bir miktar paralel sorgulama dayanmaktadır. Bu nedenle, ön amplifikasyon bir adım gereklidir. Bu adımda, cDNA (800 primer çifti kadar) ileride örnek sorgulamak için kullanılacak olan tüm bir primer karışımı ile ön-amplifikasyon 14-18 döngülerine maruz kalmakta. </li><li> Spesifik Hedef Güçlendirmesi (STA) için 50 mcM TE (düşük EDTA) tüm primerler sulandırmak. </li><li> Havuz birlikte 50 uM primerin tüm 1 ul alikotları 800 deneyleri kadar, STA tepki olarak dahil edilmesi için ayarlar. </li><li> Tablo 3 de tarif edildiği gibi. STA için ön karışım hazırlayın ve örnekleri amplifiye gereken numune sayısı% 110 için bir karışımını hazırlayarak hata için izin verir. </li><li> Her numune için Tümbölen 3.75 ul STA ön karışımı. 1.25 ul ekleHer cDNA. </li><li> Vortex 10 saniye boyunca tepkileri ve santrifüj karıştırın. </li><li> Tablo 4 &#39;de gösterildiği gibi, bir termal döngü cihazı ve döngüde STA reaksiyonları yerleştirin. </li></ol></li><li> Ekzonükleaz I (ExoI) tedavisi: <ol><li> Tablo 5&#39;te gösterildiği gibi Ekzo I seyreltin. </li><li> Her 5 ul STA tepki seyreltilmiş ExoI (4 U / ml) 2 ul ekleyin, girdap, 37 ° C&#39;de bir termal döngü içinde (6.000 xg&gt;) aşağı spin ve yer ° C de 30 dakika ve daha sonra 15 dakika boyunca 80 ° C&#39;de. </li><li> Test için uygun bir konsantrasyona kadar seyreltilir son ürünleri. Kullanım TE Tampon (7 ul TSA numuneye 43 ul TE tampon eklemek). </li><li> -20 ° C&#39;de seyreltilmiş STA ürünleri saklamak veya hemen kullanın. </li></ol></li><li> QPCR Primer ve örnek kurulumu: <ol><li> Tablo 6&#39;da gösterildiği gibi. Örnekleri hazırlayın deney için seçilen çipine göre bir karışımı hazırlanmakta ve uygun örnekleri ekleyin. </li><li> Agi20 sn minimum örnek Mix çözümleri oluæturma ve santrifüj (&gt; 6,000 xg) en az 30 sn. Çip yükleme için hazır olana kadar hazırlanmış reaksiyonları 4 ° C sıcaklıkta kısa süreli saklanabilir. </li><li> Tablo 7&#39;de tarif edildiği gibi deneyler hazırlayın. </li><li> Tüm bileşenleri yavaşlamalarını en az 30 saniye boyunca 20 sn ve santrifüj (&gt; 6,000 xg) en az tahlil karışımı çalkalayın. ÖNEMLİ: iyice karıştırın ve santrifüj çip girişlerinin içine pipetle önce tüm örnek ve tahlil çözümleri. Bunun yapılmaması veri kalitesinde bir azalmaya neden olabilir. NOT: Her bir primerin son konsantrasyonu girişindeki 5 uM ve son reaksiyonda 500 nM&#39;dir. </li></ol></li><li> Astarlama ve Dinamik Array IFC (entegre akışkan devre) yongası yükleniyor. IFC çip (fig mikroakışkan odaları basınç altında tutmak için kullanılan kontrol hattı sıvısı (mineral yağ) için örnekler ve deneyler için girişleri yanı sıra, belirtilen giriş delikleri (akümülatörlerin) var) 4A yeniden. <ol><li> Çip her akümülatörüne kontrol hattı sıvı enjekte. </li><li> Çıkarın ve çip altından mavi koruyucu filmi atın. </li><li> Uygun IFC denetleyicisi içine yerlestirin (kontrolör MX 48.48 Dinamik Dizi IFC veya 96.96 Dinamik Dizi IFC için IFC denetleyici HX), daha sonra 48.48 Dinamik Dizi IFC veya Başbakan (136x) için Başbakan (113x) komut dosyasını çalıştırın Başbakan çip için 96.96 Dinamik Dizi IFC için komut. </li><li> Komut dosyası tamamlandığında, IFC kumandadan Astarlanmış çipi çıkartın. </li><li> Pipet her kontrol Mix 5 ul ve girişlerinde içine her Numune Mix 5 ul. </li><li> IFC denetleyiciye çip dönün. </li><li> IFC kontrolör yazılımı kullanarak, 48.48 Dinamik Dizi IFC için yük Mix (113x) komut dosyasını çalıştırın) veya 96.96 Dinamik Dizi IFC yonga içine örnekleri ve tahlilleri yüklemek için Mix (136x) komut dosyası yüklenemedi. Yük Mix komut dosyası tamamlandığında, yük kaldırmaIFC kumandadan ed çip. </li><li> Erime eğrisi analizi de dahil olmak üzere, (üretici kurallarına göre), yeni bir yonga çalıştırmak oluşturmak, termal döngü çip yükleyin. Termal döngü yazılımı kullanarak, reaksiyon odaları düzgün tanındığından emin olmak için, ve reaksiyon tamamlanma çalışmasına izin. </li></ol></li></ol> 8. Veri Analizi <ol><li> Kalite güvencesi: Veri kalitesini sağlamak (yukarıda açıklandığı gibi) seyreltme eğrileri ele alarak primerlerin kalitesini doğrulamak için. Amplikonların erime eğrileri görüntüleyerek amplifikasyonun özgüllüğünün Monitör, optimal olarak en yüksek noktalar 29 sıkı bir şekilde hizalanmalıdır. </li><li> Görselleştirme: yüksek verimlilik QPCR ile elde edilen büyük miktarlarda veri görselleştirme için kullanın ve yazılımları ekspresyon renk kodlu yoğunluğu olan, Heatmaps oluşturulur. Buna ek olarak, kaplı saçılım gibi, tek genlerin transkripsiyonel dinamiklerini gösterir. </li><li> Yayın: yayıncılıktagen ifade sonuçları, onun alaka, doğruluk, doğru yorumlama, ve tekrarlanabilirlik sağlamak için QPCR deney için rapor edilmelidir asgari ayrıntılı bilgiyi, kantitatif Real-Time PCR deneyleri yayınlanması için MIQE Yönergeleri takip etmek tavsiye edilir. </li></ol>

<ol><li>Amit, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+module+of+negative+feedback+regulators+defines+growth+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">A module of negative feedback regulators defines growth factor signaling.</a> Nature genetics. 39, 503-512 (2007).</li>
<li>Citri, A., Yarden, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF-ERBB+signalling%3A+towards+the+systems+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">EGF-ERBB signalling: towards the systems level.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 505-516 (2006).</li>
<li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li>
<li>Kleim, J. A., Jones, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+experience-dependent+neural+plasticity%3A+implications+for+rehabilitation+after+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+speech%2C+language%2C+and+hearing+research%22%5BJournal%5D)">Principles of experience-dependent neural plasticity: implications for rehabilitation after brain damage.</a> Journal of speech, language, and hearing research. 51, S225-S239 (2008).</li>
<li>Kauer, J. A., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+and+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity and addiction.</a> Nature reviews. Neuroscience. 8, 844-858 (2007).</li>
<li>Grueter, B. A., Rothwell, P. E., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+synaptic+plasticity+and+striatal+circuit+function+in+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Integrating synaptic plasticity and striatal circuit function in addiction.</a> Current opinion in neurobiology. 22, 545-551 (2012).</li>
<li>Robinson, T. E., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+associated+with+exposure+to+drugs+of+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse.</a> Neuropharmacology. 47, Suppl 1. 33-46 (2004).</li>
<li>Koob, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiological+mechanisms+in+the+transition+from+drug+use+to+drug+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+biobehavioral+reviews%22%5BJournal%5D)">Neurobiological mechanisms in the transition from drug use to drug dependence.</a> Neuroscience and biobehavioral reviews. 27, 739-749 (2004).</li>
<li>Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+mechanisms+of+addiction%3A+the+role+of+reward-related+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory.</a> Annual review of neuroscience. 29, 565-598 (2006).</li>
<li>Beurrier, C., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+inhibition+of+synaptic+transmission+by+dopamine+in+the+nucleus+accumbens+during+behavioral+sensitization+to+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhanced inhibition of synaptic transmission by dopamine in the nucleus accumbens during behavioral sensitization to cocaine.</a> The Journal of neuroscience. 22, 5817-5822 (2002).</li>
<li>Robinson, T. E., Berridge, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+psychology+and+neurobiology+of+addiction%3A+an+incentive-sensitization+view%5BTitle%5D)+AND+%22Addiction%22%5BJournal%5D)">The psychology and neurobiology of addiction: an incentive-sensitization view.</a> Addiction. 95, Suppl 2. S91-S117 (2000).</li>
<li>Boening, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+an+addiction+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neural+transmission%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of an addiction memory.</a> Journal of neural transmission. 108, 755-765 (2001).</li>
<li>Everitt, B. J., Robbins, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+systems+of+reinforcement+for+drug+addiction%3A+from+actions+to+habits+to+compulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural systems of reinforcement for drug addiction: from actions to habits to compulsion.</a> Nature neuroscience. 8, 1481-1489 (2005).</li>
<li>Volkow, N. D., Fowler, J. S., Wang, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+addicted+human+brain%3A+insights+from+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The addicted human brain: insights from imaging studies.</a> The Journal of clinical investigation. 111, 1444-1451 (2003).</li>
<li>Carlezon, W. A. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cocaine+reward+by+CREB%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of cocaine reward by CREB.</a> Science. 282, 2272-2275 (1998).</li>
<li>Hope, B., Kosofsky, B., Hyman, S. E., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immediate+early+gene+expression+and+AP-1+binding+in+the+rat+nucleus+accumbens+by+chronic+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulation of immediate early gene expression and AP-1 binding in the rat nucleus accumbens by chronic cocaine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5764-5768 (1992).</li>
<li>Hope, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+long-lasting+AP-1+complex+composed+of+altered+Fos-like+proteins+in+brain+by+chronic+cocaine+and+other+chronic+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Induction of a long-lasting AP-1 complex composed of altered Fos-like proteins in brain by chronic cocaine and other chronic treatments.</a> Neuron. 13, 1235-1244 (1994).</li>
<li>Pulipparacharuvil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+regulates+MEF2+to+control+synaptic+and+behavioral+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cocaine regulates MEF2 to control synaptic and behavioral plasticity.</a> Neuron. 59, 621-633 (2008).</li>
<li>Robison, A. J., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+epigenetic+mechanisms+of+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and epigenetic mechanisms of addiction.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12, 623-637 (2011).</li>
<li>Hyman, S. E., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addiction+and+the+brain%3A+the+neurobiology+of+compulsion+and+its+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Addiction and the brain: the neurobiology of compulsion and its persistence.</a> Nature reviews. Neuroscience. 2, 695-703 (2001).</li>
<li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiology+of+cocaine+addiction.+Science+%26+practice+perspectives+%2F+a+publication+of+the%5BTitle%5D)+AND+%22National+Institute+on+Drug+Abuse%2C+National+Institutes+of+Health%22%5BJournal%5D)">The neurobiology of cocaine addiction. Science & practice perspectives / a publication of the.</a> National Institute on Drug Abuse, National Institutes of Health. 3, 4-10 (2005).</li>
<li>Robbins, T. W., Everitt, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobehavioural+mechanisms+of+reward+and+motivation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neurobehavioural mechanisms of reward and motivation.</a> Current opinion in neurobiology. 6, 228-236 (1996).</li>
<li>Kaplan, G. B., Moore, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cognitive+enhancers+in+animal+models+of+fear+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%2C+biochemistry%2C+and+behavior%22%5BJournal%5D)">The use of cognitive enhancers in animal models of fear extinction.</a> Pharmacology, biochemistry, and behavior. 99, 217-228 (2011).</li>
<li>Chauvet, C., Goldberg, S. R., Jaber, M., Solinas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+environmental+enrichment+on+the+incubation+of+cocaine+craving%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Effects of environmental enrichment on the incubation of cocaine craving.</a> Neuropharmacology. 63, 635-641 (2012).</li>
<li>Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriched+environments%2C+experience-dependent+plasticity+and+disorders+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).</li>
<li>Silingardi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK+pathway+activation+bidirectionally+affects+visual+recognition+memory+and+synaptic+plasticity+in+the+perirhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+behavioral+neuroscience%22%5BJournal%5D)">ERK pathway activation bidirectionally affects visual recognition memory and synaptic plasticity in the perirhinal cortex.</a> Frontiers in behavioral neuroscience. 5, 84(2011).</li>
<li>Tropea, D., Majewska, A. K., Garcia, R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+synapses+in+vivo+correlate+with+functional+changes+during+experience-dependent+plasticity+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of synapses in vivo correlate with functional changes during experience-dependent plasticity in visual cortex.</a> The Journal of neuroscience. 30, 11086-11095 (2010).</li>
<li>Steketee, J. D., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+wanting%3A+behavioral+sensitization+and+relapse+to+drug-seeking+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Drug wanting: behavioral sensitization and relapse to drug-seeking behavior.</a> Pharmacological reviews. 63, 348-365 (2011).</li>
<li>Citri, A., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+qPCR+profiling+of+gene+expression+in+single+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells.</a> Nature protocols. 7, 118-127 (2012).</li>
</ol>

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Davranışsal paradigmaların ardından beyin dokusundan gen ifadesinin başarılı karakterizasyonu bağlıdır: davranış paradigması sırasında farelerin 1) dikkatli elleçleme; Ilgi doku 2) Hızlı ve hassas diseksiyon; 3) RNA emniyetli önlemler RNA bütünlüğünü sağlamak için; ve 4) primerleri ve deneysel dikkatli planlama düzeni gibi QPCR analiz için hazırlanırken detaylara hassas ve dikkat. Tarif edilen prosedüre amacı, davranış deneyim ile indüklenen transkripsiyonel olayların dinamiğini karakterize ...

Beynin dinamik bir organizasyon bilişsel ve davranışsal esneklik sağlar. Deneyimler beyindeki 3 nöronlar arasındaki bağlantıların yapısı ve gücü değişiklikleri ile kodlanmıştır. Bu &quot;tecrübeye bağımlı plastisite&quot; sinaptik yapı ve mukavemet 4 modifikasyonu için gerekli proteinleri içerir gen ifadesinin spesifik örneklerine indüksiyon sonucudur. Uzun vadeli anıların oluşmasına aracılık gen düzenleyici ağların tanımlanması transkripsiyonel programların egemen unsurlarının tespiti için bellek oluşumunu, yanı sıra hedefler düzenleyen temel ilkeler içgörü sağlayacağı beklentisi ile, moleküler nörobilim merkezi ilkelerinden biridir nörodejeneratif ve nöropsikiyatrik bozuklukların tedavisi. Transkripsiyonel programlar d önemli olan farklı karakter genleri kodlayan her biri, geçici olarak tanımlanmış dalgalar açılmaksinyal olayı 1,2 sonucu uygulanmasında ifferent aşamaları. Bu kaynaklı genlerin tam bir tamamlayıcı belirlemek ve onların indüksiyon dinamiklerine göre potansiyel fonksiyon içgörü kazanmak şekilde, ayrıntılı bir zamansal zaman ölçeği üzerinde transkripsiyonel dinamiklerini ele nedenle önemlidir. Madde bağımlılığı, beyin 5,6 nöral devrelerinde kötüye kullanılan ilaçların uzun süreli etkileri neden tecrübeye bağımlı plastisite sağlam bir şeklidir. Ilaçlara ilk akut maruz bağımlılık gelişmesinde ve kronik kullanımına geçişe yol açabilir. Bağlamsal bilgi bağımlılık gelişiminde çok önemli bir unsurdur. İlaç-ilişkili çevresel ipuçları uyuşturucu bağımlısı zihninde önem atanır. Ilaç özlem nüksü uyarabilir geçmiş ilaç deneyim bir ilaç istismarı hatırlatan bağlamsal bilgiler hatta uyuşturucu maruz 7,8 kaçınmanın uzun süre takip.Dolayısıyla bağımlılığı büyük klinik meydan - yoksunluk belirtileri 9 yatıştıktan sonra bağımlılarının eğilimi hatta uzun nüks. Kokain Davranışsal sensitizasyon uyuşturucu bağımlılığı mekanizmalarının çalışma yararlı kokain deneyimi basit bir modeldir. Kötüye kullanılan ilaçların kronik olarak maruz kalmak neden olduğu uzun süreli sensitizasyon bu yaygın olarak incelenmiş modelinde kemirgen önce salin enjeksiyonları (karın içinden, IP) alışık olan yeni bir ortamda (kendi lokomotor aktivite kontrol edildiği bir açık alan odası) ; onların etkinliği 10 (Şekil 1) takip edilmektedir, sonra onlar açık alanda odalarına kokain günlük enjeksiyonu yapılır. Bu davranış genellikle bir paradigma sapık oluşumunu gösteren, kokain enjeksiyonları kesilmesini takiben aylık bir süre için muhafaza edilmektedir (8-12 kat başlangıç ​​etkinliği ile elde edilmiş) Hareket davranışında, 11, sağlam bir sensitizasyon sonuçlanırilaç deneyim Asive bellek iz. Doğal bir türün başarısı (örneğin beslenme, cinsiyet) için gerekli davranışları takviye katılan ödül nöral devreler, ilaç ilişkili davranışları 12,13 güçlendirmek için ilaç kötüye tarafından istismar edilmektedir. Kötüye kullanılan ilaçların tecrübesi arttınlır edildiği, moleküler ve hücresel mekanizmalar, başka beyin yapılarında 14 açıklayıcı bir ya da semantik bellek oluşumu altında yatan mekanizmaların benzer görünmektedir. Bu nedenle, davranışsal sensitizasyon modelinin sağlamlığı o deneyim-bağımlı plastisite mekanizmaları incelemek için çekici bir model sistemi yapar. Nükleus akumbens (NAC) beyin ödül devresinin bir merkezi birleştiricidir ve yoğun bağımlılığı 5,6 gelişmesi ile ilişkilendirilmiştir. Bağımlılığı oluşumu nukleus accumbensde yeni proteinlerin transkripsiyonu bağlıdır ve sağlamaçıkça yapılandırılmış transkripsiyon programları duction kokain deneyimi 15-19 aşağıdaki NAC görülmektedir. kokain maruz kalma akut transkripsiyonel tepkisi güçlü indüksiyon uyarana uyum ve yeni proteinlerin üretimini yönlendirmek için birden fazla düzeyde çalışması için muhtemel olduğunu ilaç 6,19-22 maruz bırakılarak kaynaklanan yapısal değişiklikler ve elektrofizyolojik sorumludur. Beyinde tecrübeye bağımlı plastisite moleküler mekanizmalarının çalışmasını sağlamak amacıyla, bir protokol davranış manipülasyon beyin doku örnekleri transkripsiyon dinamiklerinin kapsamlı analizi için tarif edilmiştir. Transkripsiyonel analizi için mikro-akışkan dinamik bir dizi kullanarak, kokain davranışsal duyarlılaşma - protokol Citri laboratuarda araştırılmıştır davranış deneyim bağlamında görüntülenmiştir. Açıklanan protokol belli t okuyan bunlarla sınırlı değildiro davranışsal duyarlılaşma bağlamında accumbens nükleusuna, davranış paradigmalar ve beyin bölgelerinin çok sayıda uygulanabilir. Aslında, bu protokol beyin dışında, vücut dokularına tatbik edilebilir, ve deneyimlerin veya organizmanın çeşitli manipülasyon incelenmiştir. Protokol kabaca dört aşamada ayrılır. Birinci aşamada, hayvan davranış paradigma tabi tutulur; İkinci aşamada doku microdissected olduğu; Üçüncü aşamada - mRNA tersine transkripsiyon yapılmış, saflaştırılmış ve problandı ve son aşamada veriler analiz edilir. Transkripsiyonel dinamiklerini okuyan kapsamında, deneyim hassas zamanlama ve tanımı kontrol etmek en önemli deneysel parametreler muhtemelen. Bu nedenle, tercih edilen modeli, bu davranışsal kokaine davranışsal duyarlılaşma, deneyimi sağlanan parametreleri üzerinde kontrol deneyi ile yüksek düzeyde sağlayan bir sistem ile ilgilidirce. Deneyim-bağımlı plastisite veya bellek oluşumu farklı modeller hassas zamanlama sağlamak ve ele Ek davranışsal paradigmalar vardır. Bu modeller korku klima 23, akut çevresel zenginleştirme 24,25, roman nesne keşif 26 ve karanlık yetiştirme 27 aşağıdaki görsel deneyim içerir. Yine, kokain davranışsal sensitizasyon sürekli güçlü davranışsal manipülasyon kokain deneyimi 28 aşağıdaki ay süren oldukça yaygın bellek izleme oluşturma, olduğunu. Beyin çekirdeği accumbensde manuel mikrodiseksiyonu takip kesilir. Hızla hazırlanan beyin dilimleri el ile mikrodisseksiyon davranışsal paradigma ilgili dokuyu çıkarma en güvenilir ve hızlı bir yöntem sağlar ki bizim deneyim olmuştur ve tecrübesi ile, doku sınırları tanınan kolayca belirgin hale gelirler. Seçenek olarak ise, ince dilimler HAZIRLIK olabilirlazer yakalama mikrodiseksiyon takip ed. Bu yöntem son derece ilgi bölgenin sınırlarının çizilmesini tanımlanan sağlar karşın, (böylece kararsız mRNA kaybetme riski) sıkıcı yavaş ve masraflı özel ekipmanları (lazer yakalama kurulumu ile donatılmış bir mikroskop) gerektirir. Burada tanımlanan protokol, yama pipetler, 29 kullanılarak görsel olarak tanımlanmış olan hücrelerin sitoplazması elle aspirasyonu ile, tek hücreli bir transkripsiyonel analizi için adapte edilebilir. Bu çoğu durumda, doku içindeki hücrelerin sadece bir alt popülasyonu, aslında deneyimine yanıt katılan son derece olasıdır, ancak tarif edilen protokolü bir popülasyon ortalama sağladığını belirtmek önemlidir. Bu deneyimi yanıt belirli bir hücre popülasyonları içinde bir seçici bir şekilde transkripsiyonu profile ilgi olduğunu, ancak bu yaklaşımların tartışılması geçerli kapsamı dışındadır. MRNA Saflaştırma için, ters transkripsiyon ve QPCR sorgulama, dokuticari olarak temin edilebilir kitlerin kullanılması ile ve ardından ince iğneler boyunca geçirilmesi ile bozulur (Daha fazla bilgi için, bakınız Tablo 8). Seçim yüksek kaliteli RNA ve alt uygulamaları sağlam sonuçların güvenilir çıkarılmasını sağlamak, bu metodolojiler, deneyim tarafından bilgilendirilir. Protokol kullanılarak dinamik bir dizi yüksek verimli QPCR için tarif edilmiş olmasına rağmen, numuneler son nokta PCR, düşük verimlilik qPCR, gen ifadesi ya da derin mikrodizileri dizileme, gen ekspresyonu için incelenebilir. Yüksek verimli QPCR kullanılarak dinamik bir dizi için tercih mRNA davranış paradigmaların ardından genellikle sınırlayıcı miktarda olan beyin çekirdekleri elde olmasından kaynaklanmaktadır. Dinamik diziler tek bir deneyde paralel örneklerin çok sayıda transkript etkili bir biçimde analiz sağlayan bir platform sağlar. Mikroakışkan sisteminin ilk iktisabı (genellikle kurumsal bir pu sonrarchase), deney çalıştırmak için nispeten ucuzdur. Bu analizden sonra, örneklerin daha da sorgulanması dinamik diziler kalite güvencesi için kapsamlı bir referans sağlayan (mikrodiziler veya RNAseq) tarafından yeni transkript aramak için daha maliyetli platformları kullanarak yapılabilir. Son olarak, veri analizi için, standart yaklaşımlar kullanılmaktadır. Ortaya çıkabilecek sorunları ile ilgili özel işaretçileri protokol metninde ele alınacaktır. Bu protokol birden fazla koşul ve çoğaltır okuyan kendi ilgi sisteminin kapsamlı bir soruşturma ilgilenen araştırmacılar için en uygundur. Protokolü de zaten onlar defalarca sorgulama ilgilenen ilgi 50-500 genlerin, bir alt kümesine (microarray veya RNAseq deneyler aracılığıyla) honlanmış bazı araştırmacılar için en uygun olanıdır.

<table><tbody><tr><td>Virusol</td><td>Oriek Medical</td><td>J29D</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP 100</td><td>% MINRAD INC</td><td>NDC 60307-110-25</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy plus Evrensel Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>73404</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon kiti</td><td>Invitrogen</td><td>AB-4368814</td><td></td></tr><tr><td>TE Tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>1355656</td><td></td></tr><tr><td>Davranış Odası (MDF; 50 x 45 cm)</td><td></td><td></td><td>Kendinden montajlı</td></tr><tr><td>İç Perspex kutu (30 x 30 cm)</td><td></td><td></td><td>Kendinden montajlı</td></tr><tr><td>Kamera ve video kaydedici</td><td>Campden Inst.</td><td>CMD-80051</td><td></td></tr><tr><td>Medya Kaydedici yazılımı</td><td>Noldus</td><td>NDS-NMR3-00M</td><td></td></tr><tr><td>İris Makas</td><td>FST</td><td>FST-14062-09</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Campden Inst.</td><td>7000SMZ-2</td><td></td></tr><tr><td>Biyoanalizör</td><td>Agilent Technologies</td><td>Agilent 2100 Biyoanalizör</td><td></td></tr><tr><td>Termal döngüleyici</td><td>Bio-Rad</td><td>1852048</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikrokaşık spatula</td><td>Bochem Instrument GmbH</td><td>3213</td><td></td></tr><tr><td>Biomark HD Okuyucu</td><td>Fluidigm</td><td>BMHD-BMKHD</td><td></td></tr><tr><td>Dinamik dizi 96.96 gen ekspresyonu için</td><td>çip Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

davranış deneyim ardından beyin Örneklerden deşifre dynamics kapsamlı analizi

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

Beyin ve uzun vadeli anıları konsolidasyon deneyimleri kodlama gen transkripsiyonu bağlıdır. Kodlama deneyim spesifik genlerin işlevini belirlenmesi moleküler nörobilim ana hedeflerinden biridir. Ayrıca, belirli davranışları ile tanımlanan genlerin fonksiyonel dernek nöropsikiyatrik bozuklukların temelini anlamak için etkileri vardır. Güçlü transkripsiyon programları indüksiyonu çeşitli davranışsal manipülasyonlar ardından fare beyinlerinde gözlenmiştir. Bazı genetik elemanların farklı davranış manipülasyonlar takip eden ve farklı beyin çekirdeklerinde tekrarlı kullanılmışsa da, transkripsiyon programları genel olarak uyaran uyarılara ve 1,2 incelenmiştir edildiği yapıya benzersizdir. Bu yayında, bir protokol davranışsal manipülasyon yanıt farelerin beyin çekirdeklerine sağlam ve kapsamlı transkripsiyon profilleme için tarif edilmiştir.Protokol Akut kokain deneyimi aşağıdaki akumbens çekirdekte gen ekspresyon dinamiklerin analiz bağlamında gösterilmektedir. In vivo deneyim tanımlanan bir sonraki hedef nöral doku disseke edilir; RNA, ardından arıtma için, çok hedefli genlerin geniş QPCR analizi için transkripsiyonu ve mikroakışkan dizilerin kullanımını ters. Bu protokol, küçük beyin numuneleri hatta tek tek hücreleri gibi kapsamlı analiz başlangıç ​​malzemesi, sınırlı bir miktar (50-500 genlerini adresleme) yönelikse. Protokol çok sayıda örneğin paralel analizi (örneğin, tek hücreler, ilaç aşağıdaki dinamik analizi, viral ya da davranışsal düzensizlikler) için en çok avantajlıdır. Ancak, protokol aynı zamanda mikrodiziler veya RNAseq tarafından tüm genom çalışmalarından önce numunelerin karakterizasyonu ve kalite güvencesi için hizmet, yanı sıra tam-genom çalışmalarından elde edilen verilerin doğrulama olabilir.

Bu protokolü uygulayarak elde edilen sonuçların kalitesi önemlisi, bir dizi parametre bağlıdır. Uygun deneysel planlama deney farelerinde minimal rahatsızlık, neden olur bu test deneyimi (bu örnekte, kokain maruz kalma olduğu) kendi yakın tarihin en dominant deneyim olacak ve bu nedenle sağlam ve belirli transkripsiyon yol açacağı programı. Şekil 1 çekirdeği farelerin disseke ve analiz edilmektedir akkumbens hangi kokain deneyim aşağıdaki zaman noktaları tanımlayarak, kokain davranışsal hassaslaşması iç...

Bu el yazması, davranışsal paradigmaları takip ederek kemirgenlerin belirli beyin çekirdeklerinde indüklenen transkripsiyonel programların analizi için kapsamlı profilleme uygulayan bir protokolü açıklamaktadır. Burada, bu yaklaşım, mikroakışkan qPCR dizileri kullanılarak, akut kokain maruziyetini takiben farelerin nükleus accumbens'inde (NAc) indüklenen genlerin profillenmesi bağlamında gösterilmektedir.

Davranış Deneyim ardından Beyin Örneklerden Deşifre Dynamics Kapsamlı Analizi

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, davranışsal deneyim sonrası farelerin transkripsiyonel dinamiklerini ve belirlenmiş beyin çekirdeklerini incelemektir. Bu işlem, öncelikle hayvanların alıştırılması ve salin enjeksiyonundan sonra lokomotor aktivitelerinin kaydedilmesiyle gerçekleştirilir. Hayvanlar alıştıktan sonra, tek doz kokain sonrası lokomotor aktivite kaydedilir, ardından nucleus accumbens'ten örnekler toplanarak RNA izolasyonu ve cDNA hazırlama işlemleri için kullanılır.Ardından, davranışla tetiklenen gen ekspresyonunu incelemek amacıyla qPCR analizi gerçekleştirilir. Nihayetinde, kokain deneyimini takiben transkripsiyonel dinamikleri gösteren sonuçlar elde edilir. Protokolü; laboratuvar yöneticisi Dr. Hatu, laboratuvardan lisansüstü öğrencisi Dum Muer ve laboratuvardan lisans öğrencisi Duran, üç ardışık gün boyunca uygulamalı olarak gösterecektir. Her fare, tutma ve enjeksiyon prosedürlerine alıştırılır; fareler, deney başlatılmadan önce kafeslere yerleştirilir, böylece farelerin gelecekte kafesler arası transferi yapılmaz ve fareler asla uzun süre yalnız bırakılmaz.Test başlangıcından 30 dakika önce, hayvanların ortama alışmasını sağlamak amacıyla tüm test kafesleri davranış odasına taşınmalıdır. 250 microliters serum fizyolojik intraperitoneal enjeksiyonunu uygulayın; enjeksiyonun hemen ardından fareyi, lokomotor aktiviteyi 15 dakika boyunca izlemek için bir davranış odasına yerleştirin. Fare, davranış odasında 20 dakika boyunca tutulabilir.İkinci ve 17. dakikalar arasında izlenen bir aktivite. Bu adımları sonraki iki gün boyunca günün aynı saatinde tekrarlayın. Dördüncü günde, gruba bağlı olarak tek bir doz kokain veya salin enjekte edin ve fareyi hemen hazneye yerleştirerek, kokain maruziyetini takiben seçilen zaman noktalarında 20 dakika boyunca lokal motor aktiviteyi izleyin; ardından beyni çıkarıp soğutmak ve sertleştirmek için bir ila iki dakika boyunca buz gibi soğuk A CSF çözeltisine yerleştirin.Serebellum çıkarıldıktan ve fazla sıvı emildikten sonra, beyni rostral kısmı yukarı bakacak şekilde bir vibram tablasına yapıştırın. Hazneyi buz gibi soğuk A CSF ile doldurun ve nucleus accumbens net bir şekilde tanımlanana kadar 200 mikronluk kesitler alın. Kesim işlemi sırasında corpus callosum'un şekline, anterior komissürün ve ventriküllerin konumuna ve şekline dikkat edin.Doğru bölge belirlendikten sonra, nucleus accumbens'in bir stereoskop altında diseke edileceği 400 mikron kalınlığında iki kesit alın. Nucleus accumbens'i kesitlerden ayırmak için ince bir bıçak kullanın. Doğru bölgede bıçakla yapılan dört hızlı geçiş, uygun dokuyu anında izole etmelidir.İzole edilen dokuyu 900 µL lizis reaktifi içine yerleştirin ve RNA ekstraksiyonuna kadar -80 °C'de saklayın; ekstraksiyona başlarken tüpleri 37 °C'de çözdürün ve homogenize edin. 25 gauge iğne kullanırken, ilk birkaç tur zor olabilir ve dokuyu küçük parçalara ayırarak homogenize etmek için tüp çeperine doğru itmek gerekebilir. Uygun homogenizasyonu sağlamak için lizatı bir kaya shredder mini spin kolonuna pipetleyin ve santrifüjleyin.Lizatı yeni bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin ve üreticinin talimatlarına göre RNA'yı ekstrakte edin. RNA saflaştırmasının ardından, cDNA'ya ters transkripsiyon ile analiz için seçilen gen grubuna yönelik primerler kullanılarak örneklerin hedefe özgü ön amplifikasyonu gerçekleştirilir. Bu prosedürler, protokolün metin versiyonunda açıklanmıştır.Kapsamlı QPCR analizi için ticari mikroakışkan çipler, 48 örneğin 48 prob setiyle analizine olanak tanıyan 48'e 48 formatında veya 96 örneğin 96 prob ile analiz edildiği 96'ya 96 formatında mevcuttur. Çoğu durumda, çip seçimi öncelikle analiz edilen örnek sayısına bağlıdır.Öncelikle, deney için seçilen çipe göre numune karışımını hazırlayın. 20 XDNA bağlayıcı boya numune yükleme reaktifini pipetlerken dikkatli olun. Numune karışım çözeltilerini minimum 20 saniye boyunca çalkalayın ve en az 30 saniye boyunca santrifüjleyin.Hazırlanan reaksiyonlar, çip yüklemeye hazır olana kadar dört derece Celsius'ta kısa sürelerle saklanabilir. Ardından, assay karışımını hazırlayın, örnek karışımını iyice çalkalayın ve tüm bileşenleri çöktürmek için santrifüjleyin. Daha önce gösterildiği gibi, dinamik dizi IFC çipi; örnekler ve assay'ler için girişlerin yanı sıra, mikroakışkan odaları basınçlandırmak için kullanılan kontrol hattı sıvısı için belirlenmiş girişlere sahiptir.İlk olarak, çip üzerindeki her bir akümülatöre kontrol hattı sıvısı enjekte edin. Ardından, çipi IFC kontrol cihazına yerleştirip uygun betiği çalıştırarak çipi hazırlayın. Betik tamamlandığında, hazırlanmış çipi IFC kontrol cihazından çıkarın ve her bir analizden beş µL pipetleyin.Çip üzerinde karıştırın. Her bir örnek karışımından beş µL'yi ilgili girişlerine ekleyin ve IFC kontrolör yazılımını kullanarak çipi IFC kontrolöre geri yerleştirin. Örnekleri ve analizleri çipe yüklemek için betiği çalıştırın.Yükleme karıştırma betiği tamamlandığında, yüklü çipi IFC kontrolöründen çıkarın. Ardından, çipi termal döngüleyiciye yerleştirin ve erime eğrisi analizini içeren yeni bir çip çalışması başlatın. Termal döngüleyici yazılımını kullanarak reaksiyon odalarının doğru şekilde tanındığından emin olun ve reaksiyonun tamamlanmasına izin verin.Tek bir akut kokain enjeksiyonu sonrası lokomotor aktivitede artış belirginleşmiştir. Bu koronal kesitte, nucleus accumbens sınırlarını belirlemek için yapılan kesilerin yerleri kalın beyaz çizgilerle işaretlenmiştir. Diseksiyon sırasında, c-fos ve phos B'ye yönelik primerlerin amplifikasyon eğrileri, primer çiftlerinin hedef transkriptlerini yaklaşık %100 verimlilikle amplifiye ettiğini göstermektedir.Her döngüde sonuçlar, nucleus accumbens'te kokainin tetiklediği CFO'lar ve phos B ekspresyonunun, maruziyetten bir ve iki saat sonra en yüksek seviyeye ulaştığını göstermektedir. Bu prosedürün ardından, henüz karakterize edilmemiş yeni transkriptleri tanımlamak amacıyla yeni nesil dizileme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

comprehensive-analysis-transcription-dynamics-from-brain-samples

Research

JoVE Journal

Behavior

Davranış

Yakın zamana kadar, insan beyni ifade çalışmaları RNA veya protein ölçümü ile sınırlı kalmıştır. Bu yazıda anlatılan kromatin immunoprecipitation teknikleri, postmortem beyin gen ekspresyonu histon metilasyon ve diğer epigenetik düzenleyiciler haritaya mümkün olacaktır.

İnsan Beyninin Doku Kromatin Testi

Erken yaşam stresinin üzerine DNA metilasyon ve gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için bir iş akışı gösterilir. Yeni doğmuş farelerin ve ayrık beyin dokularında izolasyonu anneden ayrılma başlayarak, eş zamanlı olarak izleyen bisülfit sıralama ve RT-PCR analizi için beyin dokusu yumruklar DNA ve RNA izole etmek için bir protokol temsil eder.

Beyin Küçük, Anatomik tanımlı alanları DNA metilasyon ve Gen İfade Optimize Analizi

Derin Beyin Stimülasyonu (DBS) cerrahisinin terapötik etkilerinin altında yatan mekanizmanın araştırılması gerekiyor. Bu yazıda sunulan yöntemler, DBS cerrahisi sonrası nörojenezi kolaylaştırabilecek aday genlerin gen ekspresyon profilini analiz ederek DBS tarafından tetiklenen hücresel olayları incelemek için deneysel bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Ön Talamusun Çekirdek Derin Beyin Stimülasyon sonra Sıçan Hippocampus Gen İfade Değişim Analizi

Sinaptik plastisiteyi ve hafızayı kontrol eden moleküllerin ve yolakların tanımlanması, sinirbilimde hala büyük bir zorluktur. Burada, işitsel bir öğrenme paradigmasında öğrenme ve hafıza konsolidasyonu sırasında sinapsların moleküler yeniden düzenlenmesinde rol oynadığı varsayılan sinaptik proteinlerin göreceli nicelleştirilmesini ele alan bir iş akışı açıklanmaktadır.

İşitsel Ayrımcılık Öğrenme sonra Fare Beyin Bölgeler Yüksek Çözünürlüklü Sayısal Synaptic Proteome Profil

Bu iletişim kuralı ChIP-seq, 4sU seq, toplam RNA-seq ve hücre satırları ve Primer hücre için profil oluşturma ribozom Kombinatorik kullanımını açıklar. Transkripsiyon faktörü de novo transkripsiyon, RNA işlenmesi, ciro ve çeviri zamanla, bağlama ve olayların genel gidişatı harekete geçirmek ve/veya hızla değişen hücrelerde görüntüleme izleme değişiklikleri sağlar.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Burada, protokolü ve metil-Seq, kronik stres pozlama ile ilişkili epigenetik değişiklikleri tanımlamak için bir fare modeli kullanarak bir epigenomic platform uygulanması açıklanmaktadır. Sonuçları sıçan metil-Seq platformu sıçanlarda stres maruz kaynaklanan metilasyonu farklılıklar tespit kapasitesine sahip olduğunu göstermektedir.

Stres pozlama ile ilişkili epigenetik değişiklikleri tanımlamak için bir fare metil-Seq Platform

Davranış sırasında ve uyaranlara yanıt olarak yetişkin Drosophila'nın tüm beynini imgelemek için özel olarak uyarlanmış bir yöntem sunuyoruz. Baş, tüm beyne optik erişime izin vermek için konumlandırılırken, sinek bacaklarını ve antenleri, hortumun ucunu hareket ettirebilir ve gözler duyusal uyaranları alabilir.

Davranış ve Uyaran Yanıtları Sırasında Yetişkin Drosophila melanogaster'ı Tüm Beyin Görüntülemeye Hazırlama

Bu protokol, yerel alan potansiyellerini kaydetmek ve fare hipokampusu ve prefrontal korteksindeki bilgi akışını araştırmak için özel olarak tasarlanmış bir kayıt cihazının ve elektrotların kullanımını ana hatlarıyla belirtir.

Fare Hipokampusu ve Prefrontal korteksinde ikili hücre dışı kayıtlar

Burada, MRI ortamlarında davranışsal izlemedeki zorlukların üstesinden gelen ve dış ipuçlarına talimatsız davranışsal tepkilerin tespit edilmesine olanak tanıyan bir video analiz hattı sunulmaktadır. Bu analiz, uyarılmış iç durum değişikliklerinin ve beyin genelindeki aktivitenin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.

Tüm Beyin Görüntüleme Sırasında Anne Davranış Tepkilerinin Profillenmesi

Bu protokol, beyin kodlamasını doğal bağlamlarda anlamak için gelişmiş hesaplamalı nöroetolojik yöntemlere dayanan entegre bir çerçeve sunar.

Nöroetolojik Yerleştirmeden Doğal Davranışın Kodunu Çözmek

Bu makale, uzamsal transkriptomik için dinamik, etkileşimli bir veritabanı olan DeepSpaceDB'yi kullanmak için bir protokol sunar ve doku organizasyonunu ve hastalıkla ilgili gen ekspresyonunu keşfetmek için analiz iş akışları ve örnekler sunar.

DeepSpaceDB kullanarak Uzamsal Transkriptomik Veri Kümelerinin Madenciliği

Öğrenin farelerde kokain maruziyeti sonrası nükleus akumbens'te transkripsiyonel dinamikleri analiz etmek için qPCR yöntemini. Bu protokol davranışsal nörobilim ve bağımlılık araştırmalarında gen ifadesi değişikliklerini incelemeyi sağlar.

Davranış Deneyim ardından Beyin Örneklerden Deşifre Dynamics Kapsamlı Analizi

Daha fazla video keşfet