Name: Canlı Farelerde Femoral Kemik İliği Aspirasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Öğrenin, canlı farelerde femoral kemik iliği aspirasyonu yöntemiyle hematopoietik hücreleri tekrarlayan örnekleme için nasıl elde edebilirsiniz. Bu etik teknik, uzunlamasına çalışmalara olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O.A.-W., NIH K08 Klinik Araştırmacı Ödülü (1K08CA160647-01), ABD Savunma Bakanlığı Kemik İliği Yetmezliği Araştırmalarında Doktora Sonrası Araştırmacı Ödülü (W81XWH-12-1-0041), Josie Roberston Araştırmacı Programı ve Evan's Vakfı'nın desteğiyle Damon Runyon Klinik Araştırmacı Ödülü ile desteklenmektedir.

Bu protokolü açıklanan tüm hayvan prosedürleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Rehber uyarınca yapılmıştır ve Memorial Sloan-Kettering Kanser Merkezi&#39;nde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUCs) tarafından onaylanmıştır. Femur Kemik İliği 1. Aspirasyon (BM) Hücreler <ol><li> Hassas bir buharlaştırıcı ile uygulanan izofluran (% 1-4) ile femur kemik iliği aspirasyonu geçirecek fare anestezisi. Anestezi derinliği cerrahi manipülasyon ve / veya kulak, ayak ve kuyruk tutam ile ilişkili solunum hızında herhangi bir değişiklik olmadığını gözlemleyerek işlem boyunca her 5-10 dk izlenmelidir. Anestezi izofluran ile indüklenen ve izofluran ile işlem boyunca korunur. 0.05-0.1 mg bir dozda buprenorfin bir rüçhan işlem öncesi doz / kg deri altından, her 6-12 saatte bir adj tarif edilen prosedür ile bağlantılı ağrıyı önlemek için kullanılabilirCarprofen için UNCT. </li><li> Kornea kurumasını önlemek için anestezi fare aşağıdaki indüksiyon gözleri oftalmik merhem sürün. </li><li> Kürk dikkatli bir şekilde amaçlanan aspirasyon sitenin alanından daha yaklaşık olarak% 150 daha büyük bir deri bölgesinden kırpılır. Gevşek kürk nemli bir gazlı bezle kaldırılır. İşlem sırasında hipotermi önlemek için dolaşan sıcak su yastığı veya başka güvenli bir termostatik kontrol yüzeyi üzerinde fareyi tutun lütfen. </li><li> (Povidon-iyot (Betadinede) veya klorheksidin (Nolvasan) çalılık ve% 70 izopropil alkol veya% 70 etanol batırılmış gazlı bez ve sünger ile ya dönüşümlü) alternatif scrubs üç set ile aspirasyon geçirecek femur içeren tüm bacak dezenfekte edin. </li><li> BM aspirasyon önce steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile:,: 0.5 ml tüberkülin şırınga (27.5 G ölçer 0.5 cc hacim) ıslatın. PBS 200-500 ul şırınga doldurun ve hemen PBS kovmak. Bu işlem 2-3 t tekrarlayınimes. </li><li> Yüzük parmağı veya beşinci parmak biriyle tibia iterek femur tibia bükük tutun. Uygun anestezi uçak elde edildiğini teyit. Şırınga başparmak ve işaret parmağı kullanılarak yapılır. Bu kondil maruz sağlar ve iğnenin yerleştirilmesini kolaylaştırır. </li><li> İğne femur iki kondillerin arasında güvenli bir şekilde açılmış, böylece şırınga ıslatma sonra patellar tendon boyunca iğne takın. Baş parmak ve işaret parmağı ile femur epifiz yakın gövdesini tutarak, iğne kolayca femur şaft içine sokulur. </li><li> Bu femur şaft ile paralel olacak şekilde dışarı ve yukarı doğru iğne çevirin. Bu eylem, femur milinden kemik iliği içeriğinin alma kolaylaştırır. </li><li> Femoral kemik iliği boşluğuna yavaşça iterken saat yönünün iğne saat yönünde çevirin ve. Nazikçe sy hareket ettirerek iğnenin doğru konumlandırılmasını onaylayınyanal Ringe. </li><li> Ileri ve geri BM boşluğu içinde iğne hareket ederken nazikçe, negatif basınç oluşturarak, geri iğne pistonu çekin. Not: BM aspire hacmi, tipik olarak 0.4-0.8 x 10 6, tek çekirdekli hücreler karşılık gelen yaklaşık 5 ul olacaktır. Başarılı aspirasyon şırınganın tabanında iğnenin üst kan görünümü görsel olarak teyit edilecektir. Kan şırıngaya görülür ise küçük bir kemik veya doku parçası iğne kalmış olması muhtemeldir. Bu, (bu, şırınga BM aspire önce PBS ile doldurulmuş olmalıdır bir nedeni de budur), PBS içinde yukarı ve aşağı hareket eden piston ile iğne kaldırılabilir. Doku şırınga yerinden olamaz, yeni bir iğne ve şırınga (tekrar PBS 200-500 ul şırınga ıslak) kullanın. </li><li> BM başarıyla femur aspire edildikten sonra, femur ve fareden iğne ve şırınga çıkarın. </li><li> Bir mikrofuge&#39;de tüp pr aspire BM Taşı500 ul PBS ile efilled. Bir çok uygulama için, BM Hücreler daha sonra daha fazla işlem mümkünse kadar buz üzerinde tutulmalıdır. </li><li> İşlemin tamamlanmasından sonra, 5 mg / kg deri altından karprofen ile analjezik yönetmek. Sonra anestezi fareyi kaldırmak ve tamamen iyileşti kadar ısıtılmış bir yastık üzerine yerleştirin. NOT: düzgün yapılmazsa eğer aspirasyon prosedürü izleyerek deneyimli hiçbir komplikasyon veya sıkıntı olmamalıdır. </li><li> Konut alanına fareler dönmeden önce, yiyecek ve su yürümelerine ve ulaşabiliyorlar sağlamak. Sonraki 24 saat içinde sıkıntı ya da enfeksiyon sonrası prosedür belirtileri fareler gözlemleyin. Belirtileri şunlardır: sürekli kanama, anemi, uyuşukluk. Bu belirtilerden herhangi sonrası prosedürü görülürse, hayvan (lar) ötenazi olmalı. Not: BM aspirasyon / numune tekrar edilebilir, ancak tekrar prosedür aynı bacağa tekrar travma önlemek için karşı femur üzerinde gerçekleştirilmelidir. Fr ile ilgili çok az bilgi vardırequency ki BM aspirasyon yapılabilir. Femoral Kemik iliği aspirasyonu genellikle artık daha sık her 2 haftadan daha tekrarlanır. </li></ol> Emişli BM hücrelerinde hücresel İçerik 2. Değerlendirilmesi <ol><li> 4 o C ya da oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile bir mikrofüj tüpüne BM aspirasyon ve yerden alınan Pelet hücreleri. </li><li> Süpernatan aspire ve ACK alyuvar lisiz tamponu (&quot;amonyum-klorür, potasyum-&quot; lizis tamponu) içinde 500 ul pelletini. </li><li> 10 dakika boyunca, kırmızı hücre lisis tamponu hücreleri inkübe edin ve daha sonra PBS içinde 1 ml ekleyin ve o 4 C ya da oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g hızında tekrar karışımı aşağı doğru döndürün. Not: Kırmızı kan hücresi lize topağı hemen BM mononükleer hücrelerden oluşur. Bu FACS boyaması, hücre sayımı, transplantasyon, sitospin analiz ve / veya herhangi bir başka kullanım (öldürülür farelerden toplanan BM hücrelerinin kullanılacak gibi) için yeniden süspanse edilebilir. </li></ol>

<ol><li>Sundberg, R., Hodgson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspiration+of+bone+marrow+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aspiration of bone marrow in laboratory animals.</a> Blood. 4, 557-561 (1949).</li>
<li>Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+technique+for+intrafemoral+injection+and+bone+marrow+sampling+in+mouse+transplant+models%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+lymphoma%22%5BJournal%5D)">Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models.</a> Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).</li>
<li>Warner, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+cooperating+genetic+events+in+the+leukemic+transformation+of+normal+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells.</a> Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).</li>
<li>Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-initiating+cells+in+human+T-lymphoblastic+leukemia+exhibit+glucocorticoid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance.</a> Blood. 116, 5268-5279 (2010).</li>
<li>Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+isolation%2C+and+stimulation+of+quiescent+primitive+leukemic+progenitor+cells+from+patients+with+acute+myeloid+leukemia+%28AML%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML).</a> Blood. 101, 3142-3149 (2003).</li>
<li>Nolta, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gold+standard+improves%3A+a+better+assay+for+HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The gold standard improves: a better assay for HSCs.</a> Blood. 106, 1141-1142 (2005).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Purton, L., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).</li>
<li>Dykstra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+propagation+of+distinct+hematopoietic+differentiation+programs+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo.</a> Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).</li>
<li>Jordan, C., Lemischka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+systemic+analysis+of+long-term+hematopoiesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse.</a> Genes & development. 4, 220-232 (1990).</li>
<li>Challen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt3a+is+essential+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Nature genetics. 44, 23-31 (2012).</li>
<li>Hess, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+based+on+CD133+and+high+aldehyde+dehydrogenase+activity+isolates+long-term+reconstituting+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells.</a> Blood. 107, 2162-2169 (2006).</li>
<li>Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+myeloerythroid+repopulation+after+intrafemoral+transplantation+of+NOD-SCID+mice+reveals+a+new+class+of+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells.</a> Nat Med. 9, 959-963 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Seri BM aspirasyon insanlarda hematolojik hastalıkların klinik araştırma için kritik bir rutin bir işlemdir. Uzun deneyler boyunca hücresel bileşiminde ve BM bileşenlerinin karakterizasyonu için farelerde DM&#39;nin benzer bir seri örnekleme gerçekleştirme yeteneği aynı şekilde çok değerlidir. Bu prosedür, fare ödün vermeden, aynı zamanda periferik kan içeriği BM yaşayan hücrelerin yansıtıcı olmayabilir durumda BM ek hücre tiplerinin varlığını tespit etmek için HSPC en karakterizasyonu için yararlıdır. Seri BM aspirasyo...

Tüm kan hücreleri hematopoetik kök hücrelerden (HSC'ler) türetilir. Farelerde ve insanlarda HSC'lerin büyük çoğunluğunun bulunduğu kemik iliğine (BM) hayvan kurban etmeye gerek kalmadan erişime izin veren prosedürler, hematopoez kaynağını seri olarak izlemek için bir kaynak sağlar. Burada açıklanan prosedürün genel amacı, farelerin feda edilmesi yoluyla BM hücrelerinin geleneksel olarak toplanmasıyla elde edilecek hücrelerin materyal temsilini sağlayan canlı farelerin uyluk kemiğinden BM hücrelerinin örneklenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlamaktır. Bu prosedürün BM hücrelerinin konvansiyonel hasadına göre avantajı, bu prosedürün farelerin feda edilmesini gerektirmemesi ve bu nedenle farelerin kemik iliği bölmesinin zaman içinde uzunlamasına çalışmasına izin vermesidir. 
Her ne kadar bu murin kemik iliği aspirasyon prosedürü bir dizi çalışmada kullanılmış ve daha önce tarif edilmiş olsa da (bakınız Sundberg ve ark. Tarihsel bir inceleme için1), bu tekniği gösteren resmi adım adım prosedürler daha önce yayınlanmamıştır. Bu protokol, fareye eksojen olarak sokulan hücrelerin BM'sindeki aşılamanın değerlendirilmesi (örneğin ksenogreft çalışmalarında yapılacağı gibi) gibi amaçlar için BM'nin rutin seri örneklemesini mümkün kılar (örneğinksenogreft çalışmalarında yapılacağı gibi), periferik kanınkiyle karşılaştırmak için BM'deki kimerizmin analizi (sonuçların mutlaka uyumlu olmadığı durumlarda), hematopoietik kök ve progenitör hücreler gibi normalde ilikte zenginleştirilmiş spesifik hücre tiplerinin bolluğunun izlenmesi, ve ex vivo kültür ve / veya transplantasyon için BM hücrelerinin alınması. Ek olarak, ilik içeriğinin değerlendirilmesi, hematolojik hastalığın murin modellerinde çok yararlı olabilir, çünkü aspirasyon, periferik kanda hastalığın belirgin olmadığı zaman noktalarında hematolojik hastalık yükünü değerlendirmede yardımcı olur3-5. Ayrıca bu teknik, kemik iliğindeki hematolojik hastalığın terapötik çalışmalarda kullanılan ilaçlara yanıtını değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu nedenle, burada açıklanan prosedür, sitolojik analiz, akış sitometrik analizi, in vitro kültür ve / veya in vivo transplantasyon çalışmaları için farelerden kemik iliği hematopoietik hücrelerine farelere fedakarlık veya zarar vermeden erişim elde etmek isteyen araştırmacılar için idealdir. 
Burada tarif edilen BM örnekleme protokolü, materyalin doğrudan kemik iliği boşluğuna intrafemoral enjeksiyonu için kullanılan tekniğe oldukça benzer3,6. Temel fark, bu protokolün, intrafemoral enjeksiyonda olduğu gibi materyali doğrudan kemik iliği boşluğuna damlatmak yerine, hücrelerin ilikten çıkarılması prosedürünü detaylandırmasıdır.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>PAA</td><td>K41-001</td><td></td></tr><tr><td>ACK lizis tamponu</td> 1 L'de <td>ev yapımı</td><td></td><td>pH 7.2 ~ 7.4'ü ayarlayın ve 0.22 & mu ile steril filtreleyin; m vakum filtresi.</td></tr><tr><td>8.3 g Amonyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>1 g Potasyum bikarbonat</td><td>Fisher Scientific</td><td>P184-500</td><td></td></tr><tr><td>200 & mu; l 0.5 M EDTA pH 8</td><td>Gibco</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15-842</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml Tüberkülin şırıngası 27.5 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Steril hücre süzgeci 70 & mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran, USP</td><td>Attane</td><td>NDC:66794-014-25</td><td></td></tr><tr><td>Künt uçlu iğne</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>28110</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide iğne 23 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Şırınga Luer-Lok ucu</td><td>Becton Dickinson</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü ile muamele edilmiş plaka, 6 Kuyu</td><td>Becton Dickinson</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>12 x 75 mm 5 ml tüpler&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>352054</td><td>FACS boyama</td></tr><tr><td>12 x 75 mm 5 ml tüp hücre süzgeç kapaklı</td><td>Becton Dickinson</td><td>352235</td><td>FACS boyama</td></tr><tr><td>NK1.1 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>108723</td><td></td></tr><tr><td>CD11b APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>101225</td><td></td></tr><tr><td>CD45R (B220) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103223</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>100222</tr><tr><td>Ly-6G ve Ly-6C (Gr-1) APC-CY7</td><td>Biyoefsane</td><td>108423</td><td></td></tr><tr><td>Ter119 APC-CY7</td><td>Biyoefsane</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APC-CY7</td><td>Biyoefsane</td><td>302217</td><td></td></tr><tr><td>CD4 APC-CY7</td><td>Biyoefsane</td><td>317417</td><td></td></tr><tr><td>CD117 (c-KIT) PE</td><td>Biyoefsane</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6A/E (Sca-1) PE-CY7</td><td>Biyoefsane</td><td></td><td></td>122513</tr><tr><td>CD34 APC Biolegend</td><td></td><td>128612</td><td></td></tr><tr><td>CD16 / 32 e450 eBioscience</td><td></td><td>48-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4 & prime ;, 6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>STEMCELLTECHNOLOGIES</td><td>3434</td><td>Metoselüloz kültürü için</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Crescent Chemical Şirket</td><td>C11045850</td><td>1 doz (5mg / kg) & nbsp;</td></tr><tr><td>Akış sitometresi, LSRFortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puralube veteriner merhemi (steril vazelin oftalmik merhem)</td><td>Dechra-US</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

canlı farelerde femoral kemik İliği aspirasyon

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Kemik iliğinin (BM) hücresel bileşiminin seri örneklemesi, klinik hematoloji için kritik olan rutin bir prosedürdür. Bu protokol, BM'de bulunan hücrelerin seri karakterizasyonuna izin veren canlı farelerde benzer bir prosedür için ayrıntılı bir adım adım teknik prosedürü açıklar. Bu prosedür, örneğin ksenogreft çalışmalarında olduğu gibi, farelerin BM'si içinde eksojen olarak uygulanan hücrelerin varlığını tespit etmeyi amaçlayan çalışmaları kolaylaştırır. Ayrıca, bu prosedür, hematopoietik kök ve progenitör hücreler (HSPC'ler) gibi BM'de zenginleştirilmiş hücrelerin farelerden fedakarlık edilmeden alınmasına ve karakterizasyonuna izin verir. Periferik kanın hücresel bileşiminin, kemik iliğinde bulunan kök ve progenitör hücrelerin oranlarını ve tiplerini mutlaka yansıtmadığı göz önüne alındığında, farelerin sonlandırılmasını gerektirmeden bu bölmeye erişim sağlayan prosedürler çok faydalıdır. Femoral kemik iliği aspirasyonunun kullanımı, kemik iliği hücrelerinin sitolojik analizi, hematopoietik kök / progenitör kompartmanın akış sitometrik karakterizasyonu ve konvansiyonel ilik hasadı ile karşılaştırıldığında femoral BM aspirasyonu ile elde edilen sıralanmış HSPC'lerin kültürü için burada gösterilmiştir.

Canlı bir C57/B6 fare femur BM aspirasyon kurban etme işleminden sonra, aynı fare BM geleneksel hasat ardından BM mononükleer hücreleri elde etmek için kullanılmıştır. Her iki yöntem ile elde edilen BM mononükleer hücreleri daha sonra, BM hücrelerinin (1), sitolojik analizi ile analiz (2) hematopoietik kök / progenitör hücrelerin nispi frekansı (HSPCs) belirlenmesi ve sıralanmış HSPCs (3) ex vivo kültür edilmiştir. Ikinci deney, soy-negatif SCA1 + c-KIT In + (LSK&#39;ya) hücreleri BM aspirasyon ile hem de BM ge...

Bu protokol, farelerin kurban edilmesini gerektirmeden femur kemik iliğinin (BM) seri örneklemesi için bir prosedürü tanımlar. Bu prosedür, farelerin BM bileşiminin zaman içinde uzunlamasına çalışmalarını kolaylaştırır ve ex vivo ve transplantasyon çalışmaları için BM içindeki hücrelere seri erişim sağlar.

Canlı Farelerde Femoral Kemik İliği Aspirasyon

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Bu prosedürün genel amacı, canlı bir farenin femoral ilik boşluğundaki kemik iliği hematopoetik hücre içeriğini güvenli bir şekilde aspire etmektir. Bu işlem, öncelikle bir tüberkülin şırıngasının PBS ile yıkanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, farenin bacağı kemik iliği alımı için optimal açıda dikkatlice konumlandırılır.Ardından, hematopoetik hücreler femur iliği boşluğundan aspire edilir ve eritrositler uzaklaştırılır. Sonuç olarak, kemik iliği içeriğinin başarılı bir şekilde aspire edildiği akış sitometrik ve sitolojik analizlerle görselleştirilebilir. Prosedür, laboratuvarımızdan çok yetenekli bir teknisyen olan genç Rock Chung tarafından gösterilecektir.Bu tekniğin, konvansiyonel kemik iliği hasadı gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, hayvanı devam eden gözlem ve seri analizler için hayatta bırakırken kemik iliğinin hematopoetik hücrelerinin bir kısmının geri kazanımına olanak tanımasıdır. F, ayak parmak sıkıştırma testi ile sedasyon onaylandıktan sonra, kornea kurumasını önlemek için anestezize edilmiş farenin gözlerine oftalmik pomad uygulayın ve cildi açığa çıkarmak için bacağı tıraş edin. Ardından, bölgenin önce klorheksidin dezenfektanıyla ovalanması ve ardından alkollü pamukla silinmesi şeklinde cildin steril cerrahi hazırlığı gerçekleştirilir.Bu işlem üç kez tekrarlanır ve her hayvan için yeni, açılmamış steril bir şırınga ve iğne kullanılır. Uygun anestezi düzeyine ulaşıldığını doğrulayın. Ardından, 0,5 mililitrelik bir tüberkülin şırıngasını steril PBS ile ıslatın; sonrasında 200 ila 500 mililitre salin çözeltisini aspire edin ve hemen ardından iki ila üç kez dışarı püskürtün.Ardından, femur kondiler boşluğunun açığa çıkmasını ve iğnenin yerleştirilmesini kolaylaştırmak için bir elin son iki parmağından birini kullanarak tibia'yı femur'dan dışarıya doğru hafifçe bükün. Şimdi, iğneyi patellar tendon üzerinden, femur'un iki kondili arasına güvenli bir şekilde yerleşecek şekilde batırın. İğnenin kemik şaftına kolayca yerleştirilebilmesini sağlamak için diğer elin baş ve işaret parmağını kullanarak diyafizi femur'un epifizine yakın bir yerden tutun.Şırıngada kan görülmüyorsa, muhtemelen küçük bir kemik veya doku parçası iğneye takılmıştır. Pistonun PBS içinde aşağı yukarı hareket ettirilmesiyle bu parça iğneden çıkarılabilir. Doku şırıngadan çıkarılamıyorsa, yeni bir iğne ve şırınga kullanın.Şırıngayı tekrar 200 ila 500 µL PBS ile ıslatın. Ardından, iğneyi femur şaftına paralel olacak şekilde kondiler boşluğa doğru iterken saat yönünde ve saat yönünün tersine döndürün. Bu işlem, femur şaftındaki kemik iliği içeriğinin geri alınmasını kolaylaştırmak içindir.İğneyi yavaşça femoral ilik boşluğuna iterken saat yönünde ve saat yönünün tersine çevirin. Şırıngayı hafifçe yanlara hareket ettirerek iğnenin doğru konumlandırıldığını onaylayın. Ardından, iğneyi kemik iliği boşluğu içinde ileri geri hareket ettirirken şırınga pistonunu nazikçe geri çekerek negatif basınç oluşturun.Başarılı aspirasyon, şırınganın tabanındaki iğnenin üst kısmında kan görünmesiyle teyit edilecektir. Kemik iliği femurdan başarıyla aspire edildikten sonra, iğneyi kemikten çıkarın ve aspire edilen kemik iliğini, buz üzerinde 500 µL PBS ile önceden doldurulmuş bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Analjezik uygulamasının ardından, fareleri konaklama alanına geri götürmeden önce bir ısı lambası altında iyileşmelerine izin verin.Farelerin yürüyebildiğinden ve yiyecek ile suya ulaşabildiğinden emin olun. Ardından fareyi kafesine geri koyun ve prosedür sonrası sonraki 24 saat boyunca hayvanı stres veya enfeksiyon belirtileri açısından gözlemleyin. Bu sırada, kemik iliği hücrelerini santrifüjleyin, PBS'yi dikkatlice aspire ederek çekin ve peleti yeniden süspanse edin.10 dakika sonra, 500 mikrolitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ile işlem gören hücreleri bir mililitre PBS içinde yıkayın. Pellet, deneysel analizler için kullanılabilecek mononükleer kemik iliği hücrelerini içerir. Bu ilk şekiller, femoral kemik iliği aspirasyonu veya geleneksel kemik iliği hasadı kullanılarak yapılan morfolojik ve akış sitometrik analizler sonucunda, dökme hücrelerin ve hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin benzer tip ve oranlarının nasıl gözlemlenebileceğini göstermektedir.Burada, üç bağımsız aspirasyon ve konvansiyonel kemik iliği hasadında, toplam canlı hücrelerin frekansı olarak lineage negatif SKA one pozitif C kit pozitif ve myeloid progenitör alt popülasyonlarının yüzdesi gösterilmiştir. Bu veriler, femoral aspirasyonla toplanan kemik iliğinde, konvansiyonel kemik iliği hasadına kıyasla lineage negatif SKA one pozitif, C kit pozitif ve myeloid progenitör alt popülasyonlarında bir azalma olduğunu ortaya koymaktadır. Bu fark, popülasyon için istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır.Buna karşın, lineage negatif ska bir pozitif cki pozitif hücrelerin ayrıştırılması ve ardından Metilselüloz içerisinde ex vivo kültüre edilmesi, femoral kemik iliği aspirasyonu ile elde edilenlere benzer koloni sayıları ve hücre tipleriyle sonuçlanır. Konvansiyonel kemik iliği hasadında olduğu gibi, her iki kültürde gözlemlenen ve sayılan koloni tipleri arasında granülosit, eritrosit, monosit ve megakaryosit koloni oluşturan birimler, granülosit ve monosit koloni oluşturan birimler ve eritroid burst oluşturan birimler yer alır. Bu prosedür uygun şekilde uygulandığında, teknik fare başına 10 dakikada tamamlanabilir.İmmün yetmezliği olan farelerde, insan hematopoetik hücrelerindeki xenograft etkisinin ne olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için intra femoral kemik iliği enjeksiyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

femoral-bone-marrow-aspiration-in-live-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Hayvan modelleri sık kemik kanseri metastazı araştırmak için kullanılmaktadır. Bu protokolü biz kemik metastazı çalışmaları için tümör inokülasyonu iki genel metot tanımlamak ve kısaca bu modeller izlemek ve ölçmek için kullanılan analizler bazı anlatacağız.

Kemik Metastaz Modelleri

Bu videoda, lösemi gibi kan hastalıkları olan hastalarda tüm BM kusurlarını araştırmak için farenin arka bacaklarından taze tüm kemik iliğini izole etmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

Fare Arka Uzvundan Kemik İliği Alımı

Monositler, doğuştan gelen bağışıklığın anahtar düzenleyicileridir ve periferik mononükleer fagositik sistemin yenilenmesinde ve iltihaplanma durumunda kritik bir rol oynarlar. Bu el yazması, monosit mobilizasyon mekanizmasını incelemek için fare kalvaria kemik iliğinin gerçek zamanlı görüntüleme prosedürünü açıklamaktadır.

Fare Kemik İliği monositlerin Takip<em&gt; İn Vivo</em

Kemik iliğindeki histolojik verileri kantitatif olarak analiz etmek için bir strateji sunulmuştur. Doku kesitlerindeki floresan etiketli hücrelerin konfokal mikroskobu, otomatik olarak analiz edilen 2 boyutlu görüntülerle sonuçlanır. Farklı hücre tiplerinin birlikte lokalizasyon analizleri, simüle edilmiş görüntülerden elde edilen verilerle karşılaştırılarak hücresel etkileşimler hakkında nicel bilgiler verilir.

Hematopoetik Hücre Otomatik Ölçümü - undekalsifiye Kemik histolojik Görüntüler stromal hücre etkileşimleri

Protokol, femoral kemik iliğindeki hücrelerin hareketini in vivo olarak izlemek için kullanılabilecek yeni bir murin femur pencere odası modelini tanımlar. İntravital multifoton floresan mikroskobu, zaman içinde femur kemik iliğinin üç bileşenini (vaskülatür, kollajen matrisi ve nötrofiller) görüntülemek için kullanılır.

için Femur Pencere Odası Modeli<em&gt; İn Vivo</emFare Kemik İliği içinde&gt; Hücre Takibi

İntravital Floresans mikroskobu (IVFM) hasta, posta ve kemik iliği (BM) niş içine hematopoetik hücrelerin engraftment çalışmaya genetik hayvan modelleri ile birlikte uygulanır.

Intravital floresan mikroskobu (IVFM) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin Engraftment Dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek

Fare kapalı femur kırığı kırık iyileşmesi eğitim için güçlü bir platform ve kemik rejenerasyon hızlandırmak için yeni tedavi stratejileri modelidir. Cerrahi bu iletişim kuralı tek taraflı kapalı femur kırık uyluk kemiği stabil İntramedüller çelik çubuk kullanarak farelerde oluşturmak için hedeftir.

Farelerde kapalı femur kırığı nesil: kemik şifa çalışması için bir Model

Burada, fare veya insan yüksek boyutlu kitle sitometri için izole taze kemik iliği (BM) işlemek için bir protokol sunuyoruz (zaman-of-Flight ile sitometri, CyTOF) nötrofil-köklü hücrelerin analizi.

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

Kemik iliği naklinin (BMT) üç yöntemini tarif ediyoruz: toplam vücut ışınlamalı BMT, korumalı ışınlamalı BMT ve fare modellerinde klonal hematopoez çalışması için ön koşullandırması olmayan BMT yöntemi (benimseyen BMT).

Klonal Hematopoez Çalışması İçin Farelerde Kemik İliği Nakli İşlemleri

Bu protokol, gen düzenlenmiş hücreler de dahil olmak üzere birkaç hematopoietik veya lösemik kök hücrenin murin ksenogreft modellerinde intrafemoral enjeksiyonunu tanımlar, bu da sadece hücrelerin hızlı ve güvenli bir şekilde nakledilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda kemik iliğinin seri analizlerini de sağlar.

Canlı fareler kullanılarak yapılan basitleştirilmiş intrafemoral enjeksiyonlar, sürekli kemik iliği analizine izin verir

Burada, miyelodisplastik sendromlar ve akut miyeloid löseminin murin modellerinden kemik iliği mikroçevre popülasyonlarını izole etmek ve karakterize etmek için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu teknik, endotelyal ve mezenkimal stromal hücreler dahil olmak üzere hematopoietik olmayan kemik iliği nişindeki değişiklikleri hastalık ilerlemesi ile tanımlar.

Miyelodisplastik Sendrom ve Akut Miyeloid Lösemide Kemik İliği Mikroçevresel Popülasyonlarının Belirlenmesi

Öğrenin, canlı farelerde femoral kemik iliği aspirasyonu yöntemiyle hematopoietik hücreleri tekrarlayan örnekleme için nasıl elde edebilirsiniz. Bu etik teknik, uzunlamasına çalışmalara olanak tanır.

Canlı Farelerde Femoral Kemik İliği Aspirasyon

Daha fazla video keşfet