Name: Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-09T21:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Öğrenin, eşodaklı mikroskopi kullanarak izole fare alveoler makrofajlarının Aspergillus sporlarının büyümesini nasıl kontrol ettiğini. Bu yöntem, fungal enfeksiyonlara karşı bağışıklık yanıtlarını anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Ulusal Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Enstitüsü Hibe R01AI079253 (BHS için) tarafından desteklenen edildi ve Ulusal Kanser Enstitüsü Kanser Merkezi Destek Hibe CA016056 tarafından Roswell Park Kanser Enstitüsü.

Bu çalışmada, hayvanlar üzerinde yapılan tüm işlemler Roswell Park Kanser Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve federal tüm devlet, uyulması ve Sağlık düzenlemeler National Institutes edildi. 1.. In vivo Makrofaj Etiketleme Not: PHK26 (iv) intravenöz olarak uygulandığında dolaşımdan ve dokularda hem fagositik hücreler tarafından alınacak bir lipofilik boyadır. PKH26 makrofaj hasat sonrası işleme miktarını en aza indirmek için in vivo etiketlenmesi için kullanılmıştır. PKH-26 sabit bir şekilde uzun süreler boyunca alveolar makrofajlar biriken avantajına sahiptir. 10 gün uygulanmasından sonra bekleme PKH26 8, 9 sadece alveolar makrofaj kararlı biçimde ayrılan işaretli dolaşımdan her etiketli hücrelerin temizlenmesi için olanak sağlar. PKH26 uyarma (551 nm) ve emisyon (567 nm) özellikleri uyumlu olan kırmızı florokromla olduğunurodamin veya fikoeritrin algılama sistemleri ile. Herhangi bir etiketleme prosedürü canlılığı kaybı da dahil olmak üzere, paraziti tanıtabilirsiniz. Biz farklı fare genotipleri makrofajların etiketleme için aynı yaklaşım kullanmak Ancak, (örneğin, WT vs NADPH oksidaz eksikliği), bu eserlerin etkileri düzgün olur. <ol><li> PKH26 stok solüsyonu (etanol içinde 1 x 10 -3 M) üretici tarafından sağlanan seyreltici C 01:05 sulandırmak. </li><li> Her bir fare için bir 1/2 ml insülin şırınga (29 G x 1/2 &quot;) ile seyreltilmiş PKH26 yükleyin 100 ul. </li><li> Hasat için en az 10 gün önce iv enjeksiyonu (kuyruk ven veya retro orbital ya) tarafından farelere yönetmek. </li></ol> Bronchoalveolar Lavage 2. Hasat Alveoler Makrofajlar (BAL) Bir deney için kullanılacak farelerin sayısı değişebilir. Bir uyarılmamış fareden tipik bir verim 3-5 x 10 5 alveolar makrofajlar aralığında, ancak bu sayı bas büyük ölçüde değişebilirbu lavaj yapan kişinin fare, deneyim boyutu ve lavaj sıvısı ve akciğer geri çekilen hacim instilasyon sayısı gibi faktörlere ed. Bu protokolde, akciğer yıkama tekrar 1 mi tabi tutulmuş yıkama sıvıları ile birlikte hücre verimini artırmak için yardımcı olan bir kapalı göğüs boşluğu ile gerçekleştirilir. <ol><li> Steril çözelti tutmak için aseptik koşullar kullanılarak avertin anestezik öldürücü bir doz (12.5 mg) intraperitoneal (ip) verilmesi ile fare Euthanize. </li><li> % 70 etanol ile iyice fare sprey. </li><li> Göğüs (Şekil 1A) açığa hayvanın kafatası ucundan cilt kaldırmak. <ol><li> Diyaframın hemen altında deri küçük bir kesim olun. </li><li> Kesim içine parmağınızı yerleştirin ve uzak hayvan (Şekil 1A) kranial ucundan cilt çekin. </li><li> Boynun ventral tarafı (Şekil 1A) uzanan kafasına hafifçe yukarıya doğru itilir. </li></ol></li><li> Göğüs kafesi ile küçük bir delik kestitoraks sağ tarafına akciğerlere söndürülmesi ve ayrıca aşağıdaki adımları sırasında akciğerlerin görüntülenmesine olanak vermek üzere. </li><li> Trakea bulun ve dikkatle çevresi dokuları uzak teşrih. <ol><li> Kavisli bir forseps ile tükürük bezleri, sternohyoid kasları ve gırtlak vb çıkarın. </li><li> Dikkatle kavisli bir forseps ile kaldırın ve makas ile yatan halkalı kıkırdak yapısını ortaya trakea (adventita) kapsayan ince dokuyu kesip. </li></ol></li><li> Trakea içine kateter yerleştirin. <ol><li> Kavisli bir forseps kullanarak, trakea (dorsal) arkasında bir sütür koyun ve açıklıktan 10 cm uzunluğa çekin. </li><li> Krikoid (kıkırdak kalınlaşmış halka) Yukarıdaki başlayarak dikkatlice trakea göğüs kemiğinin arkasında kaybolur nerede durdurma trakea aşağı bir 22 G kateter kılavuz. </li><li> Sıkıca oturması için trakea ve kateter çevresinde dikiş kravat. Kateter iğne çıkarılır. </li></ol></li><li> 4-yollu valf birleştirin. <ol><li> DoldurmakBir 6 ml DPBS,% 1 FBS ile şırınga ve Şekil 1B &#39;de gösterildiği gibi 4-yollu musluk ekleyin. </li><li> 4-yollu vana (Şekil 1 B) üzerinde gösterilen konumda bir boş 6 ml şırınga takın. </li><li> Kateter 4-yollu musluk (Şekil 1B) açık portu takın. Trakea kateteri çıkarmak için dikkatli olun. </li></ol></li><li> Akciğerlerden lavaj sıvısı toplayın. Not: Müfettişler dokuya hasar olasılığını en aza indirmek için lavaj sıvısının düşük miktarlar kullanmayı tercih edebilir. Aynı yaklaşım, sürekli olarak, tüm fare gruplarının uygulanabilir önemlidir. <ol><li> Böylece boş şırınga kapalı musluğu kolunu çevirin ve yavaş yavaş akciğerleri şişirmek için ~ 1 ml DPBS,% 1 FBS enjekte. Adım 2.4 delik kesme yoluyla akciğer enflasyonu gözlemleyin. </li><li> Akciğerleri overinflate için değil dikkatli olun. </li><li> Tam şırınga kapalı böylece musluğu kolunu açın ve dikkatlice grip çekilme<html> akciğerlerden gelen kimliği. </li><li> Akciğerler Adım 1.4 delik kesim aracılığıyla Söndür gözlemleyin. Kateter iyi bir beraberlik almak için biraz ileri veya geri hareket edilmesi gerekebilir. Trakea içinde kateteri tutmak için özel önlem alın. </li><li> Tekrar FBS% 1 enjekte ve akciğerlerden çekilmiş olan tüm DPBS&#39;de kadar 2.8.1-2.8.4 5-6x adımları. Not: akciğer sıvısının kurtarma enjekte edilen sıvının% 100 olmayacaktır. </li></ol></li><li> 50 ml konik tüp içine lavaj sıvısı ile boş şırınga. Oda sıcaklığında hücrelere tutun. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler ve süpernatant Pelet dökün. İstenirse bu sitokin analizi için kaydedilebilir. </li><li> % 10 FBS ile 1-5 ml RPMI 1640 hücreleri tekrar süspansiyon ve menositometrede saymak. Uyarılmamış fare olarak, BAL ile hasat hücrelerin&gt;% 95 sitolojisi ile teyit edilebilir makrofajlar, olması beklenmektedir. </li></ol> 3.. Kültüre ve Hasat Mantar &quot;&gt; Bu protokolde kullanılan Aspergillusfumigatus kendi yaşam döngüsünün tüm aşamalarında GFP ifade:. Sporlar, germlings ve hif Bu mantar gerginlik Dr Margo Moore, Simon Fraser Üniversitesi, Vancouver, BC, Kanada tarafından sağlandı. <ol><li> Kloramfenikol (0.05 g / L) ve gentamisin (0.5 g / L) ile yatık Sabouraud agar beyin kalp infüzyon (BHI) üzerine, GFP ifade eden bir Aspergillus fumigatus soyu Levha conidia. </li><li> Gevşek olarak oda sıcaklığında 7-10 gün boyunca kapatılmış karanlıkta inkübe edin. </li><li> DPBS içinde% 0.01 Tween 20 içinde 10 ml yıkama eğik Hasat conidia. Hafifçe gevşetmek için stripette ile mantar kazıyın. Verimi artırmak için Eğimli birkaç kez durulayın. </li><li> 50 ml konik içine 100 mikron hücre süzgecinden konidial süspansiyon geçmektedir. </li><li> 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj ile pelet conidia. </li><li> Süspanse 50 ml DPBS&#39;de konidya ve Hemasitometre kullanarak saymak. </li><li> DPBS ile iki kez yıkanır ve arzu edilen konsantrasyon, seyreltinyon. </li></ol> 4. Mantar Mücadelesi ve Konfokal Mikroskopi Konak savunmasında makrofaj NADPH oksidaz rolünü araştırmak için, fagosite Aspergillus sporlarının büyümesini kontrol etmek için üç genotip farelerden izole alveoler makrofaj kabiliyeti değerlendirildi. Bu çalışmada kullanılan genotipleri arasında; Doğal olarak meydana gelen mutasyona Ncf1 (Ncf1 olanağına NADPH oksidaz den yoksun bırakarak p47 pHOx, fagosit NADPH oksidaz gerekli bir bileşeni) için kodlayan ve 3) Ncf1 * / 1), vahşi tip fareler, 2) Ncf1 / * Mn-farenin * Mn + transjenik farenin NADPH oksidaz aktivitesi monosit / makrofaj nüfus 10, 11 içinde yeniden edilmiştir (MN insan CD68 promotörünün kontrolü altında yabani tip Ncf1 barındıran transgeni ifade eder.) Konfokal mikroskopi en nedeniyle varlığı Bu deneme için uygundurve slaytlarda olmayan fagosite Konidyumların büyüme. Konfokal mikroskop Z-ekseni içinde bireysel uçaklarının görselleştirme için izin ve makrofaj içeride ziyade çevresinde büyüyen mantar arasındaki farklılaşmayı sağlayacak. Tüm konfokal görüntüler 63X immersiyon yağı lens kullanılarak elde edilir. Z-yığınlar 2.5 elektronik zum faktörü ile elde edilir. Z-yığın kalınlığı alanın üst ve alt kısmını için DAPI ve parlak saha görüntüleri kullanılarak belirlenir. Z-yığınlar ~ 1 mikron kalınlığında 14 bireysel dilimleri ile 24 mikron arasında değişmektedir. Makrofaj ölçümü için, 1X elektronik zum tek taramalar genotipi için 10 alanları üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bozulmamış makrofajlar, sırasıyla PKH26 ve membran ve çekirdeğin DAPI lekelemesi göre tespit edilmiştir. Konidya FITC ifadesi ve parlak bir alan görüntüye göre belirlenmiştir. <ol><li> Steril lamelleri ve tabak hazırlayın <ol><li> Bir Biyolojik Güvenlik Kabinesi altında,% 70 etano 22 x 22 mm cam lamelleri emmek5-10 dakika için l. </li><li> Steril PBS lamelleri durulayın. </li><li> Steril forseps kullanılarak, yumuşak, tek başına steril paketlenmiş 6 oyuklu plakanın her bir alt tek bir lamel yerleştirin. </li></ol></li><li> Tohum ~ 1 x 10 6 PKH26 her bir lamel üzerine alveolar RPMI 1640 300 ul içerisinde süspansiyon haline makrofajlar,% 10 FBS etiketli hasat edildi. Tam sayı hasat verimi bağlı olarak değişebilir. </li><li> Makrofaj gece boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edilerek uygun izin verin. </li><li> Sonraki sabah, yaklaşık 1 x 10 7 GFP-ifade A. eklemek fumigatus conidia 100 ul önceden ısıtılmış (37 ° C) RPMI 1640,% 10 FBS içinde süspanse. </li><li> % 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör plaka dönün. </li><li> Hücreler, 4 ° C&#39;de ya da gece boyunca oda sıcaklığında 2 saat arasında, en az sabit olmalıdır Eşit her bir% 2 formaldehit hacmi de (nihai konsantrasyon% 1 formaldehit) ilave edilerek 3, 7 ve 14 saat düzeltme hücre. Için yer plakalarıgece boyunca 4 ° C &#39;de, erken zaman noktalarında. Son zaman noktasında (14 saat) için, 2 saat boyunca oda sıcaklığında hücreleri saptamak. </li><li> Fiksasyon sonra, yavaşça forseps kullanarak lamelleri kaldırmak ve DPBS&#39;de durulayın. </li><li> Katlanmış Kimwipe lamel kenarına koyarak fazla sıvıyı çıkarın. </li><li> Bir cam mikroskop lamı DAPI ile 6 ul floresan montaj orta uygulayın. </li><li> Slayt üzerinde lamel bir kenarını yatırın ve yavaşça montaj ortama hücre aşağı tarafı bırakın. Orta montaj yayılmış ve lamel altında düz bir tabaka oluşturacak. Lamel basın gerek yoktur. </li><li> Şeffaf tırnak cilası ile lamel kenarları mühür ve kurumaya bırakın. </li><li> Mağaza konfokal mikroskopi ile analiz etmek için hazır olana kadar oda sıcaklığında (ışıktan korunarak) slayt kutu içinde hazırlanan slaytlar. </li></ol>

<ol><li>Reeves, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+activity+of+neutrophils+is+mediated+through+activation+of+proteases+by+K%2B+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux.</a> Nature. 416, 291-297 (2002).</li>
<li>Bianchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2622 (2009).</li>
<li>Vethanayagam, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+NADPH+oxidase+versus+neutrophil+proteases+in+antimicrobial+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Grimm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-+and+Macrophage-Targeted+NADPH+Oxidase+Mediates+Antifungal+Host+Defense+and+Regulation+of+Acute+Inflammation+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice.</a> The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).</li>
<li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+protection+against+conidia+by+mononuclear+and+against+mycelia+by+polymorphonuclear+phagocytes+in+resistance+to+Aspergillus.+Observations+on+these+two+lines+of+defense+in+vivo+and+in+vitro+with+human+and+mouse+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).</li>
<li>Philippe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+Aspergillus+fumigatus+by+alveolar+macrophages+is+mediated+by+reactive+oxidant+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates.</a> Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).</li>
<li>Cornish, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+nicotinamide+adenine+dinucleotide+phosphate+oxidase-independent+resistance+to+Aspergillus+fumigatus+in+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages.</a> J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).</li>
<li>Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+recruited+to+the+lungs+of+mice+during+immune+inflammation+ingest+apoptotic+cells+poorly%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).</li>
<li>Davidson, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DISCRIMINATION+OF+RESIDENT+AND+INFILTRATED+ALVEOLAR+MACROPHAGES+BY+FLOW+CYTOMETRY+IN+INFLUENZA+A+VIRUS-INFECTED+MICE%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Lung+Research%22%5BJournal%5D)">DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE.</a> Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).</li>
<li>Gelderman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+suppress+T+cell+responses+and+arthritis+development+in+mice+by+producing+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species.</a> J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).</li>
<li>Pizzolla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+produced+by+the+NADPH+oxidase+2+complex+in+monocytes+protect+mice+from+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections.</a> J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).</li>
<li>Luther, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+phagocytic+uptake+of+Aspergillus+fumigatus+conidia+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages.</a> Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).</li>
<li>Geunes-Boyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+Protein+D+Increases+Phagocytosis+of+Hypocapsular+Cryptococcus+neoformans+by+Murine+Macrophages+and+Enhances+Fungal+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival.</a> Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).</li>
<li>García-Rodas, R., González-Camacho, F., Rodríguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interaction+between+Candida+krusei+and+Murine+Macrophages+Results+in+Multiple+Outcomes%2C+Including+Intracellular+Survival+and+Escape+from+Killing%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing.</a> Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).</li>
<li>Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+from+C3H%2FHeJ+mice+show+sensitivity+to+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).</li>
<li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+polarization+of+alveolar+macrophages+and+bone+marrow-derived+monocytes+following+chemically+and+pathogen-induced+chronic+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation.</a> J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).</li>
<li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+Aspergillus+spores+depends+on+the+anatomical+source+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage.</a> Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).</li>
<li>Goodridge, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+use+of+CARD9+by+dectin-1+in+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells.</a> J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Birlikte in vivo fungal okuma ile makrofaj antifungal aktivitenin ex vivo analiz için, bu yaklaşımı kullanarak, daha önce makrofajlarda NADPH oksidaz A&#39;ya karşı savunmasında önemli bir rol oynadığını göstermiştir fumigatus 4. Izole alveolar makrofaj kullanılması, in vivo olarak Aspergillus karşı savunmak için diğer bağışıklık hücreleri (örneğin, nötrofiller işe) yokluğunda, mantarlarla mücadele etkinlikleri odaklanma sağlamaktadır. <p class="jove_c...

Alveoler makrofajlar inhale mikropları karşılaşmaya ilk basamak fagositik hücrelerdir. Makrofajlar, patojen tanıma reseptörleri tarafından Aspergillus motiflerini tanımak yemek ve teneffüs sporlar (konidia) büyümesini sınırlamak ve enflamatuar cevabı başlatabilir. Fagosit NADPH oksidaz, süperoksit anyon ve aşağı doğru, reaktif oksijen ara (ROI) moleküler oksijen dönüştürür. Kronik granülomatöz hastalık (ÇGD) ciddi bakteriyel ve fungal enfeksiyonlar ve aşırı inflamatuar yanıtlar ile karakterize NADPH oksidaz kalıtsal bir hastalıktır. NADPH oksidaz kritik olmasına rağmen nötrofil aracılı konakçı savunması için 1-3, makrofajlarda NADPH oksidaz önemi iyi tanımlanmış değildir. Önceki çalışmalar nötrofiller esas hifal sahne 5 hedef ise alveolar makrofajlar, yemek ve Aspergillus sporlar öldürmek olduğunu göstermiştir. Ancak, çelişkili resul olmuşturA. büyümesinin kontrolünde makrofajda NADPH oksidaz rolüne olarak ts fumigatus 6, 7 sporlar. Bu yöntemin amacı, bir ev sahibi savunma A&#39;ya karşı aracılık makrofajlarda NADPH oksidazın belirli bir rolü olduğunu tanımlamak için fumigatus sporlar. Biz, alveoler makrofajlar içinde NADPH oksidaz fagosite A. büyümesini kontrol bulundu fumigatus 4 sporlar. En yakından inhale mantarlara konak yanıtı modellemek için, uyarılmamış farelerin hemen kurban aşağıdaki bronkoalveoler lavaj ile hasat alveol makrofajlar kullanılır. İzole Alveoler makrofaj kullanımı in vivo Aspergillus&#39;a karşı savunmak, diğer bağışıklık hücreleri (örneğin, işe nötrofiller) yokluğunda kendi antifungaldir odaklanmak sağladı. Bu yöntemde, alveolar makrofajlar hasat sonrası işleme miktarını en aza indirmek için hasattan önce in vivo olarak boyandı. &#39;/ P&gt; Bu protokol için diğer bir avantajı, bir GFP-ifade A. kullanılmasıdır fumigatus suşu. Bu mantar hifal aşamasında konidial aşamasından GFP ifade ve daha fazla boyanma ihtiyacı yok. Daha ayrıntılı görüntüler elde etmek için, elde edilen görüntülerin üç boyutlu yapıların yeniden sağlayan konfokal mikroskopi seçti. Üç boyutlu rekonstrüksiyon hif bir makrofaj veya yoluyla çevresinde büyüyen ziyade ayırt yeteneği verir. Konidya ayrıca ekstraselüler karşı hücre içi gibi hassas ayırt edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Genel Hücre Zarı Etiketleme için PKH26 Kırmızı Floresan Hücre Bağlayıcı Kiti</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2 Tribromoetanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>Avertin Anestezik</td></tr><tr><td>2-metil-2-bütanol</td> yapmak için kullanılır <td>Sigma</td><td>A-1685</td><td>Avertin Anestezik</td></tr><tr><td>Dulbecco & # 039 yapmak için kullanılır; s Fosfat Tamponlu Salin (kalsiyum ve magnezyum olmadan)</td> <td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>NH < alt > 4 < / alt > Cl</td><td>Sigma</td><td>A0171</td><td>ACK kırmızı hücre lizis tamponu yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P91444</td><td>ACK kırmızı hücre lizis tamponu yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>ACK kırmızı hücre lizis tamponu yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>22 G x 1.00 inç iv kateter</td><td>BD</td><td>381523</td><td>Insyte Autoguard Kanatlı</td></tr><tr><td>İnsülin şırıngaları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 ml Şırıngalar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 musluk</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-700-077</td><td></td></tr><tr><td>Sütür ipliği</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml konik santrifüj tüpleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gazlı bez süngerler (4 inç kare)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>L-glutamin <td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td>ile <td>RPMI 1640</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Hiklonu</td><td>SH30396.03</td><td>ısıyla inaktive</td></tr><tr><td>edilmiş Hema 3 Leke Seti</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud Beyin Kalp İnfüzyonu Agar, Kloramfenikol ve Gentamisin Eğimleri BD ile</td><td></td><td>297252</td><td></td></tr><tr><td>Aspergillus fumigatous Dr</td><td>Margo Moore, Simon Fraser Üniversitesi, Burnaby, BC, Kanada</td>100 & mu tarafından sağlanan yeşil floresan proteini <td></td><td></td> eksprese eden suşu</tr><tr><td>; m Hücre süzgeçleri</td><td>BD Falcon</td><td>64753-00</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biyolojik Güvenlik Kabini Sınıf II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorval ST40 Salıncak kova rotorlu</td><td></td><td></td><td></td></tr> santrifüj <tr><td>Leica DM1000 ışık mikroskobu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2 santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü inkübatörü</td><td></td><td></td><td>37 > C, %5&nbsp; CO2</sub</td></tr><tr><td>>22 x 22 mm mikro kapaklı cam</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>cam lameller</td></tr><tr><td>6 kuyulu Hücre kültürü plakaları</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>%10 Nötr Tamponlu Formalin</td><td>BDH0502</td><td></td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td>ile<td>Vectashield montaj ortamı</td></tr> Lazer <tr><td>nokta tarayıcılı Leica TCS SP2 sistemi</td><td></td><td></td><td>DMIRE2 floresan mikroskobu üzerine monte edilmiştir</td></tr></tbody></table>

eşodaklı mikroskopi İzole alveoler makrofagların anti-fungal hareketi değerlendirilmesi

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Akciğer konak hücreler rutin mikropların ve mikrobiyal ürünlere maruz bir arayüz. Alveoler makrofajlar inhale mantar ve diğer mikropları karşılaşmaya ilk basamak fagositik hücrelerdir. Makrofajlar ve diğer bağışıklık hücreleri, patojen tanıyan reseptörler ile Aspergillus motifleri tanımak ve alt-enflamatuar cevap başlar. Phagocyte NADPH oksidaz reaktif oksijen ara ürünleri (ROI) üretir ve konak savunma için önemlidir. NADPH oksidaz kritik olmasına rağmen nötrofil aracılı konakçı savunması için 1-3, makrofajlarda NADPH oksidaz önemi iyi tanımlanmış değildir. Bu çalışmanın amacı A&#39;ya karşı konak savunmasını arabuluculuk makrofajlarda NADPH oksidaz belirli bir rol tasvir oldu fumigatus. Biz, alveoler makrofajlar içinde NADPH oksidaz fagosite A. büyümesini kontrol bulundu fumigatus 4 sporlar. Burada, fare yeteneğini değerlendirmek için bir yöntem tariffagosite Aspergillus sporlar (conidia) büyümesini kontrol etmek için lveolar makrofajlar (AMS). Alveol makrofajlarının, in vivo olarak, lekeli ve on gün sonra, bronkoalveoler lavaj (BAL) ile farelerden izole edilmiştir. Makrofajlar, cam kapak slipleri üzerine plakalanmıştır, daha sonra yeşil floresan protein (GFP)-ifade eden A ile tohumlandı fumigatus sporlar. Belirtilen zamanlarda, hücreler sabitlenir ve fagosite sporlarla sağlam makrofaj sayısının konfokal mikroskobu ile tespit edilir.

<html> Stimüle edilmemiş farelerden BAL ile alveolar makrofajlar Toplama sitoloji göre bir&gt;% 95 saf bir nüfus neden olur. 3 ve 7 saat (Şekil 2) saat puan fungal büyümenin hipal aşamasını önüne ve genotipler arasında konidia fagositik etkinliğinin karşılaştırılmasına olanak sağlar. Genotipleri doku invazif hipal aşamasına fagosite konidianın geçişi (Şekil 3) inhibe etme yeteneği ile ilgili karşılaştırılabilir burada 14 saat bir zaman noktasıdır. Bozulmamış makrofaj sırasıyla membran ve...

Konfokal mikroskopi tarafından fagosite Aspergillus sporlarının büyümesini kontrol için izole edilmiş fare alveolar makrofaj yeteneğini değerlendirmek için bir yöntem.

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Bu prosedürün genel amacı, makrofajların ceto fungal candia büyümesini ex vivo olarak kontrol etme yeteneklerini karşılaştırmaktır. Bu, öncelikle alveoler makrofajların in vivo olarak lipofilik bir boya olan PKH 26 ile işaretlenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, inoküle edilen farelerden bronkoalveoler lavaj yoluyla alveoler makrofajların toplanmasıdır.Üçüncü adım, GFP pozitif fungal sporların kültüre edilmesi ve toplanmasıdır. Son adımlar, makrofajların önceden belirlenmiş zaman noktalarında GFP pozitif candida ve fikse edilmiş hücrelerle uyarılmasıdır. Nihayetinde, minimum ex vivo hücre manipülasyonu ile konfokal mikroskopi, alveolar makrofajların fagositoz yoluyla büyümeyi kontrol etme yeteneğini ortaya çıkarabilir.Sporlar Öncelikle lipofilik boya P HK 26, 1'i beşe kadar seyreltin. Dilüent C içerisinde boya, FOC asidik hücreleri tarafından alınacaktır. Seyreltilmiş P HK 26'nın 100 µL'sini bir buçuk cc'lik bir şırıngaya çekin ve boyayı retroorbital olarak intravenöz yolla veya kuyruk veninden enjekte edin.10 gün sonra her bir farenin üç ila 500.000 etiketli makrofaj sağlayacağını tahmin edin. Fareleri ötanize edin ve göğüs boşluğunu diyaframdan başlayarak açmaya h

assessing-anti-fungal-activity-isolated-alveolar-macrophages-confocal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu yazıda, akciğer doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ikamet ve polianhidrid nanopartiküller ile ko-kültür tepki olarak aktivasyon inceleyerek murin alveoler makrofaj, hasat için protokoller açıklanmaktadır.

Polianhidrid Nanopartiküller Bağlı Mürin Alveoler Makrofajlar Hasat ve Değerlendirme Hücresel Etkinleştirme

Kaynak: Barbero, A. M. , et.al. Mycobacterium tuberculosis ile bağışıklık reseptörü SLAMF1 ile etkileşiminin incelenmesi için floresans testleri. J. Vis. Exp. ( (2025)Bu video, makrofaj reseptörü ile Mycobacterium tuberculosis antijenleri arasındaki etkileşimi incelemek için floresans tabanlı bir test sunmaktadır. Örtü üzerinde floresan olarak işaretlenmiş antijenler, makrofaj protein özetleriyle kuluçkalanır, çapraz bağlanır, antikor etiketlenir ve üst üste düşen floresan sinyalleriyle...

Makrofaj Reseptörü Etkileşimlerinin Bakteriyel Antijenlerle Araştırılması için Flüoresans Tabanlı Analiz

Bu video, floresan Aspergillus reporter conidia kullanılarak insan nötrofillerinde antifungal aktivitenin analizi için canlı hücre görüntülemeyi göstermektedir. Başlangıçta, nötrofiller içinde hem kırmızı hem de macenta floresan tespit edilirken, kırmızı floresan zamanla azalır, bu da conidia'nın bozulmasını gösterir ve nötrofillerin antifungal aktivitesini doğrular.

Primer İnsan Bağışıklık Hücrelerinin Antifungal Aktivitesinin Gerçek Zamanlı Değerlendirmesi

Biz canlı hücre Video mikroskopi yöntemleri...

Fungal Patojen Fagositoz Canlı hücre video Mikroskopi

Burada, görüntü sitometrisi kültür ev sahibi hücrelerle ilişkili olarak patojenik mantarların ölçümü için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu teknik, CFU sayımı için bir alternatif olarak kullanılabilir.

Ana Hücreler ile Derneği Patojen Mantarlar miktarının Image for Sitometrinin kullanın

Burada, canlı hücre bir video mikroskobu ile birlikte floresan Aspergillus raportör konidyalarını kullanarak gerçek zamanlı olarak birincil insan bağışıklık hücrelerinin antifungal aktivitesini değerlendirmek ve akım sitometri bir protokol açıklar. Oluşturulan veriler, fungisit aktivite, fagositoz, hücre göçü ve mantar büyüme inhibisyonu olarak ana bilgisayarın hücreye Aspergillus etkileşimleri ilişkin bilgi sağlar.

Cevabı İnsan İlköğretim nötrofiller ve monositler tarafından Antifungal Faaliyet Canlı Görüntüleme<em&gt; A. fumigatus</em

Bu iletişim metodolojisi yalıtım ve kültür insanlardan alveoler makrofajlar ve deneysel amaçlar için fare modelleri açıklar.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Biz Bronkoalveoler Lavaj sıvısı işleme için bir yöntem tarif ve pulmoner HıV rezervuarları değerlendirmek için antiretroviral tedavi kronik HıV enfekte bireylerin periferik kan eşleşen. Bu yöntemler, son derece saf CD4 T hücrelerinin satın alınması ve daha sonra ultrason polimeraz zincir reaksiyonu ile immünofenotipleme ve HIV DNA/RNA ölçülerinde kullanılabilir alveoler makrofajlar sonuçlanır.

Alveoler Makrophaj ve CD4+ T-Cell Immünophenotyping ve HIV rezervuar değerlendirmesi Için Bronkoalveolar lavaj sıvısı ve eşleştirilen kanın işlenmesi

Bu protokol, aspergillus fumigatus conidia'nın fagositozunu akış sitometrisi kullanarak insan primer fagositler tarafından nicel olarak ölçmek ve konidianın fagositozunu sadece aparatlardan lökositlere ayırmak için hızlı ve güvenilir bir yöntem sunmaktadır.

Akış Sitometrisi Kullanılarak İnsan Lökositler tarafından Aspergillus fumigatus Conidia Fagositozunun ölçülmesi

Aspergillus fumigatus conidia'nın (3 μm boyutunda) farelerin hava yollarında dağılımının nicel analizi için yöntemi açıklıyoruz. Yöntem ayrıca çeşitli patolojik durum modellerinde hava yollarındaki mikropartiküllerin ve nanopartikül aglomera dağılımının analizi için de kullanılabilir.

Tüm Mount Optik Olarak Temizlenmiş Fare Akciğerinde Aspergillus fumigatus Conidia Dağılımının Konfokal Lazer Tarama Mikroskopi Tabanlı Nicel Analizi

Mantar konidiasının makrofajlar tarafından fagositozunu içeren teknik, mantarlara karşı immün yanıtların modülasyonunu değerlendiren çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makalenin amacı, Trichoderma stromaticum conidia ile uyarılan insan periferik kan mononükleer kaynaklı makrofajların fagositoz ve klirens yeteneklerini değerlendirmek için bir yöntem sunmaktır.

İnsan Periferik Kanı Mononükleer Kaynaklı Makrofajlar İçinde Trichoderma stromaticum Conidia'nın Canlılık Testi

Öğrenin, eşodaklı mikroskopi kullanarak izole fare alveoler makrofajlarının Aspergillus sporlarının büyümesini nasıl kontrol ettiğini. Bu yöntem, fungal enfeksiyonlara karşı bağışıklık yanıtlarını anlamak için değerlidir.

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet