Farelerde Modelleme İnme: Distal Orta Serebral Arter Daimi Pıhtılaşma
31 Temmuz 2014
Orta serebral arter oklüzyonu (MCAO) çeşitli kemirgen modelleri yaygın deneysel beyin araştırmalarda kullanılır. Burada, insan iskemik strok çoğunluğu tarafından uygulanan zarar tekabül eden bir boyutta tutarlı bir kortikal enfarktüs üreten transkraniyal sürekli uzak MCAO modelini göstermektedir.
Bu prosedürün genel amacı, bir farede distal orta serebral arterin kalıcı oklüzyonunu gerçekleştirerek, temel olarak kortekste yer alan ve boyut olarak insan inmeleriyle nispeten benzer büyüklükte bir enfarkt oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle cerrahi öncesinde ekstremite kullanım asimetrisi için bazal skorlama yapılarak gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, distal orta serebral arterin elektrokoagülasyonu yoluyla inme indüksiyon cerrahisinin uygulanmasıdır.
Ameliyattan sonra, dört ekstremite kullanım asimetrisi puanlanarak fokal duyusal motor defisitler test edilir. Son adım, kristal viyole boyama kullanılarak enfarkt hacminin analiz edilmesidir. Sonuç olarak, ortaya çıkan kortikal lezyonlar küçük varyasyonlara sahip orta büyüklüktedir; bu da söz konusu tekniği temel ve translasyonel inme araştırmaları için değerli bir model haline getirmektedir.
Bu tekniğin diğer yaygın inme modellerine göre temel avantajları, bu modeldeki mortalite oranının minimal olması, enfarkt hacmi ve lokalizasyonudur. Neokorteks, insan inmelerinin çoğunluğunu temsil eder ve yüksek düzeyde tekrarlanabilirdir. Genellikle bu yöntemi ilk kez kullanacak kişiler, mekanik lezyonları en aza indirmek için kafatasının dikkatlice çıkarılması aşamasında başlangıçta zorlanabilirler.
İkinci olarak, distal orta serebral arterin doğru şekilde tanımlanması ve uygun korelasyonu bu model için kritiktir. İlk olarak, operasyona başlamadan 30 dakika önce analjezikleri enjekte edin. Fare için ısıtıcı battaniyeyi açın ve operasyon için 37 °C'ye ayarlayın.
Ardından, %70 azot, %30 oksijen ve izofluran içeren anestezik gazın hazır olduğundan emin olun. Daha sonra fareyi, hareketleri durana kadar bir indüksiyon haznesinde %4 izoflurana maruz bırakın. Ardından fareyi ısıtıcı ped üzerine yerleştirin ve bir dakika daha %4 izofluran uygulayın.
Bir dakika sonra, izofluran hızını %1.5 olarak değiştirin. Şimdi, ayak parmağı sıkıştırma testi ile farenin yeterince anestezi altında olduğundan emin olun ve öyleyse, bir makas yardımıyla gözlere dafan etanol uygulayın. Kulak ile göz arasında bir santimetrelik bir insizyon yaparak cerrahi işleme başlayın. Deriyi ayırın ve temporal kası belirleyin.
Şimdi yüksek frekans jeneratöründe fonksiyonu koagülasyona, modu bipolara, gücü 12 watt'a ayarlayın ve forsepsleri takın. Hazırlık aşamasında, açıkta kalan temporal kasa bir damla salin ekleyin. Ardından, temporal kası kafatasından apikal ve distal kısımlarından ayırmak için elektrokoagülasyon forsepslerini kullanın.
Sonuçta gevşemiş bir kas flebi elde edilir. Şimdi şeffaf kafatasının altında medial serebral arteri veya MCA'yı tanımlayın. Bu arter, temporal bölgenin rostral kısmında, retroorbital sinüsün dorsalinde yer alır.
Bu arterin hemen üzerindeki kemiği, incelip delinecek seviyeye gelene kadar matkapla inceltin. Delme işlemi sırasında kafatasını salin kullanarak nemli tutun. Şimdi, çok ince pensler kullanarak kemiği dikkatlice kaldırın ve MCA dalını açığa çıkarın.
Yüksek frekans jeneratörünü yedi watt'a ayarlayın. Şimdi arteri, elektrokoagülasyon pensi ile kavramadan hafifçe dokunarak koagüle edin. Arteri, bifurkasyonun hem proksimal hem de distalinden koagüle edin; MCA bifurkasyonunun olmadığı anatomik varyasyonlarda ise arteri, mümkün olduğunca proksimalde, koagülasyon sonrası yaklaşık bir milimetre ara ile iki noktadan koagüle edin.
30 saniye bekleyin ve ardından artere küt uçlu pensle nazikçe dokunun. Sonrasında, kası trepanasyon deliğini örtecek şekilde eski konumuna getirin. Yarayı sütüre edin ve hayvanın anesteziden çıkması için 32 °C sıcaklıktaki bir iyileşme kutusuna yerleştirin, ardından kafesine geri koyun.
Genel olarak, hayvanın anesteziden ayılması beş ila 10 dakika sürer. Silindir testi, bir ekstremitenin diğerine tercih edilip edilmediğini kontrol eder. Hayvanı, dik açıyla yerleştirilmiş iki aynanın arasında bulunan şeffaf akrilik cam bir silindirin içine yerleştirin.
Silindirin diğer tarafındaki iki aynanın tepe noktasına karşıt konumda hayvanın beş dakika boyunca videosunu çekin. Her denemeden sonra, silindiri ve masa üstünü %60 etanol ile silin. Daha sonra, kare kare analiz gerçekleştirin.
Tam olarak arka ayaklar üzerinde yükselmişken bir ön patinin silindire temasını ve ayrıca bir ön uzuvla inişi sayarak deneyi skorlayın. Tam bir yükselme skorundan sonra, deneme başına kriyoseksiyon başına en az 20 ön uzuv teması olacak şekilde, her beyni 400 µm aralıklarla alınan 20 µm kalınlığında kesitlere seri olarak bölün. Kesitleri -20 °C'de saklamak üzere lamlar üzerine toplayın.
Bu kesit alma protokolü kullanılarak, tek bir beyinden enfarkt bölgesini kapsayan tüm kesitler tek bir lam üzerine yerleştirilebilir. Her bir beyin kesitindeki enfarkte olmuş doku alanını belirlemek için kesitleri standart bir kristal viyole protokolü ile boyayın. Lamlar daha sonra monte edilebilir, taranabilir ve ödem için Swanson yöntemi kullanılarak analiz edilebilir.
MCA tıkanıklığı cerrahisine bağlı düzeltilmiş mortalite oranı, temel olarak subaraknoid kanama veya hatalı anestezi nedeniyle %5'ten azdı. Bu süre zarfında ölüm gerçekleşmedi. PA kullanımı için yapılan bu analizde, inme indüksiyonundan sonra silindir testi kullanılarak asimetri ölçülmüş ve MCA tıkanıklığı öncesinde elde edilen bazal değerlerle karşılaştırılmıştır; 24. saatte belirgin bir ekstremite asimetrisi tespit edilmiş olup, bu durum inmeden sonraki ilk hafta içinde kısmen düzelmiştir.
Krestal viyole boyamasıyla yapılan enfarkt indüksiyonu ölçümünde, ortalama enfarkt hacmi 15,4 mm³ olarak belirlenmiş olup bu değer tek bir beyin hemisferinin yaklaşık %12'sine tekabül etmektedir. Bu modelin standart sapması oldukça düşüktür. Ayrıca, enfarkt konumunda minimal varyasyon gözlemlenmiştir.
Doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, bu işlem hazırlandıktan sonra 10 dakika içinde tamamlanabilir. Gösterilen silindir testleri ve kristal viyole boyamasına ek olarak, sonucu daha ayrıntılı karakterize etmek ve spesifik araştırma sorularını yanıtlamak için diğer yerleşik davranış testleri ve histolojik yöntemler kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, farelerde kalıcı distal MCA oklüzyonunun nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.
Yöntemin tekrarlanabilirliğini sağlamak için standart uygulama prosedürlerinin ve ayrıntılı dokümantasyonun kullanılmasını şiddetle tavsiye ederiz.
Genel Bakış
Bu makale, farelerde insan iskemik inmelerine benzer şekilde tutarlı kortikal enfarktüsle sonuçlanan kalıcı distal orta serebral arter oklüzyonu (MCAO) gerçekleştirme yöntemini sunmaktadır. Bu teknik, tekrarlanabilirliği ve düşük mortalite oranı nedeniyle hem temel hem de translasyonel inme araştırmaları için değerlidir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- İnme Araştırmaları
- Hayvan Modelleri
Arka Plan
- Orta serebral arter oklüzyonu (MCAO), iskemik inme çalışmalarında yaygın olarak kullanılan bir modeldir.
- Bu model, kontrollü bir ortamda kortikal infarktüsün incelenmesine olanak tanır.
- Farelerdeki inme mekanizmalarının anlaşılması, insan durumlarına uygulanabilecek içgörüler sağlayabilir.
- Tekrarlanabilirlik ve düşük mortalite oranları, modelin araştırmalardaki kullanışlılığını artırır.
Çalışmanın Amacı
- Farelerde kalıcı MCAO indüklemek için güvenilir bir yöntemi göstermek.
- Ortaya çıkan kortikal enfarkt boyutunu ve bunun insan inmeleriyle olan ilişkisini değerlendirmek.
- Ekstremite kullanım asimetrisi testlerini kullanarak cerrahi sonrası davranışsal sonuçları değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Cerrahi öncesi bazal ekstremite kullanım asimetrisi skorlaması.
- İnme indüklemek için distal orta serebral arterin elektrokagülasyonu.
- Silindir testi kullanılarak postoperatif sensorimotor defisitlerin değerlendirilmesi.
- Beyin kesitlerinin kristal viyole boyaması aracılığıyla enfarkt hacmi analizi.
Ana Sonuçlar
- Ölçülen ortalama enfarkt hacmi, bir beyin hemisferinin yaklaşık %12'sini temsil eden 15.4 cubic millimeters olarak belirlendi.
- Cerrahi sonrası 24. saatte belirgin ekstremite asimetrisi tespit edildi ve takip eden haftada kısmi iyileşme gözlemlendi.
- Model, enfarkt lokasyonu ve boyutunda düşük varyabilite sergiledi.
- Prosedüre bağlı mortalite %5'in altında gerçekleşti ve bu ölümler temel olarak subaraknoid kanama veya anestezi hatalarından kaynaklandı.
Sonuçlar
- Tanımlanan MCAO yöntemi, farelerde iskemik inmeyi çalışmak için etkilidir.
- Bu yöntem, minimum mortalite ve tutarlı sonuçlar sunan, tekrarlanabilir bir model sağlar.
- Davranışsal testler ve histolojik analizler, inmenin etkilerini daha ayrıntılı şekilde karakterize edebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Bu model, farelerde düşük mortalite oranıyla tekrarlanabilir kortikal enfarktüs oluşumuna olanak tanıyarak, inme hedef doğrulamasında mekanistik risk azaltma süreçlerini desteklemektedir. Enfarkt boyutu ve konumu, insan inme patolojisi ile uyumlu olup preklinik terapötik değerlendirmeler için translasyonel uygunluğu artırmaktadır. Davranışsal ve histolojik veriler, erken keşif süreçlerindeki devam/dur kararları için kantitatif son noktalar sağlamaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: İnsan hastalığıyla yüksek anatomik ilişkisi olan kortikal inme yollarındaki terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: İnfarkt hacmi ve konumundaki düşük değişkenlik, hedef etkileşimi ve yol modülasyonu değerlendirmelerine olan güveni artırır.
- Öngörücü Değer: İnflamasyon, anjiyogenez ve nöronal plastisite gibi gecikmiş patofizyolojik mekanizmaları modelleyerek preklinik ön elemeyi destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Tutarlı bileşik taraması ve doz-yanıt değerlendirmesi için uygun, standartlaştırılmış kortikal lezyonlar oluşturur.
- Kantitatif Çıktılar: Kresil viyole boyama yoluyla yapılan enfarkt hacmi ölçümü, tedavi etkilerinin objektif, histomorfometrik analizine olanak tanır.
- Ölçeklenebilirlik: Cerrahi prosedür, minimal mortalite ile 10 dakikanın altında tamamlanır ve keşif iş akışlarında daha yüksek verimliliği destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgililik: Kortikal enfarkt baskınlığı, insan iskemik inmelerinin çoğunluğunu yansıtarak klinik uygulamaya yönelik öngörü güvenilirliğini artırır.
- Mekanistik Süreklilik: Uzatılmış gözlem pencereleri boyunca rejenerasyon ve plastisite dahil olmak üzere subakut ve kronik inme yollarının çalışılmasını kolaylaştırır.
- Risk Ayarlı İlerleme: Düşük mortalite ve yüksek tekrarlanabilirlik biyolojik değişkenliği azaltarak daha güvenilir preklinik etkinlik ve güvenlik değerlendirmelerine olanak tanır.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Model; hedef doğrulamadan öncü bileşik belirlemeye ve preklinik etkinlik testlerine kadar uzanan inme keşif sürekliliğine, özellikle de kortikal hasar ve onarım mekanizmalarını hedefleyen terapiler için uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Klinik olarak ilgili bir enfarkt modelinde, nöroprotektif ve nörorestoratif bileşiklerin hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Bileşiklerin lezyon ilerlemesi üzerindeki etkilerinin tutarlı bir şekilde değerlendirilmesi için standartlaştırılmış enfarkt oluşumuna olanak tanır.
- Analitik: Kresil viyole boyama ve silindir testi, doz-yanıt ve zaman seyri analizleri için birbirini tamamlayan histolojik ve fonksiyonel sonuçlar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Subakut ve kronik inme müdahale pencereleriyle ilgili gecikmiş patofizyolojik süreçleri modeller.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Standartlaştırılmış cerrahi ve analitik prosedürler, projeler arası tekrarlanabilirliğe ve nörobilim ekipleri arasında platform paylaşımına imkan verir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: İnsan inmesine yönelik yüksek anatomik ve patofizyolojik sadakat, hedef doğrulama güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Minimum mortalite ve düşük enfarkt değişkenliği, analiz tekrarlanabilirliğini artırır ve deney başına hayvan kullanımını azaltır.
- Stratejik Değer: Biyolojik olarak aktif bileşiklerin daha erken tanımlanmasını sağlayarak, inme programlarında geç aşama başarısızlık riskini azaltır.
- Portföy Etkisi: Enfarkt boyutunun ve fonksiyonel iyileşmenin tutarlı modülasyonuna dayalı, veri odaklı hedef önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Mikrocerrahi teknikler ve intrakraniyal damar tanımlama konusunda uzmanlık gerektirir.
- Arteriyel oklüzyon için elektrokoagülasyon ekipmanına ve hassas güç ayarlarına bağımlıdır.
- Değişkenliği en aza indirmek için standartlaştırılmış anestezi ve postoperatif bakım protokollerini gerektirir.
- Transgenik modellere adaptasyon, cerrahi uygulanabilirliğin ve enfarkt tutarlılığının doğrulanmasını gerektirir.
- Histolojik analiz, güvenilir enfarkt kantifikasyonu için standartlaştırılmış kesit alma ve boyama protokolleri gerektirir.
