Name: Formation Odak: bir hücreye dayalı tahlil, bir genin onkojenik potansiyeli belirlemek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Öğrenin fare fibroblast hücrelerinde retrovirüs kullanarak odak oluşumu testi ile bir genin onkojenik potansiyelini değerlendirme yöntemini. Bu teknik kanser biyolojisinde gen dönüşüm kapasitesini belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH Yönetmenin Yeni Yenilikçi Ödülü Programı (ED) bir hibe ile desteklenmiştir. AA Ulusal Kanser Enstitüsü ve Ulusal Bilim Vakfı lisans ödülleri kısmen desteklenmiştir.

1. Viral vektörlerin yapımına İlgi konusu genin, hem de pozitif ve negatif kontroller için kodlama dizileri, geleneksel klonlama (PCR amplifikasyonu, sınırlama sindirimi ve ligasyon) ile pBABEpuro sokulur. BamHI, SnaBI, EcoRI ve SalI: DNA ilave edilebilir vektör üzerindeki dört kısıtlama bölgeleri vardır. <ol><li> QIAGEN plazmit Midi Kit kullanılarak yetkili hücrelerin transfeksiyonu dereceli plazma DNA hazırlanır. </li><li> Bir NanoDrop2000 spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonu ölçümü. </li></ol> 2. Retrovirus Üretimi Plat-E, paketleme hücre soyu NIH 3T3 hücreleri ilgilendiren cDNA teslim edecek ekotropik retrovirüs üretmek için kullanılır. <ol><li> Dondurulmuş Hücreleri Plat-e Kültürler kurulması <ol><li> Hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu içinde Plat-E hücreler eritin ve 15 ml konik tüp aktarın. Yavaş yavaş (Du Plat-E orta 9 ml ekleyinlbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)% 10 fetal sığır serumu (FBS) + penisilin ve streptomisin). </li><li> 180 x tüp santrifüj g 5 dakika ve süpernatan atılır. </li><li> 10 cm kültür çanak Plat-E orta ve transfer 10 ml hücreleri yeniden askıya. </li><li> Bunlar% 80-90 ortak akışlı (yaklaşık 2 gün) kadar 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde inkübe hücreleri. </li></ol></li><li> Hücre Bölme <ol><li> Orta aspire ve bir kez PBS ile yıkayın hücreleri. </li><li> % 0.05 tripsin-EDTA 2 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> , Dokunarak parmak hücreleri ayırmak Plat-E orta 10 ml ekleyin ve 15 ml tüp hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> 180 x tüp santrifüj g 5 dakika ve süpernatan atılır. </li><li> Plat-D ortamı 10 ml hücrelerin yeniden süspanse edin ve 1 yeni yemekler bunları tohum: 4-1: 6 dilüsyonları. </li></ol></li><li> Plat-E Tohumlama ve Transfeksiyon <ol><li> Tohum, 2 x 10 6Herhangi bir antibiyotik olmadan Plat-E ortamı kullanılarak 10 cm kültür çanak başına hücreleri. </li><li> 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe hücreleri O / N inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, her 1.5 ml mikrofüj tüpüne Opti-MEM içinde 300 ul aktarın. </li><li> Opti-MEM ile hazırlanan bir tüpe, polietilenimin 27 ul (PEI), düşük maliyetli bir transfeksiyon ayıracı 12 ekleyin. Dokunarak parmakla hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. </li><li> Opti-MEM / PEI tüp içine transfeksiyon dereceli plazmid DNA 9 ug ekle vorteks ile yavaşça karıştırın ve 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Ekle DNA / PEI Plat-E kabına ve 37 ° C&#39;de O / N inkübe karmaşık bilge damla,% 5 CO 2. </li><li> Bir sonraki gün, transfeksiyon reaktifi ihtiva eden bir ortam aspire ve (antibiyotikler olmadan) taze Plat-D ortamı 10 ml ekleyin. </li><li> Inkübatör hücreleri dönün. </li></ol></li></ol> 3. NIH 3T3 hücreleri ve Enfeksiyon <ol><li> NIH kurulması3T3 Kültürleri ve Tohumculuk <ol><li> Hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu içinde, NIH 3T3 hücrelerini eritin ve 15 ml&#39;lik bir tüpe transfer. Yavaş yavaş NIH 3T3 ortamında (DMEM +% 10 FBS) 9 ml ekleyin. </li><li> 180 x tüp santrifüj g 5 dakika ve süpernatan atılır. </li><li> 10 cm&#39;lik bir kültür tabağına, NIH 3T3, orta ve devir, 10 ml ile tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde inkübe hücreleri. Bu kendiliğinden dönüşüm (ve odak oluşumu bu nedenle, bazal seviye) sıklığı gibi bir kültür konfluent ulaştıktan sonra artar, NIH 3T3 hücreleri, her zaman underconfluent (% 50-60) tutulması çok önemlidir. </li><li> 10 cm çanak başına tohum 3 x 10 5 hücreleri ve ertesi gün enfeksiyonu için O / N kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol></li><li> Enfeksiyon <ol><li> 0.45 um gözenek boyutlu naylon zar filtre boyunca, 10 ml&#39;lik atılabilir bir şırınga kullanılarak, ve 15 ml aktararak Plat-E, çanak retroviral süpernatan hasattüp. </li><li> (Antibiyotikler olmadan) hücrelere taze Plat-E orta 10 ml ekleyin ve inkübatör onları geri. </li><li> Enfekte NIH 3T3 hücre çanak orta aspire ve virüs ihtiva eden, süzüldü süpernatanın 5 normal NIH 3T3 ortamının ml ve 5 mi ekleyin. </li><li> 6 ug / ml&#39;lik bir konsantrasyonda çanak polybrene ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 hücreleri O / N inkübe edin. </li><li> Enfeksiyon ikinci tur için 3.2.5 - Ertesi gün, tekrar 3.2.1 adımları. </li><li> Normal NIH 3T3 ortamı ile virüs içeren ortam değiştirin. </li><li> Gerektiğinde ortamının değiştirilmesiyle, NIH 3T3 hücreleri, 2-3 hafta boyunca büyümeye izin verin. Çoğaltma plakalarından bütün hücre lizatları üzerindeki geleneksel protein elektroforezi ve immüno-lekeleme ile, ilgilenilen proteinin ekspresyonunu kontrol edin. </li></ol></li></ol> 4. Boyama ve miktarının belirlenmesi <ol><li> Kristal Violet Boyama <ol><li> NIH 3T3 orta aspire ve yemekler yerBuz üzerinde. </li><li> Buz soğukluğunda PBS ile iki kez yemekler yıkayın. </li><li> 10 dakika boyunca buz soğukluğunda metanol ile hücreleri saptamak. </li><li> Buz yemekler çıkarın metanol havalandırın, ve 25% metanol (RT) &#39;de yapılan% 0.5 kristal mor çözelti 3 ml ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca yemekler inkübe edin. </li><li> Kristal viyole çözüm aspire ve hiçbir renk durulama kapalı gelene kadar dikkatli Milli-Q H 2 O ile çanak durulayın. </li><li> Yemekleri masa üstü Ç / N kurumasını bekleyin (ortaya). </li></ol></li><li> Foci Kantifikasyon <ol><li> Yemekler, kuru, plaka üzerinde hücrelerin koyu renkli koleksiyonlarını ölçmek için bir cetvel kullanın. Sadece olarak çapı 5 mm&#39;nin olanlar saymak &quot;odaklar.&quot; Odaklarının sayısını kaydedin ve ortalamalar ve kontrollere göre önemini hesaplamak. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+assays+for+Ras+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Biological assays for Ras transformation.</a> Methods in enzymology. , 255-395 (1995).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+biology+%3A+a+laboratory+handbook%22">Cell biology : a laboratory handbook</a>. , 3rd edn, Elsevier Academic. 345-352 (2006).</li>
<li>Raptis, L., Vultur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+transformation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Neoplastic transformation assays.</a> Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).</li>
<li>Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressed+pp60c-src+can+induce+focus+formation+without+complete+transformation+of+NIH+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells.</a> Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).</li>
<li>Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+biological+activity+of+human+homologs+of+the+raf%2Fmil+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22IMolecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene.</a> IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).</li>
<li>Yancopoulos, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-myc+can+cooperate+with+ras+to+transform+normal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).</li>
<li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+activity+of+purinergic+receptor+P2Y%2C+G+protein+coupled%2C+8+revealed+by+retroviral+expression+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+lymphoma%22%5BJournal%5D)">Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening.</a> Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).</li>
<li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plat-E%3A+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene. 7, 1063-1066 (2000).</li>
<li>Morgenstern, J. P., Land, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+mammalian+gene+transfer%3A+high+titre+retroviral+vectors+with+multiple+drug+selection+markers+and+a+complementary+helper-free+packaging+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line.</a> Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).</li>
<li>Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+5%27+and+3%27+long+terminal+repeat+promoter+function+in+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Comparison of 5' and 3' long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus.</a> Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).</li>
<li>Fukumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+gene+transfection+by+DNA+compaction+at+pH+4.0+using+acidified%2C+long+shelf-life+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine.</a> Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).</li>
<li>Fox, E. J., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-phase-specific+expression+of+the+Mad3+gene+in+proliferating+and+differentiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells.</a> The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).</li>
<li>Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+the+Mad+family+member+Mad3+in+cerebellar+granule+neuron+precursor+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation.</a> Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).</li>
<li>Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad3+negatively+regulates+B+cell+differentiation+in+the+spleen+by+inducing+Id2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression.</a> Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).</li>
<li>Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cerebellar+proliferation+to+tumorigenesis%3A+new+insights+into+the+role+of+Mad3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3.</a> Cell cycle. 7, 423-427 (2008).</li>
<li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508(2012).</li>
<li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112, 193-205 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

FFA in vitro malign transformasyon değerlendirmek için hızlı ve kolay bir yöntem sağlar. Aday genler nispeten büyük sayıda taranması için uygundur ve mütevazı teknik gereksinimler, maliyet açısından tercih. Bundan başka, iki ya da daha çok gen birlikte eksprese edilebilir kombinasyonunun tümörijenik potansiyelini değerlendirmek için (bazen &quot;işbirliği&quot; deneyi olarak da adlandırılır). Bu testin avantajları basit tekniği, miktar kolaylığı ve nispeten kısa dönüş etrafında zaman güveniyor. O, tüm in vi...

Tümör hücrelerinin gen ifadesi örnekleri morfolojik ve proliferatif değişikliklere epigenomics için, değişiklik geniş bir yelpazesi ile, bunların normal emsallerine ayırt edilebilir. Sonuncular içinde, sonuç olarak, hayvanlara enjekte edildiğinde tümör oluşturma yeteneği habis dönüşüm 3 yararlı ölçülebilir göstergeleri, serum bağımlılığı, kontak (yoğunluğu) inhibisyonu kaybı, ankoraj-bağımsız çoğalma satın azalır ve. In vitro ve in vivo tahliller çeşitli hücresel transformasyon için geliştirilmiştir. In vitro deneyler, amaç (düşük serumda büyümesi) belirlenmesi ve kültür morfolojisi (odak oluşumu testi), kültür dinamiği (büyüme oranı, doygunluk yoğunluk) ve büyüme faktörü değişiklikleri ölçülmesi veya gereksinimleri ankraj (yumuşak agar büyüme). Bir hücre tipi malign tabiatını tespit etmek için altın standart deney hayvanlarında tümör formasyonu (ksenogrefleri) kalır. Bununla birlikte, TO mal ve in vivo çalışmalar uzunluğu her zaman aday onkojenlerin ilk doğrulama adımı veya tarama gibi onları haklı yapmazlar. Hiçbir in vitro deney, bir genin onkojenik potansiyeli kesin bir değerlendirmesini sağlar rağmen, onlar in vivo çalışmalar geleceği daraltmak olabilir onkojenik potansiyeli içgörü sağlarlar. In vitro onkojenik potansiyeli değerlendirmek için en yaygın kullanılan sistemlerden biri Odak Oluşumu Testi 2. Bu yaklaşım, NIH 3T3 fare fibroblast, mutlaka temas inhibisyonu gösteren bir dönüştürülmemiş hücre çizgisinin kullanımına dayanır. Yoğunluk bağımlı büyüme kaybına bir onkogen sonuçların aşırı ekspresyonu; Dönüştürülen hücreler daha sonra kolayca dönüştürülmemiş hücrelerin arka plan tek tabaka ile görselleştirildi &quot;odak&quot; oluşturan, çok sayıda tabaka halinde büyüyebilir. İletişim inhib kaybı ile kanıtlandığı gibi odak oluşumu Deneyi, daha sonra, habis dönüşümünün uyarılması için aday onkogen kabiliyetini ölçmektedirölçülebilir fenotip olarak yerleştirme. FFA (örneğin, Src 4 BRAF 5), protein kinazların aşırı ekspresyonu, transkripsiyon faktörleri (örneğin, N-myc 6) (örneğin, P2RY8 7), G-protein bağlı reseptörler ve GTPazlar (örneğin, dönüşümün değerlendirmek için kullanılmıştır Ras 1), ve diğerleri. Bu deneyde göreli kolaylığı genin ekspresyonu in vitro NIH 3T3 fare fibroblast hücrelerini dönüştürmek için yeterli olup olmadığı hızlı ve görsel net bir cevap verecek iyi bir seçim yapar. Bu protokol açıklanan FFA viral ambalaj proteinleri sağlar Plat-E ambalaj hücre hattı 8, kullanır ve retroviral vektörü pBABEpuro 9 (Addgene plazmid 1764) retrovirüs üretmek. İlgi konusu geni içeren pBABEpuro yapısı ile transfeksiyondan sonra Plat-D hücre çizgisi NIH 3T3 hücreleri enfekte etmek için kullanılabilir ekotropik retrovirüs üretecektir. TGen teslim onun viral yöntem, geleneksel kimyasal transfeksiyon yöntemlere göre daha etkili olduğunu ve sürdürülebilir geni 10 ifade etmek için bir yol sunar. Bir kez NIH 3T3 hücrelerinin genomu içine dahil edilmiş, ilgi konusu genin aşın virüs uzun terminal tekrarları (LTR) promoteri 11 tarafından tahrik edilir. Bu sabit ifade eden NIH 3T3 hücreleri üzerinde odaklarının oluşumu ile ölçüldüğü haliyle ilgi konusu genin onkojenik etkinliğe sahip olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>pBABE-puro vektör</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 1764</td><td>klonlama vektörü</td></tr><tr><td>Platinum-E Retroviral Paketleme Hücre Hattı, Ecotropic</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>Viral üretim için</td> <td>RV-101</td> hücre hattı</tr><tr><td>NIH 3T3 Hücre Hattı murin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>odak</td><td>oluşum deneyi için 93061524 hücre hattı</td></tr><tr><td>10 ml BD Luer-Lok uçlu şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>viral üretim reaktifi</td></tr><tr><td>0.45 &; m Puradisc Şırınga Filtresi</td><td>Whatman</td><td>6750-2504</td><td>viral üretim reaktifi</td></tr><tr><td>Polietilenimin (PEI)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966-2</td><td>hücre transfeksiyon reaktifi Polybrene</td></tr><tr><td>Enfeksiyonu / Transfeksiyon Reaktifi</td><td>EMD Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>hücre transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Fisher Scientific</td><td>C581-25</td><td>hücre lekesi reaktifi</td></tr><tr><td>Plasmid Plus Midi Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>12945</td><td>plazmit saflaştırma</td></tr><tr><td>BD Falcon Doku Kültürü Yemekleri</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>Hücre Kültürü Malzemeleri</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>%0,05 Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>hücre kültürü malzemeleri</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>hücre kültürü ortamı</td></tr></tbody></table>

formation odak: bir hücreye dayalı tahlil, bir genin onkojenik potansiyeli belirlemek için

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Hücrelerin kötü huylu transformasyonu tipik olarak artmış proliferasyon, temas inhibisyonu kaybı, ankrajdan bağımsız büyüme potansiyelinin kazanılması ve deney hayvanlarında tümör oluşturma yeteneği ile ilişkilidir1. NIH 3T3 hücrelerinde, Ras sinyal iletim yolunun, Ras dönüşümü olarak bilinen bu olayların çoğunu tetiklediği bilinmektedir. NIH 3T3 hücrelerinde aşırı eksprese edilen bir genin eklenmesi, morfolojik dönüşümü ve temas inhibisyonu kaybını teşvik edebilir, bu da ilgilenilen genin onkojenik potansiyelini belirlemeye yardımcı olabilir. Bir onkogenin transformasyon potansiyelinin bir yönünü değerlendirmek için basit bir yöntem sağlayan bir test, Odak Oluşum Testidir (FFA)2. NIH 3T3 hücreleri kültürde normal olarak bölündüğünde, bunu birleşik bir tek tabakaya ulaşana kadar yaparlar. Bununla birlikte, aşırı eksprese edilmiş bir onkogen varlığında, bu hücreler, kristal viyole veya Hema 3 boyama ile görselleştirilebilen ve ölçülebilen yoğun, çok katmanlı odaklar1'de büyümeye başlayabilir. Bu makalede, ilgilenilen genin NIH 3T3 hücrelerine retroviral transdüksiyonu ile FFA protokolünü ve boyama yoluyla odak sayısının nasıl ölçüleceğini açıklıyoruz. Retroviral transdüksiyon, transfeksiyondan daha verimli bir gen iletimi yöntemi sunar ve ekotropik bir murin retrovirüsünün kullanılması, potansiyel insan onkogenleri ile çalışırken bir biyogüvenlik kontrolü sağlar.

MXD3 MYC / MAX / MAD ağının bir üyesi olan temel bir sarmal döngü-heliks lösin fermuar (bHLHZ) transkripsiyon faktörüdür. Bu MAD ailesinin 13-15 bir atipik üyesi olduğunu ve karsinogenezinde 16,17 rol bildirilmiştir. PBABEpuro (negatif kontrol) ve myc (pozitif kontrol) ile karşılaştırıldığında, MXD3 aşın NIH 3T3 yemekler önemli ölçüde daha az odakları (Şekil 1A) vardı. Şekil 1 B &#39;de veri önemini belirlemek için birden çok deneyden elde edilmiştir. <p class=...

Odak Oluşumu Testi aday onkogen dönüşürken potansiyelini değerlendirmek için basit bir yöntem sağlar.

Formation Odak: bir hücreye dayalı tahlil, bir genin onkojenik potansiyeli belirlemek için

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Bu prosedürün genel amacı, bir genin onkojenik potansiyelini belirlemek için bir retrovirüs kullanarak fare fibroblast hücre hatlarında odak oluşum testi (focus formation assay) gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen genin dizisinin bir retroviral vektöre klonlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, viral vektör ve PLA e paketleme hücreleri kullanılarak retroviral partiküller üretmektir.Ardından, ilgilenilen genin dönüştürme potansiyelini değerlendirmek amacıyla retrovirüs, NIH 3T3 fare fibroblast hücrelerini enfekte etmek için kullanılır. Son adımda, NIH 3T3 hücrelerinin iki ila üç hafta boyunca bölünmesine izin verilir ve ardından oluşan odak sayısını belirlemek için kristal viyole boyaması yapılır. Nihayetinde, odak oluşum analizi, ilgilenilen bir genin aşırı ekspresyonunun fare fibroblast hücrelerinde yoğunluktan bağımsız büyümeyi tetiklemek için yeterli olup olmadığını göstermek amacıyla kullanılır.Bu yöntem, bir genin onkojenik potansiyelinin taranması gibi kanser biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başlangıç olarak, metin protokolünde açıklandığı şekilde viral vektörü hazırlayın. Ardından, dondurulmuş plat E hücrelerini 37 °C su banyosunda hızlıca çözerek ve daha sonra 15 mL'lik konik tüpe aktararak plat E kültürlerini oluşturun.15 mililitrelik konik tüpe yavaşça dokuz mililitre PLA E besiyeri ekleyin. Tüpü 5 dakika boyunca 180 ×g hızında santrifüj edin ve süpernatantı uzaklaştırın. Hücreleri 10 mililitre plat E besiyeri ile yeniden süspanse edin ve 10 santimetrelik bir kültür kabına aktarın.Ardından hücreleri, %80 ile %90 konfluens düzeyine ulaşana kadar 37 °C'de %5 CO2 içeren bir inkübatörde inkübe edin. Besiyerini aspire ederek hücre bölme işlemini gerçekleştirin; ardından hücreleri bir kez PBS ile yıkayıp iki mililitre %0,05 tripsin EDTA ekleyin ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca inkübe edin; hücreleri parmakla hafifçe vurarak ayırın. Sonrasında 10 mililitre plat E besiyeri ekleyin ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.Tüpü daha önce olduğu gibi santrifüjleyin ve hücreleri 10 milliliters plat E medyum ile yeniden süspande edin. Ardından, antibiyotiksiz plat E medyumu kullanarak her 10 centimeter kültür kabına 2 milyon hücre ekleyin ve hücreleri gece boyunca inkübe olmaya bırakın. Ertesi gün, 300 microliters optimumu 1,5 milliliter mikro tüpe aktarın.Hazırlanan Optum içeren tüpe 27 µL polietilen amin ekleyin. Parmakla hafifçe vurarak karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından, tüpe dokuz µg transfeksiyon kalitesinde plazmid DNA ekleyin, vorteksleyerek nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.Ardından, gece boyu inkübasyondan önce karışımı damla damla plat E kabına ekleyin. Ertesi gün, transfeksiyon reaktifi içeren medyumu aspire edin ve hücreleri NIH three T three kültürlerini oluşturmak için inkübatöre geri yerleştirmeden önce 10 mililitre taze plat E medyumu ekleyin. İlk olarak, hücreleri 37 °C su banyosunda hızla çözdürün ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.Hücrelere yavaşça 9 mL NIH 3T3 medyumu ekleyin, tüpü 180 ×g'de beş dakika santrifüjleyin ve süpernatantı atın. Ardından hücreleri 10 mL NIH 3T3 medyumu ile yeniden süspande edin ve 10 cm'lik bir kültür kabına aktarın. Spontan transformasyon sıklığı arttığından, hücreleri konfluans seviyesinin altında tutarak 37 °C, %5 CO2'li bir inkübatörde inkübe edin.Bir kültür konfluens seviyesine ulaştığında, 10 cm'lik bir kap başına 3 × 10⁵ hücre olacak şekilde ekim yapın ve ertesi günkü enfeksiyon işlemi için gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, retroviral süpernatantı 10 mL'lik tek kullanımlık bir şırınga kullanarak plat E kabından toplayın, 0,45 µm gözenek boyutuna sahip naylon membran filtreden süzün ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücreleri inkübatöre geri yerleştirmeden önce, hücrelere 10 mL taze plat E besiyeri ekleyin.Ardından, enfekte edilecek NIH 3T3 hücre kabındaki medyumu aspire edin ve beş mililitre standart NIH 3T3 medyumu ile beş mililitre virüs içeren filtreli süpernatan ekleyin. Daha sonra, kaba polybrain ekleyin. Altı µg/mL konsantrasyonda ekleme yapın.İkinci bir enfeksiyon döngüsü için enfeksiyon adımlarını tekrarlamadan önce hücreleri gece boyunca inkübe edin. Enfeksiyonun ardından, virüs içeren medyumu standart IH three T three medyumu ile değiştirin. Kristal viyole boyaması için, gerektiğinde medyumu yenileyerek IH three T three hücrelerinin iki ila üç gün boyunca büyümesine izin verin.NIH 3T3 besiyerini aspire edin ve kapları buza yerleştirin. Kapları buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri buz gibi soğuk metanol ile 10 dakika boyunca sabitleyin.Ardından kapları buzdan çıkarın ve metanolü aspire edin. %25 metanol ile hazırlanmış 0,5% kristal viyole çözeltisinden üç mililitre ekleyin ve kapları oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, kristal viyole çözeltisini aspire edin ve durulama suyunda artık renk gelmeyene kadar kabı Milli Q suyu ile dikkatlice durulayın.Kapların gece boyunca tezgah üzerinde açık şekilde kurumasına izin verin. Kaplar kuruduktan sonra, odakların boyutunu ölçmek için bir cetvel kullanın ve çapı beş milimetreden büyük olanları sayıp kaydedin. MXD3, MAD ailesinin atipik bir üyesi olan temel bir helix-loop-helix lüsin fermuar transkripsiyon faktörüdür ve negatif kontrol ile pozitif kontrolle karşılaştırıldığında karsinogenezde rol oynadığı bildirilmiştir.MXD3'ün aşırı eksprese edildiği NIH 3T3 kaplarında anlamlı derecede daha az odak görüldü. Anlamlılığı belirlemek için veriler birden fazla deneyden toplandı ve bu analizde de aynı eğilimler gözlemlendi. Sonuçlar, bu prosedürün ardından MXD3'ün bir onkogen olarak işlev görmediğini göstermektedir.İlgilenilen bir genin onkogenez patogenezindeki rolünü değerlendirmek amacıyla, gen kombinasyonları ile odak oluşum analizi, yumuşak agar proliferasyonunda büyüme ve hücre döngüsü analizi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

focus-formation-cell-based-assay-to-determine-oncogenic-potential

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, bir PADI enzim inhibitörü ve BB-Cl-amidin'in in vitro meme kanseri tümörjenitesi üzerindeki etkilerini test etmek için bir yumuşak agar koloni oluşumu testi açıklanmaktadır. Bu test aynı zamanda genetik bozulmalar bağlamında hücre dönüşüm potansiyelinin kantitatif değerlendirmesini de sağlar.

Yumuşak Agar Koloni Oluşumu Deneyi: Yeni Bileşiklerin Kanser Hücresi Proliferasyonu Üzerindeki Etkilerini Test Etmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, akciğer kanseri hücrelerinin süresiz olarak çoğalma ve bireysel koloniler oluşturma yeteneğini belirlemeye yardımcı olan koloni oluşumu testi açıklanmaktadır. Bir antikanser ajanının koloni oluşturan hücreler üzerindeki etkisini, ortaya çıkan kolonilerin sayısındaki ve/veya boyutundaki değişiklikleri analiz ederek analiz edebiliriz.

Koloni Oluşumu Deneyi: Antikanser Ajanların Koloni Oluşturan Akciğer Kanseri Hücreleri Üzerindeki Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Bu video, antikanser bileşiklerle tedaviye yanıt olarak lösemik hücreler tarafından oluşturulan kolonilerin sayısını tanımlamaya ve saymaya yardımcı olan metil selüloz bazlı koloni oluşum birimi veya CFU testi protokolünü açıklar.

Metil Selüloz Bazlı CFU Testi: Lösemik Hücrelerde Anti-kanser Bileşiklerinin Koloni Oluşumu Üzerindeki Etkisini Belirlemeye Yönelik Bir Yöntem

Hücresel süreçlerin bir sistem düzeyinde anlayış elde günümüz hücre biyolojisi bir hedeftir. Burada çeşitli hücresel fonksiyonunun çoklama lusiferaz gazetecilere yönelik stratejiler tarif son noktaları genom ölçekli RNAi kütüphaneleri kullanılarak gen işlevini sorgulamak için.

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Yumuşak agar koloni oluşum testi, in vitro hücresel ankrajdan bağımsız büyümeyi doğrulamak için kullanılan bir yöntemdir. Bu protokolün amacı, transforme olmuş hücrelerin tümörjenik potansiyelinin ve proteinlerin transforme olmuş hücreler üzerindeki tümör baskılayıcı etkilerinin tespiti için sıkı bir yöntem göstermektir.

Yumuşak Agar koloni formasyon deneyi

Klinik öncesi testlerden insan denemelerine geçiş yapan yeni ilaç hedeflerinin belirlenmesi bilimsel bir önceliktir. Bu amaçla, burada, gen tükenmesinin kanser hücre hattı sferoidleri üzerindeki etkisini incelemek için işlevsel bir genomik yaklaşımı tanımlıyoruz, bu da insan kanserlerini in vivo olarak daha uygun bir şekilde modelliyor.

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

Değişikliklere tepki olarak heterosellüler popülasyon dinamiklerini incelemek için yeni bir protokol geliştirdik. Bu el yazması heterosellüler popülasyonların çoklu hücresel fenotiplerinin aynı anda karakterize edilmesi için nicel veri kümeleri üreten görüntü tabanlı bir platformu açıklamaktadır.

Kantitatif Görüntüleme Teknikleri Kullanılarak Heterosellüler Popülasyonların Ayrımcılaştırılması ve Karakterizasyonu

Burada, c-Fos ve Dusp1 genetik ve kimyasal doğrulama uyuşturucu hedef olarak tüp bebek ve içinde vivo genetik ve insanlaşmış fare modelleri kullanarak lösemi için iletişim kuralları açıklar. Bu yöntem, herhangi bir hedef için genetik doğrulama ve terapötik geliştirme için uygulanabilir.

C-Fos rolü ve Dusp1 onkogen bağımlılığı değerlendirme yöntemleri

Bu protokol, fare rabdomiyosarkom primer hücrelerinin izolasyonu, tümörsphere oluşumu ve tedavisi ve tümörküre kültürlerinden başlayan allograft transplantasyonu için tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlar.

Mouse Rhabdomiyosarkomlardan İzole Edilen Primer Tümör Hücrelerinden Tümörfer Türevve Tedavisi

Onkojenik füzyon transkripsiyon faktörü fonksiyonu için özünde düzensiz alan adları önemlidir. Bu proteinleri terapötik olarak hedeflemek için, bu alanlar tarafından kullanılan düzenleyici mekanizmaların daha ayrıntılı bir şekilde anlaşılması gerekir. Burada, Ewing sarkomunda özünde düzensiz olan EWS alanının önemli yapısal özelliklerini haritalamak için transkriptomik kullanıyoruz.

Transcriptomik Analiz Kullanarak Düzensiz Onkojenik Transkripsiyon Faktörlerinin Yapı-fonksiyon İlişkilerinin Eşlenmesini

Bu deneysel protokol, lncRNA'nın koloni oluşturan testlerle birleştirerek lncRNA'nın osteosarkom hücre çoğalması üzerindeki etkisini niceleyen istikrarlı, maliyet etkin ve verimli bir yöntem sunar.

Koloni Oluşumu Testi LncRNA Knockdown Osteosarkom Hücrelerinin Proliferatif Kapasitesini Tespit Ediyor

Öğrenin fare fibroblast hücrelerinde retrovirüs kullanarak odak oluşumu testi ile bir genin onkojenik potansiyelini değerlendirme yöntemini. Bu teknik kanser biyolojisinde gen dönüşüm kapasitesini belirlemeye yardımcı olur.

Formation Odak: bir hücreye dayalı tahlil, bir genin onkojenik potansiyeli belirlemek için

Daha fazla video keşfet