Formation Odak: bir hücreye dayalı tahlil, bir genin onkojenik potansiyeli belirlemek için

Bu prosedürün genel amacı, bir genin onkojenik potansiyelini belirlemek için bir retrovirüs kullanarak fare fibroblast hücre hatlarında odak oluşturma testini gerçekleştirmektir. Bu, önce ilgilenilen genin dizisinin bir retroviral vektöre klonlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, viral vektör ve PLA e paketleme hücrelerini kullanarak retroviral partiküller üretmektir.

Daha sonra, retrovirüs, ilgilenilen genin transformasyon potansiyelini değerlendirmek için NIH üç T üç fare fibroblast hücresini enfekte etmek için kullanılır. Son adım, NIH üç T üç hücresinin iki ila üç hafta boyunca bölünmesine izin vermek ve ardından oluşan odakların sayısını ölçmek için kristal viyole boyamadır. Sonuç olarak, odak oluşumu testi, ilgilenilen bir genin aşırı ekspresyonunun fare fibroblast hücrelerinde yoğunluktan bağımsız büyümeyi indüklemek için yeterli olup olmadığını göstermek için kullanılır.

Bu yöntem, bir genin onkojenik potansiyelinin taranması gibi kanser biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başlamak için, viral vektörü metin protokolünde açıklandığı gibi yapın. Daha sonra, plat E hücrelerini 37 santigrat derece su banyosunda hızlı bir şekilde çözerek ve ardından 15 mililitrelik konik bir tüpe aktararak donmuş hücrelerden plat E kültürleri oluşturun.

15 mililitrelik konik tüpe yavaşça dokuz mililitre PLA E ortamı ekleyin. Tüpü beş dakika boyunca 180 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücreleri 10 mililitre plat E ortamı ile yeniden süspanse edin ve 10 santimetrelik bir kültür kabına aktarın.

Daha sonra hücreleri 37 derece Santigrat %5 CO2 inkübatörde %80 ila %90 arasında bir Birleşim olana kadar inkübe edin. Önce ortamı aspire ederek hücre bölme işlemini gerçekleştirin, daha sonra iki mililitre% 0.05 tripsin EDTA eklemeden ve oda sıcaklığında bir dakika inkübe etmeden önce hücreleri bir kez PBS ile yıkayın, hücreleri parmakla dokunarak ayırın. Daha sonra 10 mililitre plat E ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Tüpü daha önce olduğu gibi santrifüjleyin ve hücreleri 10 mililitre plat E ortamı ile yeniden süspanse edin. Bir sonraki tohum, herhangi bir antibiyotik olmadan plat E ortamı kullanılarak 10 santimetre kültür kabı başına 2 milyon hücre ve hücreleri gece boyunca kuluçkaya bırakılır. Ertesi gün, 300 mikrolitre optimumu 1,5 mililitrelik bir mikro tüpe aktarın.

Optum ile hazırlanan tüpe 27 mikrolitre polietilen amin ekleyin. Parmakla hafifçe vurarak karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra, vorteksleme ile hafifçe karıştırılmış tüpe dokuz mikrogram transfeksiyon dereceli plazmit DNA ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Ardından, gece boyunca inkübe etmeden önce karışımı plat E kabına damla damla ekleyin. Ertesi gün, transfeksiyon reaktifini içeren ortamı aspire edin ve NIH üç T üç kültür oluşturmak için hücreleri inkübatöre geri göndermeden önce 10 mililitre taze plat E ortamı ekleyin. İlk olarak, hücreleri 37 santigrat derece su banyosunda hızlı bir şekilde çözün ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Hücrelere yavaşça dokuz mililitre NIH üç, T üç orta ekleyin, tüpü beş dakika boyunca 180 kez G'de santrifüjleyin ve snat'ı atın. Daha sonra hücreleri 10 mililitre NIH üç, T üç orta ile yeniden süspanse edin ve 10 santimetrelik bir kültür kabına aktarın. Hücreleri 37 derece Santigrat derece% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin ve spontan dönüşüm sıklığı arttıkça onları birleşim altında tutun.

Bir kültür ko-akıcılığa ulaştığında, bir kez yetiştirilen tohum üç kez 10 ila beşinci nih, 10 santimetre çanak başına üç T üç hücre ve ertesi gün enfeksiyon için gece boyunca kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, 10 mililitrelik tek kullanımlık bir şırınga kullanarak, 0.45 mikron gözenek boyutunda bir naylon membran filtreden süzerek ve 15 mililitrelik bir tüpe aktararak plat E kabından retroviral süpernatanı hasat edin. İnkübatöre geri göndermeden önce hücrelere 10 mililitre taze plat E ortamı ekleyin.

Daha sonra, enfekte olacak ortamı NIH üç T üç hücreli çanaktan aspire edin ve beş mililitre normal NI H üç, T üç orta ve filtrelenmiş süpernatan içeren beş mililitre virüs ekleyin. Sonra, yemeğe poli beyin ekleyin. Mililitre başına altı mikrogramlık bir konsantrasyon ekleyin.

İkinci bir enfeksiyon turu için enfeksiyon adımlarını tekrarlamadan önce hücreleri gece boyunca inkübe edin. Enfeksiyonu takiben, virüsü değiştirin, düzenli IH üç T üç orta içeren ortam içerir. IH üç T üç hücresinin iki ila üç hücresinin büyümesine izin verin ve ortamı kristal viyole boyama için gerektiği gibi değiştirin.

NIH üç T üç besiyerini aspire edin ve bulaşıkları buzun üzerine yerleştirin. Bulaşıkları buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri buz gibi soğuk metanol ile 10 dakika sabitleyin.

Sonra bulaşıkları buzdan çıkarın ve metanolü aspire edin. % 25 metanolde yapılmış üç mililitre% 0.5 kristal menekşe çözeltisi ekleyin ve bulaşıkları oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, kristal viyole çözeltisini aspire edin ve durulamada renk çıkmayana kadar kabı Milli Q suyuyla dikkatlice durulayın.

Bulaşıkların gece boyunca üstü açık olarak bir tezgah üzerinde kurumasına izin verin. Bulaşıklar kuruduktan sonra, odakları ölçmek için bir cetvel kullanın ve çapı beş milimetreden büyük olanları sayın. MXD üç sayısı, MAD ailesinin atipik bir üyesi olan temel bir sarmal döngü sarmal lösin fermuar transkripsiyon faktörüdür ve negatif kontrol ve pozitif kontrol ile karşılaştırıldığında karsinogenezde rol oynadığı bildirilmiştir.

MXD üçünün aşırı eksprese edildiği NIH üç T üç tabak, önemli ölçüde daha az odağa sahipti. Veriler, anlamlılığı belirlemek için birden fazla deneyden toplandı ve bu testten de aynı eğilimler gözlendi. Sonuçlar, MXD üç'ün bu prosedürü takiben bir onkogen olarak işlev görmediğini göstermektedir.

Gen kombinasyonları ile odak oluşturma testi, yumuşak burgu proliferasyonunda büyüme ve hücre döngüsü analizi gibi diğer yöntemler, ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir: Onkogenez patogenezinde ilgilenilen bir genin rolünü değerlendirmek için.