Fare Cilt ve Saç Folikül Desenlendirme ve Duyusal Akson Morfoloji Analizi Uygulanması Düz ​​Görüntüleme Dağı

Bu prosedürün genel amacı, numuneyi fiziksel olarak kesmeden kıl folikülleri ve sinir uçları gibi cilt yapılarını bütünüyle görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle arka ayak ve kuyruk dahil olmak üzere vücudun çeşitli bölgelerinden cilt toplayarak gerçekleştirilir. İkinci adım ise cilt numunelerinin düzleştirilmesi ve temizlenmesidir.

Ardından deri örneklerine uygun fiksasyon uygulanır. Son adım, deri örnekleri üzerinde immün boyama veya histokimya gerçekleştirilmesidir. Nihayetinde, çeşitli deri yapılarının geometrisini görselleştirmek için stereo mikroskop veya konfokal mikroskop ile görüntüleme yapılır.

Bu tekniğin epidermal hormon mont hazırlama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, vücudun herhangi bir konumundaki cilde uygulanabilmesi ve epidermisin dermisten ayrılmasını gerektirmemesidir. Bu yöntem, plantar hücre polaritesi çalışmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Cildin iki boyutlu geometrisi ve kıl foliküllerinin sıra dışı düzeni, cildi bu süreci incelemek için ideal bir sistem haline getirdiğinden; bu yöntem sadece plantar hücre polaritesi hakkında bilgi sağlamakla kalmaz, aynı zamanda üst morfolojiler üzerindeki bireysel etkilerin doğrudan görselleştirilmesine dayalı somatosensoriyel nöron tiplerinin tanımlanması gibi cilt gelişiminin diğer yönlerini incelemek için de uygulanabilir.

Ayaklar ve kuyruk gibi bazı bölgelerden deri diseksiyonunun öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik önem taşır; deriyi mükemmel şekilde düzleştirmek, kırışıklıkları önlemek ve aşırı gerilmeden kaçınmak önemlidir. Bu gösterimde, izofloran inhalasyonu ile ötanize edilen üç P farelerinden dorsal deri toplanacaktır. Her bir yan boyunca kuyruk tabanından başlayarak, her bir ekstremitenin tabanının dorsal tarafından geçen, kulakların lateralinden ilerleyen ve burunda sonlanan yatay bir kesi yapmak için bistüri uçları kullanın.

Eldivenli parmaklarla deriyi tutarak, pensle sıkıştırılmasını önleyecek şekilde posteriordan anteriore doğru deriyi alttaki dokudan nazikçe soyun. Önce kulak seviyesindeki deriyi soyarken, kulakları bir makasla kesin ve derinin bu bölgede yırtılabileceği göz önünde bulundurularak özellikle yavaş ilerleyin. Bu noktadan itibaren deriyi iç yüzü yukarı bakacak şekilde yönlendirin.

Deriyi, çevresine eşit aralıklarla yerleştirilmiş yaklaşık 20 böcek iğnesi ile S Guard'a sabitleyin. Deriyi aşırı germeyin. Deriyi, açılı veya eğri pensler kullanarak 10 ila 20 mililitre PBS ile kaplayın.

Derine bağlı yağ ve bağ dokusunu diseke ederek uzaklaştırın. Pensin delici ucunu, deriyi delme riskini en aza indirmek için yatay tutun. Pamuklu aplikatörü deri yüzeyi üzerinde nazikçe yuvarlayarak deri altında hapsolmuş hava kabarcıklarını dışarı çıkarın.

Sıradaki adım pin derisini fikse etmektir. Eğer deri, melanin görüntüleme veya alkalen fosfataz histokimyası için kullanılacaksa, her 10 santimetrelik petri kabı için taze hazırlanmış 20 mililitre %4 PFA veya %10 tamponlu formalin ekleyin. Eğer deri, immün boyama veya transgenik bir keratin olan KRT 17 GFP'nin görüntülenmesi için kullanılacaksa, her 10 santimetrelik petri kabı için taze hazırlanmış 20 mililitre %2 PFA ekleyin; soğuk odada gece boyunca nazikçe döndürün ve ertesi gün 10 dakikadan fazla PBS ile yıkayın.

Alkalin fosfataz histokimyası prosedürü bu videoda gösterilmeyecektir. Melanin görüntüleme için, cildi oda sıcaklığında hafif yatay rotasyonla her adım için bir gün boyunca dereceli etanol serisi ileydehidre edin. Üç gün sonra, dehidre edilmiş ciltteki kalıntı bağ dokularını %100 etanol içindeki ciltten temizleyin.

Böcek iğnelerini çıkarın ve deriyi 10 santimetre çapında bir cam kaba aktarın. Bu prosedürün başarılı olması için deri örneği bütün bir parça halinde toplanmış ve tamamen düzleştirilmiş olmalıdır. Deriyi düzleştirmek ve kıvrılmasını önlemek için üzerine iki adet cam mikroskop lamı yerleştirin.

Dokunun sonraki birkaç saat içinde hızla sertleşmesini sağlayacak olan 20 mililitre benzoil benzoat ve benzoil alkol veya BBBA ekleyin. BBBA'nın deri üzerine yayılmasına izin vermek için lamları birkaç saniye boyunca deriden kaldırın. Kıl folikülü örüntüsünün analizi için ayak derisi genellikle P1 ile P8 arasındaki hayvanlardan diseke edilir. Ötanaziden sonra, ayakları ayak bileği ekleminin üzerinden kesin ve ayak tabanları boyunca ventral yüzey boyunca tek bir düz kesik atın.

Deriyi, proksimalden distale doğru ilerleyerek alttaki dokudan nazikçe soyun. Deriyi serbest bırakmak için parmakları kesin ve deriyi, iç yüzey yukarı bakacak şekilde sard'a iğneleyin. Ayakta bağ dokusu minimum düzeydedir.

Deri transgenik. KRT 17 GFP derisi artık melanin görüntülemesi için hazır durumdadır. Deriyi, daha önce dorsal deri için gösterildiği gibi tespit edin ve işleyin. P 21 hayvanının ötanazisinden sonra, tüy dökücü sürerek tüyleri temizleyin.

Eldivenli bir parmak ve başparmak yardımıyla cilt yüzeyine jel sürün ve 10 dakika bekleyin. Cilt yüzeyini musluk suyuyla yıkayın. Ardından, ayağı cilt tabakasını daha önce gösterildiği gibi S koruyucuya disseke edin ve iğneleyin.

Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %1 P-F-A-P-B-S ile tespit edin ve ardından PBS ile yıkayın. Kuyruk derisini hazırlamak için kuyruğun tabanına dairesel bir kesik atın ve ardından kuyruğun ventral yüzü boyunca uzunlamasına bir yarık açın. Kuyruk kemiğinin ucunu ve/veya bağ dokuyu bir pensle, deriyi ise ikinci bir pensle sıkıca kavrayarak kuyruk derisini uçtan başlayarak soyun.

Melanin dağılımı ve kıl folikülü yöneliminin analizi için kuyruk derisini SIL koruyucusuna iğneleyin. Sabitleme öncesindeki sebum bezlerinin analizi için, dorsal deri için gösterildiği şekilde deriyi sabitleyin ve işleyin. Kuyruk derisini yaklaşık 0,5 ile 1 cm uzunluğunda bir dizi segmente kesin ve deri parçalarını 5 mM EDTA içeren PBS içerisinde 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün dermis-epidermis adezyonunu zayıflatmak için, epidermisi dermisten nazikçe soyun. Epidermis arayüzünü S koruyucusuna iğneleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca %4 P-F-A-P-B-S içinde sabitleyin. Ardından epidermisi PBS ile yıkayın ve protokol metninde açıklandığı şekilde oil red O ile boyayın.

Cam lam altında düzleştirilmiş ve hala cam kapta bulunan, BBBA içine daldırılmış sırt ayağı veya kuyruk derilerini görüntülemek için bir diseksiyon mikroskobu kullanılır. Bu yaklaşım, mikroskobun BBBA ile kontamine olmasını en aza indirir. Görüş alanı boyunca ışık yoğunluğundaki mekansal varyasyonu minimize etmek için kabı alttan aydınlatın.

Cam kabı, diseksiyon mikroskobunun standart çalışma yüzeyinin yaklaşık 10 santimetre üzerine yükseltin ve ışık kaynağının üzerine plastik veya cam bir difüzör plaka yerleştirin. Görüntüleme tamamlandığında, deriyi -20 °C'de uzun süreli saklama için %100 etanol içerisine geri koyun. Alkalen fosfataz boyanmış deriyi görüntülemeye hazırlamak için, küçük protein jelleri için kullanılan tipteki iki cam plaka arasına yerleştirin.

Plakalar ile deri arasında hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Fazla BBBA'yı bir kağıt havluyla dikkatlice emdirerek temizleyin. Plaka-deri-plaka şeklinde hazırlanan bu sandviçi bir mikroskop tablasına yerleştirin.

10x objektif ile aydınlık alan veya DIC aydınlatması ve iki mikrometre veya beş mikrometre Z adımları kullanın. Tek bir üç boyutlu gri ölçekli veri seti oluşturmak için birbirine eklenen XY görüntüleri montajını yakalamak amacıyla mekanize bir XY tablası kullanın. Çeşitli yazılım paketlerinden herhangi birini kullanarak akson dallanmalarının yarı otomatik izlemesini gerçekleştirin.

Deri düz montajlarının parlak alan görüntülemesi, burada izlenmiş görüntüsüyle birlikte gösterilen tek bir kutanöz duyusal arborun görüntülenmesi için kullanılabilir. Parlak alan görüntülemesi aynı zamanda melanin pigmentasyonuna dayalı kıl folikülü modellerinin görselleştirilmesine olanak tanır. Bu görüntüler; vahşi tip ve frizzled altı nakavt farelerden alınan P1 derisini ve Frizzled altı nakavt farelerden alınan P7 derisini göstermektedir.

Deri düz mount'larının ışık mikroskobu görüntülemesi, sebum bezlerinin ve kuyruklarının geometrisini tanımlamak için kullanılabilir. Oil red O ile görselleştirilen deride, frizzled six knockout faredeki sebum bezleri, wild tip dorsal ayak ile karşılaştırıldığında düzensizdir. A GFP etiketli keratin KRT 17 GFP taşıyan wild tip ve frizzled six knockout farelerden alınan ve oil ile boyanan deri.

Red O, nakavt derinin merkezinde bir tüy girdabı olduğunu ortaya çıkardı. Deri düz montajlarının konfokal görüntülemesi, KRT 17 GFP ve anti GFP immün boyama ile görselleştirilen kıl foliküllerinin geometrisini ve erektör pili de tanımlayabilir. Anti düz kas aktin immün boyama ile görselleştirilen göz kasları.

Merkel hücresi kümeleri, anti sitokeratin sekiz ile veya am 1 43 boya alımıyla, merkezi kıl folikülü ise KRT 17 GFP ile görselleştirilir. Frizzled altı nakavt Merkel hücresi kümesi, ön tarafa açık olmak yerine kapalı bir daire oluşturur. Usul kavrandıktan sonra, uygun şekilde gerçekleştirildiğinde diseksiyon yaklaşık 30 dakikada tamamlanabilir ve farklı boyama işlemleri birkaç gün ile bir hafta arasında yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, vücudun çeşitli bölgelerinden deri örneklerinin nasıl toplanacağı ve hormon formatındaki farklı deri yapılarını görselleştirmek için bunların nasıl boyanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Deri yapılarının tam kalınlıklı, yüksek çözünürlüklü görüntüleri, standart yüksek ışık mikroskobu ve konfokal mikroskopi ile elde edilebilir.

Paraformaldehit ve BBBA ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu çözeltiler kapalı kaplarda tutularak buharların solunması en aza indirilmeli ve ciltle temastan kaçınılmalıdır. BBBA'nın plastikle temas etmesine izin vermeyin.