Ultrastrüktürel Analizler için Maya endozomal Sisteminin Nanogold Etiketleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, Saccharomyces cei mayasının endozomal kompartmanlarını ultrastrüktürel düzeyde görüntülemektir. Bu işlem, pozitif yüklü nano altın partiküllerinin endositik alımına maruz kalan maya sferoplastlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, hücrelerin ultra ince kriyokesitlerini elde etmek için örnek fikse edilir ve kesitlere ayrılır.

Ardından, kriyoseksiyonlar gümüş geliştirme reaksiyonuna tabi tutulur. Endositozla alınan pozitif yüklü nano altın partikülleri büyütmek ve görselleştirmek amacıyla, bu prosedürün spesifik etiketlemesine dayanarak farklı maya endozomal kompartmanlarının morfolojisini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, kesitlerin ImmunoGold etiketlemesi gibi mevcut yöntemlerimize göre temel avantajı, elektron mikroskobu preparatlarında genellikle çalışmayan antikorlara dayanmıyor olmasıdır.

Bu yöntem, sarchi ESIS vei mayasının lizozomal sistemi hakkında bize bilgiler sunabilse de, diğer mayalar ve memeli hücreleri gibi diğer ökaryotik modellere de uygulanabilir. Sferoplastın hazırlanacağı mayalar, öncelikle ertesi günkü deney tasarımına göre belirlenen uygun besiyerinin 10 mililitresi içerisinde 30 °C'de gece boyunca inkübe edilir. Kültürün optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçüldükten sonra, hücreleri aynı kültür besiyerinde OD 600 değeri 0,2 ile 0,4 olacak şekilde seyreltin.

Hücreleri OD 600 değeri bir ile iki olacak şekilde eksponansiyel büyüme fazına kadar büyütün, 10 OD 600 eşdeğeri hücreyi 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 2100 Gs'de santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatanı atın ve hücre peletini beş mililitre 100 millimolar pipes ve 10 millimolar dihi three içerisinde resüspande ederek 30 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri santrifüjleme yoluyla toplayın.

Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, hücreleri bir molar sorbitol ve beş miligram litik enzim içeren beş mililitre besiyerinde süspande edin. Karışımı 30 °C'de, hafif çalkalamalı olarak 30 dakika inkübe edin. Sferoplastlara karşılık gelen pellet fraksiyonunu toplamak için hücre süspansiyonunu 300 ×g'de beş dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı atın ve sferoplastları 1 molar sorbitol içeren 960 µL buz gibi soğuk ortamda yeniden süspande edin. Karışımı buz gibi soğuk 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Nano altın alım prosedürünü başlatmak için, bir pipet kullanarak sferoplastı pozitif yüklü nano altın parçacıklarıyla nazikçe karıştırın.

40 µL su içinde süspanse edin. Karışımın final hacmi 1 mL olmalıdır. Elde edilen hücre süspansiyonunu 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.

Süspansiyonu oda sıcaklığına getirin ve nano altının endositoz yoluyla hücre içine alınması için gerekli süre boyunca inkübe edin. İstenen nano altın alımı tamamlandığında, hücre süspansiyonuna bir molar sorbitol içeren bir mililitre çift yoğunlukta fiksatif ekleyerek reaksiyonu durdurun. Tüpü 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.

PHE plast ve süspansiyonun homojen kalmasını sağlamak için 30 dakika boyunca mikro santrifüj tüpünü manuel olarak birkaç kez yavaşça altüst edin. Ardından, 1700 Gs'de 25 saniye boyunca iki kez santrifüjleyin, süpernatantı atın ve 1 molar sorbitol içeren bir mililitre taze standart konsantrasyonda fiksatif ekleyip oda sıcaklığında, yavaşça dönen bir çark üzerinde iki saat inkübe edin. Sonrasında, hücreler metin protokolünde açıklandığı gibi işlenir ve kriyoseksiyonları alınır. Bu prosedüre başlamadan önce, gümüş güçlendirme kitini dondurucudan çıkarın ve 37 °C'lik bir inkübatörde çözdürün. Çözülen kiti, kullanım anına kadar karanlık odaya önceden yerleştirilmiş 24 °C'lik bir tezgah üstü inkübatöre koyun.

Bir ısıtıcı plakayı karanlık bir odaya yerleştirin ve 24 °C nihai sıcaklığa kadar ısıtın. Isıtıcı plakanın üst kısmını, parlak yüzü yukarı gelecek şekilde bir tezgah örtüsü koruyucu ile kapatın ve bantla sabitleyin. Yüzey koruyucunun üzerine parafilm yerleştirin ve karanlıkta görünürlüğü sağlamak için kenarları siyah bir markörle işaretleyin.

Bir termometreyi yüzey koruyucunun üst kısmına bantlayın. Isıtma plakasının sıcaklığını izlemek için sıcaklığı kademeli olarak ayarlayın. Eğer sıcaklık 24 °C değilse, çift distile su içeren 50 mL'lik bir tüp yerleştirin.

İnkübatörün içinde, küçük bir Petri kabını 37 °C'de ön ısıtma yapılmış çift distile su ile doldurun. Kriyo kesitlerin bulunduğu iki nikel ızgarayı, numune yüzeyleri aşağıya bakacak şekilde 30 dakika boyunca suyun içine yerleştirin. 30 dakika sonra, ikinci bir Petri kabını ön ısıtmalı çift distile su ile doldurun ve aynı iki nikel ızgarayı 30 dakika daha suyun içinde bekletin.

Izgaraları, ısıtma plakası üzerinde sabitlenmiş olan parfum üzerine yerleştirilmiş 24 °C'deki birkaç damla çift distile su üzerinden, numune tarafı aşağıya bakacak şekilde geçirerek tekrar durulayın. Gümüş geliştirme reaksiyonu sonrası durulama için parfum üzerinde dokuz ek çift distile su damlasının hazır olduğundan emin olun. Prosedürün bu aşamasında, karanlık odadaki tüm ışıklar kapatılmalı ve kırmızı ışık açılmalıdır.

Ancak, yalnızca çekim amaçlı olarak ışık açık kalacaktır. Bu gösterimde, gümüş güçlendirme kitinin A ve B çözeltilerini 24 °C'lik inkübatörden çıkarın; 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne altı damla A çözeltisi, ardından altı damla B çözeltisi ekleyin ve kabarcık oluşumunu önleyerek cam pastör pipeti ile iyice karıştırın. Çözeltiyi vorteksleyin.

a ve B çözeltilerini kısaca 24 °C'lik inkübatöre geri koyun ve C çözeltisini dışarı çıkarın. AB karışımına altı damla C çözeltisi ekleyin. Pastör pipetiyle tekrar karıştırın ve ardından vorteksleyin; hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.

Bu son karışımı hemen kullanın. Temiz, antimanyetik bir cımbız yardımıyla paraform üzerine damlalar yerleştirin. Gridleri karışımın üzerine yerleştirin.

Bu, gümüş geliştirme reaksiyonudur. Izgaraları, deney için istenen geliştirme düzeyine bağlı olarak altı ila 15 dakika boyunca bekletin. Izgaraları karışımdan çıkarın ve son üç yıkama için 24 °C'de Perfil üzerine yerleştirilmiş altı damla çift distile sudan hızlıca geçirin.

Izgaraları, damla başına yedi dakika boyunca suyun içinde bekletin. Gerçek bir deney yürütülüyorsa, yıkama işlemi tamamlandığında ışıkları tekrar açın. Ardından, sonuçlar EM incelemesi için ya ImmunoGold işaretleme ya da membran boyama ile görselleştirilir.

Farklı maya endozomal kompartıman türleri, gümüşle güçlendirilmiş nano altın ile işaretlenebilir ve elektron mikroskobu ile görselleştirilebilir. Beş dakikalık nano altın alımı, plazma membranı ile muhtemelen endositik veziküller olan tekli veziküller ve büyük olasılıkla erken endozomlar olan tübüler yapılar gibi erken endozomal kompartımanları işaretler. Nano altın ile 30 dakikalık inkübasyon, geç endozomların veya multiveziküler gövdelerin işaretlenmesini sağlar.

Bir immüno elektron mikroskopi prosedürünün bu nano altın gümüş geliştirme protokolü ile birleştirilmesinin çözünürlük gücü, gösterilen organellerin, özellikle de çok veziküllü gövdelerin iç veziküllerinin morfolojisinin korunması ve kalitesiyle vurgulanmaktadır. Gümüş geliştirme yöntemini kullanmadan önce, bu gümüş parçacıklarının hem boyutu hem de tekdüzeliği için gerekli olan optimal inkübasyon sürelerini belirlemek amacıyla bir pilot deney yapılması gereklidir. Bu prosedürün ardından.

Belirli bir proteinin, hücre altı kompartımanlardaki lokalizasyonu gibi soruları yanıtlamak için immün markalama gibi diğer yöntemler uygulanabilir.