Name: Ultrastrüktürel Analizler için Maya endozomal Sisteminin Nanogold Etiketleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae mayasında endozomal bölmeleri nanogold etiketleme ile ultrastrüktürel düzeyde görüntüleme yöntemini. Bu teknik, antikor tabanlı yöntemlerin sınırlamalarını aşarak hücresel trafikleme çalışmalarına güçlü bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, Şekil hazırlanması ile yardım için Rene Scriwanek ederiz. FR ALW Açık Programı (821.02.017 ve 822.02.014), DFG-NWO işbirliği (DN82-303) ve ZonMW VICI (016.130.606) hibeler, ECHO (700.59.003) tarafından desteklenmektedir.

1.. Sferoplast Hazırlık <ol><li> Deneyin tasarımı ile belirlenen uygun bir ortam, 10 ml, 30 ° C&#39;de gece boyunca maya inkübe edin. </li><li> Bir gün sonra, bir fotometre kullanılarak 600 nm (OD 600) de, kültürün optik yoğunluğu ölçmek bir OD 0,2-0,4 600 aynı kültür ortamı içinde seyreltilir ve hücrelere tasarımında sürece üstel büyüme fazına büyüyebilir deneyi farklı bir durum gerektirir. Kültür OD 1-2 600 olduğunda Hücreler üslü faza içindedir. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içinde 5 dakika boyunca 3500 x g&#39;de santrifüj ile hücreler 10 OD 600 eşdeğer toplayın. Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atın. </li><li> 100 mM PIPES (pH 9.6), 5 ml, 10 mM ditiyotreitol ve 10 dakika boyunca 30 ° C&#39;de inkübe hücre pelletini. </li><li> 5 dakika boyunca 3500 x g&#39;de santrifüj ile tekrar hücreleri toplamak. Süpernatant atın. </li><li> Hücrelerin tekrar in, 1 M sorbitol ve litik enzimin, 5 mg ihtiva eden (Deneyin tasarımı ile belirlenir) ve yumuşak 30 dakika boyunca çalkalama ile 30 ° C&#39;de inkübe karışımı ortam 5 ml. </li><li> Spheroplastlar karşılık gelen pelet fraksiyonu toplamak için 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de hücre süspansiyonu santrifüj. Süpernatant atın. </li><li> Buz gibi soğuk 960 ul ortam içerisinde yeniden süspanse spheroplastlar, 1 M sorbitol ihtiva eden (ortam Deneyin tasarımı ile belirlenir) ve bir buz soğuk 2 ml mikrosantrifüj tüpü içine karışımı aktarın. </li></ol> 2.. Nanogold Alımı <ol><li> Bir pipet kullanarak, yumuşak su 40 ul içinde yeniden süspansiyon haline getirildi pozitif yüklü parçacıkların nanogold 4 nmol ile sferoplast karıştırın. Karışımın nihai hacmi 1 ml olmak zorundadır. </li><li> 15 dakika boyunca buz üzerinde, elde edilen hücre süspansiyonu yerleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında süspansiyonu aktarın ve e nanogold içselleştirilmesi izin gerekli süre boyunca inkübendocytosis. NOT: 15 dakika alımı (erken ve geç endozomları) tüm endozomal sistemi işaretlemek için izin verir ise bir 5 dk alımı başta, endositik kesecikler ve erken endozomal bölmeleri etiketlenmesine yol açacaktır. Daha uzun inkübasyon zamanları (en fazla 30 dakika) de vakuol etiket için izin verir. NOT: Darbe kovalayıcı etiketleme deneyleri, bu yöntem ile gerçekleştirilemez. LE analizinde etiketleme, bu nedenle, aynı zamanda nanogold AM ve INEE de tespit edilecektir. </li></ol> 3.. Fiksasyon ve Bölünmesi <ol><li> Çift gücü fiksatif 1 ml ilave etmek suretiyle nanogold alımını durdurma [% 4 paraformaldehit (PFA), 0.1 M PHEM tampon maddesi içinde% 0.4 glutaraldehid (GA) (20 mM PIPES, 50 mM HEPES, pH 6.9, 20 mM EGTA, 4 mM MgC! 2)] hücre süspansiyonuna 1 M sorbitol ihtiva etmektedir. Oda sıcaklığında tüpü devam etti. </li><li> Yavaşça (bu spheroplastlar tutmaya izin verir 30 dakika boyunca micocentrifuge Tüpleri el ile birkaç kez ters çevirinsüspansiyon) ve daha sonra 25 saniye boyunca 1700 xg iki kez santrifüj. </li><li> Süpernatantı atarak ve taze standart gücü fiksatif 1 ml (% 2 PFA, 0.1 M PHEM tampon maddesi içinde% 0.2 GA) 1 M sorbitol ihtiva eden, yavaşça dönen bir tekerlek üzerinde, oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe ekleyerek fiksatif değiştirin. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi, 6 cryo-kesit için hücreleri işleyin. Not: nanogold alımı ve gümüş geliştirme prosedürleri için, belirtilen protokol açıklanan periyodik asit muamele yapılması için değil. Periyodik asit muamelesi daha hücre duvarı permeabilize 26, ancak bu yapı spheroplastlar üretimi sırasında elimine edilmiştir. </li><li> Önce 8 açıklandığı gibi bir UCT&#39;de ultramikrotom kullanılarak kuru elmas bıçak ile -120 ° C de 50 nm ince cryosections kesilmiş ve 50 nikel ızgaralarını hasır kaplı Formvar karbon üzerine koyun. </li></ol> Nanogold Partikül Visua boyunca 4. Silver Cinsellization Not: Reaksiyon karışımları hazırlamak için prosedür temelde, üretici tarafından belirtilen biridir. Bu protokolü kullanarak pratik uyarlamaları, cryosections üzerinde gümüş geliştirme prosedürü etkin ve güvenilir kılar. <ol><li> Dondurucu gümüş güçlendirme seti çıkarın ve bir 37 ° C kuluçka makinesi ya da su banyosu içinde eritin. Çözülmüş zaman, (4.7 bakınız) kullanıma kadar karanlık bir odaya yerleştirilen bir 24 ° C inkübatör kiti yerleştirin. </li><li> Karanlık bir odada, ısıtma plakasını ve 24 ° C nihai sıcaklığa ısınmasına </li><li> Yüzey koruyucu, parlak tarafı üste, ve bir bantla sabitleyin ısıtma plakasının üst kapağı. </li><li> Benchkote üzerinde Parafilm koyun ve karanlıkta Parafilm kenarları görmek mümkün siyah işaretleyici ile kenarları işaretleyin. </li><li> Isıtma plakasının sıcaklığını izlemek için Benchkote üstündeki bir termometre bantlayın. Yavaş yavaş sıcaklığını ayarlamak değilse 24 ° C. </li><li> Plaiki kez damıtılmış su ve içinde gümüş güçlendirme seti ile 50 ml tüp ce. </li><li> Iki kez damıtılmış su ile küçük bir Petri kapları doldurmak, 37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış Suda ızgaraları yerleştirin, 30 dakika boyunca, aşağı tarafı numune. </li><li> Bu 4.7 adımı bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Saklama kutusunda ızgaraları aktarın ve karanlık odaya getirmek. </li><li> Isıtma plakası üzerinde sabitlenmiş olan Parafilm yerleştirilen 24 ° C &#39;de iki kere damıtılmış su içinde birkaç damla on (aşağı numune yüzü) geçirilerek yeniden ızgaraları durulayın. </li><li> 9 ek olarak çift distile su damlaları gümüş güçlendirme reaksiyondan sonra durulama için, Parafilm hazır olduğundan emin olun. </li><li> Işığı kapatın ve tüm ışıklar kapalı olduğundan emin olun. Kırmızı ışık açın. </li><li> 24 ° C inkübatör gümüş geliştirme kiti A ve B çözümler dışarı atın. </li><li> Ilk olarak bir çözelti, 6 damla ve 1,5 m olarak B çözeltisi daha sonra 6 damla koymakl mikrosantrifüj tüp ve baloncuklar yapmak için kaçınarak bir cam Pasteur pipeti ile iyice karıştırın. Çözelti, oldukça kalın olup, son olarak el ile kısaca girdaplama önce bir pipet ile karıştırılmalıdır. </li><li> Geri 24 ° C inkübatör A ve B çözümler koyun ve C çözüm çıkar. </li><li> A / B karışımına C çözeltisi 6 damla ekleyin. Sonra bir Pasteur pipeti ile birinci tekrar karıştırın ve sonra vorteks tarafından, kabarcıkları yapmamak. </li><li> Parafilm (~ 20 ul / damla) damla koyarak hemen nihai karışımı kullanın. </li><li> Temiz, anti-manyetik cımbız ile, elde edilecek olan arzu donanıma (altın parçacıkları, yani. Boyutu) bağlı olarak 6 to15 dakika için karışımın (örneğin,., Gümüş artırılması reaksiyonu) ile ilgili en ızgaraları yerleştirin. </li><li> Karışımdan ızgaraları çıkarın ve yıkama için 24 ° C &#39;de damla iki kez damıtılmış suyun üstüne onları geçmektedir. Birincisi, hızla arkaya 6 damla kullanmak ve daha sonra damla başına 7 dakikalık inkübasyon süresi ile 3 damla, Işıkları açmadan önce. </li><li> Bir sonraki adım, bir EM soruşturma sonucu görselleştirmek için bağışıklık altın etiketleme veya zar boyama 27 ya geçin. </li></ol>

<ol><li>Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocytic+pathway%3A+a+mosaic+of+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The endocytic pathway: a mosaic of domains.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).</li>
<li>Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomes%3A+multipurpose+designs+for+integrating+housekeeping+and+specialized+tasks%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks.</a> Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).</li>
<li>Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes%3A+fusion+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes: fusion and function.</a> Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).</li>
<li>Meel, E., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+imagination%3A+understanding+the+endo-lysosomal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system.</a> Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).</li>
<li>Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+screen+for+vacuolar+protein+sorting+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).</li>
<li>Griffith, J., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+nanogold-labeled+endocytic+compartments+of+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+using+a+cryosectioning+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure.</a> J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).</li>
<li>Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESCRT-III%3A+an+endosome-associated+heterooligomeric+protein+complex+required+for+MVB+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting.</a> Dev Cell. 3, 271-282 (2002).</li>
<li>Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryosectioning+procedure+for+the+ultrastructural+analysis+and+the+immunogold+labelling+of+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Traffic. 9, 1060-1072 (2008).</li>
<li>Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+retrieval+of+the+exocytic+SNARE+Snc1p+from+early+yeast+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes.</a> Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).</li>
<li>Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordering+of+compartments+in+the+yeast+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway.</a> Traffic. 3, 37-49 (2002).</li>
<li>Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fab1p+PtdIns%283%29P+5-kinase+function+essential+for+protein+sorting+in+the+multivesicular+body%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body.</a> Cell. 95 (3), 847-858 (1998).</li>
<li>Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+labeling+of+cryosections+from+high-pressure+frozen+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells.</a> Traffic. 8, 471-485 (2007).</li>
<li>Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neutral+pH+silver+development+method+for+the+visualization+of+1-nanometer+gold+particles+in+pre-embedding+electron+microscopic+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry.</a> J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).</li>
<li>Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+visualization+of+insulin+translocation+into+the+cytoplasm+and+nuclei+of+intact+H35+hepatoma+cells+using+covalently+linked+Nanogold-insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin.</a> Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).</li>
<li>Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+ultracryotomy+of+cell+suspensions+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues.</a> J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).</li>
<li>Cabrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+a+membrane+curvature-sensing+motif+switches+function+of+the+HOPS+subunit+Vps41+in+membrane+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering.</a> J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).</li>
<li>Harner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+contact+site+complex%2C+a+determinant+of+mitochondrial+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture.</a> EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).</li>
<li>Nair, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE+proteins+are+required+for+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SNARE proteins are required for macroautophagy.</a> Cell. 146, 290-302 (2011).</li>
<li>Jacquier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+are+functionally+connected+to+the+endoplasmic+reticulum+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).</li>
<li>Karanasios, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipid+droplet+and+membrane+biogenesis+by+the+acidic+tail+of+the+phosphatidate+phosphatase+Pah1p%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p.</a> Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).</li>
<li>Mari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Atg9-containing+compartment+that+functions+in+the+early+steps+of+autophagosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis.</a> J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).</li>
<li>Nair, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Atg8-PE+deconjugation+in+autophagosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis.</a> Autophagy. 8, 780-793 (2012).</li>
<li>Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exit+from+the+Golgi+is+required+for+the+expansion+of+the+autophagosomal+phagophore+in+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).</li>
<li>Erpapazoglou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+role+for+K63-linked+ubiquitin+chains+in+multivesicular+body+biogenesis+and+cargo+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting.</a> Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).</li>
<li>Tuinen, E., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolocalization+of+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase%2C+hexokinase%2C+and+carboxypeptidase+Y+in+yeast+cells+at+the+ultrastructural+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level.</a> J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).</li>
<li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+and+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).</li>
<li>Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+the+yeast+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Morphology of the yeast endocytic pathway.</a> Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).</li>
<li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).</li>
<li>Hainfeld, J. F., Powell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+frontiers+in+gold+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">New frontiers in gold labeling.</a> J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Immuno-elektron-mikroskopisi, bu proteinlerin bulunan taşıyıcıları ve organellerin ultrastrüktürel çözünürlüğe sahip proteinlerin birleştirilmesi lokalizasyonu sağlayan bir tekniktir. Onun bölmeleri floresan mikroskobu olarak noktasal yapıları görünür, çünkü maya endozomal sistemini inceleyerek bu özellikle önemlidir. Bu, onları ayırmak için zordur. Bu nedenle EM tarafından algılanabilir ve bir zaman bağlı bir şekilde endositik yol giren için çok önemlidir bir probun kullanılması, özellikle farklı endozomları işaretleyi...

Endozomal Sistem 1,2 reseptörleri lizozomal enzim ayırma reseptörlerinin ticareti ve plazma membranı (PM) geri dönüşüm de dahil olmak üzere çok sayıda çok önemli hücresel rol oynayan önemli bir zar sıralama aletidir. Endosomlar üç farklı bölümlerinde, yani ayrılır. Erken endozomlar (EE), geç endozomlar (LE) ve geri dönüşüm endozomlar. Bu sınıflandırma da spesifik bir işaretleyici proteinler ve onların morfolojisi üzerine, onlara ulaşmak için endositeze malzeme için gereken zaman dayanmaktadır. PM den içselleştirilmiş membranlar, yani protein ve lipid çift, iki bozulması için Endozomlar yoluyla lızozomlara teslim edilebilir ya da geri dönüştürülebilir. Membranlar da lızozomlara devam veya geri Golgi&#39;ye alınmak ya, benzer Golgi&#39;ye gelen Endozomlar taşınan ve edilmektedir. Ayrıca, protein endozomal sınırlayıcı zarın oluşumuna yol açan bir işlem içeri doğru tomurcuklanma lümen vezikülleri içine sıralanabilirLE bir alt kategori, multiveziküler organları. Maya endozomal sistemi göreceli olarak daha az karmaşık, yüksek ökaryotik hücrelerin olandan. Maya endozomlar EE ve LE ayrılır. Bu geri dönüşüm endozomları değil, aynı zamanda dokuya özel lizozom ilgili organellere içermeyen memeli hücrelerinin tersine. Dolayısıyla onlar endozomal kaçakçılık yollarının 3,4 daha az karmaşık bir ağ var. Bu nedenle, maya temsil hala endozomal sistemindeki temel ilkeler zar trafiğin bir çalışma için avantajlı bir deneysel sistem temsil vardır. Bu avantaj, endozomal yollarıyla ilgili çok sayıda gen başlangıçta 5 maya genetik ekranlar ile izole edilmiş gerçeği ile vurgulanmıştır. Vahşi tip ve mutant maya hücrelerinde endozomal sisteminin kapsamlı biyokimyasal ve floresan mikroskobu yaklaşımlar kullanılarak incelenmiştir da, ultra-yapı seviyesinde bu araştırma tek olmuşturminimal. Endozomal organellerin çoğunun kesin tanımlama 6 zorlaştırır floresan mikroskobu ile noktasal yapılar olarak tespit edilir, çünkü Şekil incelemesi maya içinde özellikle önemlidir. Ne yazık ki maya endozomal protein belirteçlerinin tanıma antiserumların sadece sınırlı sayıda (IEM) preparatları 7-10 immün elektron-mikroskopi çalışıyor. Bazı proteinleri için, bu sorun, ilgi konusu genin endojen etiketleme ve 7,11,12 tespit etmek için etiketi tanıyan bir antikorun kullanılması engellenebilecektir edilmiştir. Ancak genellikle, proteinler, bunların düşük sentezleme seviyeleri IEM ile tespit edilemez. Bu yaklaşım, morfoloji / fonksiyonları yanlış lokalizasyonu ve / veya değişiklik oluşturabileceği nedeniyle aşırı ifadesi bir çözüm değildir. Böylece elektron mikroskobu EM tarafından saptanabilen bir prob ile endositik bölmelerin etiketleme etkili bir seçenektir. Bu, özellikle eğer iyi bir çözüm değildir prObe belirli bir organelini 6 işaretlemek ne zaman bilmek sağlayan bir zamana bağlı bir şekilde endositik güzergahı giriyor. Maya spheroplastlar (hücre duvarı enzimatik kaldırılmıştır, yani. Maya) ile pozitif yüklü nanogold alımı, başarılı bir şekilde, maya endozomal 10 bölmeleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu partiküller biyolojik zarların oluşturan negatif yüklü lipidler bağlanır. Böylece AM ile pozitif yüklü nanogold ortakları, endositoz ile hücre nüfuz eder ve vakuol ulaşmadan önce EE ve LE geçer. Bu küçük altın partikülleri, ancak, EM tarafından görülecek uygun bir büyüklüğe sahip değildir. Onları görünür kılmak için, boyutları altın prob yaklaşık 13-15 gümüş ya da altın çökelmesi yol açan kimyasal reaksiyonlar ile büyütülebilir. Biz geliştirdik ve başarıyla subsellüler gerçekleştirmek için Tokuyasu yöntemine dayalı bir IEM yaklaşım uyguladıkyerelleştirme 8,16 çalışmalar. Bu yöntem, morfolojisi 8,17-24 mükemmel bir çözünürlüğe sahip maya hazırlıkları immunogold etiketleme performans sağlar. Biz de 6 bölmeleri maya endozomal sisteminin nanogold etiketleme ile bu IEM protokolü birleştirerek bir prosedür kurduk. Biz morfolojik kusur 6,25 bir endozomal kaçakçılığı ile mutantlar endozomların farklı alt sınıflarını karakterize ve ultrastruktural inceleyen bu yaklaşımı kullanarak. Ayrıca, bu nanogold etiketleme immünolojik etiketleri en farklı endozom alt grupları üzerinde ilgi konusu bir proteinin dağılımını keşfetmek için imkanı sağlayan kombine edilebilir olduğunu göstermiştir. Burada, pozitif yüklü nanogold ile maya endozomal sisteminin etiketleme pratikte nasıl gerçekleştirildiğini mevcut.

<table><tbody><tr><td>BORULAR (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure)</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>1,102,200,250</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>391,340</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Merck, Darmstadt, Almanya</td><td>1.058.330.250</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>Pozitif yüklü Nanogold</td><td>Nanoproblar, Yaphank, NY</td><td>2022</td><td>mağazası -20 &� derece; C</td></tr><tr><td>HQ-gümüş ve ticaret; geliştirme kiti</td><td>Nanoprobes, Yaphank, NY</td><td>2012</td><td>mağazası -20 & derece; C</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td> <td>Sigma, St louis, MO</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehit% 8 EM sınıfı</td><td>Polyscience, Inc., Warrington, PA</td><td>216</td><td>-20 & derece'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Litik enzim</td><td>MP Biomedicals, Santa Ana, CA</td><td>153526</td><td>-20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>50 gözlü nikel ızgaralar ve nbsp;</td><td>Agar Scientific, Stansted, Birleşik Krallık</td><td>G209N</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-immuno elmas bıçak 35&deg;</td><td>Diatome AG, Biel, İsviçre</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>UCT ultramikrotom ve nbsp;</td><td>Leica, Solms, Almanya</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 15/95 reçine</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri, Hatfield, PA</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>50 gözlü nikel ızgaralar&nbsp;</td><td>Agar Scientific, Stansted, İngiltere</td><td>AGG2050N</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma, St Louis, MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Izgaralar saklama kutusu</td><td>Leica, Solms, Almanya</td><td>162-50</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm x 15 mm Petri kabı</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur kılcal pipetler 150 mm</td><td>Van Bruggen Glas, Rotterdam, Hollanda</td><td>10216234</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml mikrosantrifüj&nbsp;</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Almanya</td><td>72690001</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tüp</td><td>Bio-one, Alphen aan den Rijn, Hollanda</td><td>210296</td><td></td></tr><tr><td>Benchkote yüzey koruyucu</td><td>Whatman, Maidstone, İngiltere&nbsp;</td><td></td><td></td>1159201</tr></tbody></table>

ultrastrüktürel analizler için maya endozomal sisteminin nanogold etiketleme

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Endosomlar ökaryotik hücrelerde kontrol noktaları sıralama önemli membran biri olan ve daha çok plazma zarı ve Golgi proteinlerin geri dönüştürülmesi ya da imha düzenler. Bunun bir sonucu olarak endozomal sistemi, hücre homeostazın sürdürülmesinde bir rol oynar ve veziküler taşıma araçları ile birbirine organel bu ağa ait olan genlerdeki mutasyonlar, kanser ve nörobiyolojik bozukluklar da dahil olmak üzere ciddi bir probleme yol açar. Bu endozomal sisteminin biogenezi ve organizasyon altında yatan mekanizmaları anlamak için bu nedenle asal öneme sahiptir. Maya Saccharomyces cerevisiae bu görevde önemli olmuştur. Özellikle etiket ve ultrastrüktürel düzeyde bu model organizmanın endozomal sistemi analiz etmek için, biz burada bir gümüş güçlendirme reaksiyonu ile bu parçacıkların görselleştirme ardından spheroplastlar tarafından pozitif yüklü nanogold alımı için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu yöntem, aynı zamanda, bir çok değerli olduğuendozomal kaçakçılığı kusurları ile mutantların morfolojik inceleme için l. Ayrıca, sadece elektron mikroskobik inceleme için geçerlidir, ama aynı zamanda protein lokalizasyonu araştırmalar için immünolojik labelings ile kombine edilebilir.

Sunulan protokole göre, maya endozom sisteminin morfolojisi iletim EM erişim olabilir. Şekil 1 ulaştı ve bu nedenle nanogold ile etiketlenmiş endozomal bölmelere farklı gösterir. Gümüş geliştirilmiş nanogold net elektron yoğun parçacıklar olarak görülebilir. Gümüş geliştirme reaksiyonu için kurulmuş uygun ayarlar maya hücresinin ultrastrüktürdeki müdahale etmez 5 ve 15 nm arasında, homojen bir boyut aralığı içinde parçacıklara sahip olan altın sağlar. Plazma membranı hem de LE, sunulan durumda multivezi...

Maya, Saccharomyces cerevisiae, endozomal sistemin biogenezi ve fonksiyonlarını düzenleyen genleri tanımlamak ve incelemek için bir anahtar bir model organizma olmuştur. Burada ince yapı çalışmaları için endozomal bölmelere spesifik etiketlenmesi için detaylı bir protokol mevcut.

Ultrastrüktürel Analizler için Maya endozomal Sisteminin Nanogold Etiketleme

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, Saccharomyces cei mayasının endozomal kompartmanlarını ultrastrüktürel düzeyde görüntülemektir. Bu işlem, pozitif yüklü nano altın partiküllerinin endositik alımına maruz kalan maya sferoplastlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, hücrelerin ultra ince kriyokesitlerini elde etmek için örnek fikse edilir ve kesitlere ayrılır.Ardından, kriyoseksiyonlar gümüş geliştirme reaksiyonuna tabi tutulur. Endositozla alınan pozitif yüklü nano altın partikülleri büyütmek ve görselleştirmek amacıyla, bu prosedürün spesifik etiketlemesine dayanarak farklı maya endozomal kompartmanlarının morfolojisini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, kesitlerin ImmunoGold etiketlemesi gibi mevcut yöntemlerimize göre temel avantajı, elektron mikroskobu preparatlarında genellikle çalışmayan antikorlara dayanmıyor olmasıdır.Bu yöntem, sarchi ESIS vei mayasının lizozomal sistemi hakkında bize bilgiler sunabilse de, diğer mayalar ve memeli hücreleri gibi diğer ökaryotik modellere de uygulanabilir. Sferoplastın hazırlanacağı mayalar, öncelikle ertesi günkü deney tasarımına göre belirlenen uygun besiyerinin 10 mililitresi içerisinde 30 °C'de gece boyunca inkübe

nanogold-labeling-yeast-endosomal-system-for-ultrastructural

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

GFP-füzyon proteinleri yaygın konfokal mikroskobi organelleri görselleştirmek için kullanılır. Ancak, genellikle bireysel mutagenez organellerin morfolojisini etkileyen mutasyonlar için tarama gerektirir ve zaman alıcıdır. Burada, neredeyse 5.000 maya gerekli olmayan genlerin aynı anda organel-GFP işaretleri dahil etmek için bir yöntem göstermektedir.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

Bozulma ve geri dönüşüm için maya vakuol asidik lümen organelleri teslim izlemek için sağlam bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yöntem, genetik olarak kodlanmış çift emisyon floresan pH biyosensör ve floresan mikroskobu kullanarak tek tek hücrelerin görselleştirme hedef organellerin özel etiketleme dayanmaktadır.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Bu makalede, sentezi ve nanopartiküllerin floresan etiketleme (UP) için yöntemler tarif etmektedir. NPler ökaryotik hücrelerin endo-lızozomal sistemi etiket darbe kovalayıcı deneyler uygulanmıştır. Hücre içi patojen Salmonella enterica faaliyetleri ile Endo-lizozomal sistemin Manipülasyon canlı hücre görüntüleme ve sayısal izledi.

Floresan Nanopartiküller Uygulama Hücre içi Bakteri tarafından Endo-lizozomal Sistemi Modelleme Eğitim için

Veziküler kaçakçılık olaylarının doğru bir şekilde ölçülmesi, genellikle belirli proteinlerin rolleri ve mutasyonların etkileri hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu makale, kantitatif floresan mikroskobu ve akış sitometrisi kullanılarak canlı hücrelerde endositik olayların nicelleştirilmesi için bir araç olarak pH'a duyarlı bir GFP varyantı olan süperekliptik pHluorin'i kullanma yöntemlerini sunmaktadır.

Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

Bu makale, transmisyon elektron mikroskobu ile süspansiyon hücreleri görselleştirme için bir kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir cryofixation yöntemini tarif etmektedir.

Dalma Donma: Transmisyon Elektron Mikroskobu içinde Süspansiyon Hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için Aracı

Bu protokol, çok renkli 4d (zaman atlama 3D) Konfokal mikroskobu kullanarak mantar tomurcuklanan içinde floresan etiketli hücre içi bölmeler Analizi açıklanmaktadır. Görüntüleme parametreleri, fotodamat kısıtlarken yeterli sinyalleri yakalamak için seçilir. Özel ımagej eklentileri etiketlenmiş yapıların izlenmesini ve niceli olarak analiz edilmesini sağlar.

Maya 4D mikroskopisi

Burada, araştırmacıların mitoz ve Meiosis sırasında yaşayan fisyon Maya hücrelerinde protein davranışları ve nükleer dinamikleri incelemesini sağlayan toksik olmayan bir mikroskopi yöntemi olan canlı hücreli görüntüleme sunuyoruz.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Baker mayası mitokondriyal genom sekiz polipeptid kodlar. Mevcut protokolün amacı, hepsini etiketlemek ve daha sonra bunları ayrı bantlar olarak görselleştirmektir.

Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi

Bu protokol, yapısal olarak korunmuş kromatin in situ içindeki replikasyon bölgelerinin yüksek çözünürlüklü haritalanması için, önceden gömülmüş EdU-streptavidin-Nanogold etiketleme ve ChromEMT'nin bir kombinasyonunu kullanan bir teknik sunar.

Elektron Tomografisi ile Ultrayapısal Olarak Korunmuş Kromatinde Görüntüleme Replikasyon Alanları

Mevcut protokol, yeni bir otonükleasyon bastırma mekanizmasına dayalı altın nanopartikül sentez tekniği kullanarak hücrelerdeki metallothionein etiketli proteinleri tespit etmek için klonlanabilir bir elektron mikroskobu etiketleme teknolojisini tanımlamaktadır.

İyi Korunmuş Ultrayapı ile Protein Lokalizasyon Analizi için Hücrelerde EM-Görünür Altın Nanopartiküllerinin Doğrudan Sentezi

Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae mayasında endozomal bölmeleri nanogold etiketleme ile ultrastrüktürel düzeyde görüntüleme yöntemini. Bu teknik, antikor tabanlı yöntemlerin sınırlamalarını aşarak hücresel trafikleme çalışmalarına güçlü bir alternatif sunar.

Ultrastrüktürel Analizler için Maya endozomal Sisteminin Nanogold Etiketleme

Daha fazla video keşfet