Name: İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Hedefleme Çinko parmak Nükleazlar Geliştirilmiş Gen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Öğrenin, insan embriyonik kök hücrelerinde çinko parmak nükleazlar kullanarak PITX3 lokusuna transgen hedefleme yöntemini. Bu teknik, santral sinir sistemi gelişimi ve gen fonksiyonu çalışmalarında yüksek verimlilik sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu protokol açıklanan Çalışma Rejeneratif Tıp Kaliforniya Enstitüsü (CIRM) ile bir işbirliği ittifak parçası olarak Victoria Hükümeti tarafından finanse edilerek mümkün olmuştur.

Tüm işlemler steril bir laminer akış başlığı içinde yapılır. Aksi belirtilmediği sürece tüm ortam ve solüsyonlar 37 ° C&#39;de dengelenir. Transfaksiyon için (bu Protokolde kullanılan HESC ve hiPSCs, WA-09) İnsan ÖGŞ 1. Genişleme Not: Matrigel veya Geltrex üzerinde HESC genişletmek için gerekli değildir. fare embriyonik fibroblastlar (MEF&#39;ler) genişletilmiş HESC MEF giderme aşaması aşağıdaki elektroporasyon veya nucleofection için kullanılabilir (bakınız bölüm 2.8 bakınız). <ol><li> 1 x 100 mm tabak ve MEF medya cm2 başına 2.0 x 10 hücre 4 DR4 MEF&#39;lerin 1 x 75cm2 balon içinde Hazırlama / hac% 0.1 a jelatin ile ön-kaplı kaplar üzerinde (Tablo 1 e bakınız). Not: CF1, BLK6 veya MF1 MEF&#39;ler kullanılabilir, ancak, örneğin, DR410, antibiyotik dirençli MEF hatları kullanılır önerilir. </li><li> Ertesi gün, 100 mm tabak üzerine geçiş HESC bölüm 1.1 &#39;de hazırlanan MEF&#39;ler ile ön-kaplama. Bu ASPI&#39;yi yapmakkültür kaplarından oranı ESC medya, Ca2 + / Mg2 + içermeyen Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile HESC yıkama, 37 ° C /% 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde dispaz (uygun miktarlar için bkz Tablo 2) ve yerde ekleyin. MEFS kaldırmak için HBSS ile 2 kez - 3-5 dk inkübasyonu takiben, yavaşça aspire Dispase ve 1 yıkayın. Yavaşça kültür çanak yüzeyinden koloniler kazımak, HESC medya (Tablo 3) ve bir hücre kazıyıcı kullanarak veya 5 ml pipet ekleyin. </li><li> 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içine kültürü çanak süspansiyon içinde koloni parçalarını toplamak. HESC medya ve 15 ml tüp transferi ile durulayın kültür çanak. Tek hücreler veya küçük parçalar halinde öbekler kırmak için dikkatli olun. </li><li> Koloni fragmanları pelet haline getirmek için 160 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Aspire süpernatant. Koloni fragmanı pelet gevşetmek için parmak ile 15 ml tüp alt dokunun. Bölünmüş oranına göre HESC medyada yavaşça tekrar süspansiyon koloni fragmanları (normall4 ve 1: 8 uygun) ya 1 arasındaki oranı bölünmüş. Verimliliğini şarjı etkiler, bu gibi tek hücreler veya küçük parçalar halinde kümeleri işlemek için değil, son derece dikkatli olun. </li><li> MEF&#39;ler HBSS ile 1x yıkayın üzerine HESC fragmanlarını replating önce. Yavaş yavaş yemekleri MEF&#39;ler ile ön kaplama HESC ortam içinde HESC fragmanlarını ihtiva eden hücre süspansiyonunun uygun bir miktarı (bakınız Tablo 2) ekleyin. </li><li> Inkübatör rafa kültür yemekleri yerleştirin ve eşit koloni parçaları dağıtmak için iki ileri ve geri ve yan yavaş hareket. </li><li> Günlük HESC ortamı değiştirin. </li><li> MEF&#39;ler (MEF-CM) şartlandırılmış ortam hazırlamak için yıkamak 75 cm 2 şişe MEF&#39;ler HBSS 1 x ile ön kaplama. HESC ortam ekleyin. 24 saat sonra, ortamla ve taze hESC medya ile değiştirin toplamak. 12 gün en fazla günlük tekrarlayın. , Gerekli olana kadar, 4 ° C&#39;de, MEF-CM saklayın. </li></ol> Transfeksiyon İnsan EKH 2. Hazırlık <ol><li> HESC büyümesini dikkate, günde bir mikroskop altında. Koloniler% 40-50 konfluent, plaka cm 2 başına 2.0 x 10 5 MEF&#39;ler 3 x 100 mm yemekleri olunca. </li><li> Koloniler 60 olunca -% 70 birleşik transfekte hazırdır. Farklı koloniler veya koloni çekirdekleri çıkartarak &#39;damat kolonileri. Not: Biz daha yüksek transfeksiyonunu inanıyoruz ve hücreler log fazı büyüme olduğunda hedefleme verimleri meydana gelince, HESC ≥ 70% confluency ulaşmadan elektroporasyon yapılan önerilmektedir. </li><li> HBSS HESC koloniler yıkayın ve Accutase ekleyin. Not: Bu ROCK inhibitörü ile önceden tedavi HESC gerekli değildir Y-27632 adım 2.7 sırasında Y-27632 ile kuluçkaya olduğu gibi yeterli engelleme meydana gelecek </li><li> 37 ° C / 5, bir mikroskop altında bakıldığında, koloniler tek hücreler hale kadar% CO2 &#39;de 20 dakika için 10 - inkübe edin. 1 ml&#39;lik bir pipet ile öğütmek hücreleri. </li><li> 40 mikron hücre straine kullanarak 15 ml konik tüp içine HESC medya ve filtre eklehücre kümeleri kaldırmak için r. </li><li> 5 dakika boyunca 160 x g&#39;de santrifüjleyin. Taze hESC medya yeniden süspanse hücre pelet ve kalan Accutase kaldırmak için çözüm tekrarlayın. </li><li> 10 uM Y-27632 ve 100 mm tabak için toplam hücre süspansiyonu transfer jelatin ile kaplı önceden ihtiva eden HESC ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> 30 dakika içinde en az 37 ° C /% 5 CO2 ile inkübe edin. </li><li> Bu süre zarfında MEF&#39;ler jelatin kaplı çanak uyacaktır. Yeni bir 15 ml&#39;lik santrifüj tüpüne 1 mi pipet kullanılarak yapışmayan HESC toplamak ve bir hemositometre kullanılarak hücre yoğunluğu belirlemek. </li></ol> HESC 3. Elektroporasyon <ol><li> 0.22 um bir filtre ve ekleme 10 ng / ml yeniden birleştirici insana ait fibroblast büyüme faktörü 2 (rhFGF2) ile filtre CM-MEF ortam. </li><li> 5 dakika boyunca 160 xg&#39;de yeni bir 15 ml konik tüp ve santrifüj bölümünde 2,9 7,5 x 106 HESC aktarın. </li><li> Üstel Elektronik endüstri için programı seçiniz: elektrogözenekleme kurmak bu süre zarfında250 V, Sığa: ctroporation ve aşağıdaki parametreler, Gerilim set 500 uF ve Direnç: ∞-. </li><li> Süpernatan aspire ve buz soğukluğunda, 0.22 um&#39;den filtre edildi HBSS 0.8 ml hücre pelet yeniden askıya. Steril bir 0.4 cm elektroporasyon küvetine çözeltisini. </li><li> TV-hPITX3-ileri hedefleme yapı (30 mg DNA) ekleyin ve 200 ul pipet ile hafifçe karıştırın. 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bu süre boyunca PITX3 ZFN mRNA&#39;nın tek numuneyi çıkarın ve buz üzerinde defrost. Elektroporasyon küvetine DNA / hücre karışımına aktarımı ZFN mRNA 7.5 ul buzu zaman. 200 ul pipet ile hafifçe karıştırın. Not: hedefleniyor odağı verimlilik hedefiyle katkıda ana faktör. Böyle PITX3 gibi sessiz genler, EKH ifade değil genler, zor loci kodlama geleneksel homolog rekombinasyon 6 kullanarak hedef. Böylece, bu protokol özel bir DNA çift iplik b uyarılması için insan PITX3 lokusu için tasarlanmış ZFNs kullanmaktadırreak. </li><li> Elektroporatörü üzerindeki ekrandaki talimatları izleyerek electroporate. </li><li> 200 ul pipet, 10 ml HESC ortamı içeren 15 ml tüp elektroporasyon küvetine içindekileri aktarmak kullanma. HESC ortam 200 ul bir 15 ml tüp her zaman ve transferi ile iki kez küvet yıkayın. Orada olacak &quot;mukoza gibi&quot; enkaz olumsuz hücre yaşamını etkileyecek lizlenmiş hücrelerden DNA ve protein içeren. Bu artığın ayrılması için 5 dakika boyunca 160 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı aspire ve yavaşça gevşetin hücre pelet dokunun. 10 uM Y-27632 içeren MEF-CM desteklenmiş 30 ml yeniden askıya ve MEF&#39;ler ile preplated 3 x 100 mm yemekleri üzerine Replate. </li><li> Günlük medya değiştirin. 2. günde,-Y-27632 çekilebilir ve hücreler HESC ortam sadece büyütülür. </li><li> 2-3 gün sonra,% 50-70 konfluent HESC olmalıdır. Bu noktada antibiyotik seçim (örneğin, 0.5 ug / ml puromisin) başlar. </li><li> Sel koruyungünlük taze HESC / puromycin medya ekleyerek ection. ~ 7 gün sonra küçük koloniler görünür olmalıdır. Antibiyotiğe dirençli MEF&#39;ler alışık değilseniz, MEF&#39;ler cm 2 başına ek 1.0 x 10 4 hücreler ekleyerek takviye edilebilir. </li></ol> 4. Toplama Transgenik HESC Klonlar <ol><li> Yaklaşık 14 - (koloniler ~ 1 mm çapa ulaşmış) seçimi 21 gün sonra genişleme ve tarama için plakaları hazırlamak. 5 saat arasında, en az 4 ° C&#39;de Matrigel veya Geltrex bir kısım buz çözme başlayın. Üreticinin talimatlarına uygun olarak seyreltilir ve 3 x 96-çukurlu levhaların her çukuruna 75 ul ekle. Cm2 başına 2.0 x 10 hücre 4 MEFS kaplama ile 3 x 48 oyuklu plakalar hazırlamak. 37 ° C /% 5 CO2 ile iki tabak göre O / N inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, bir örgü kesilerek 2 ml&#39;lik bir pipet ucunda, bir 21 G iğne kullanılarak 16-25 parçaya kolonileri keser. </li><li> Aspire 96 oyuklu plakalar Matrigel ve supplem ile değiştirintasyonlu CM-MEF medya. 48 oyuklu plakalar 1 HBSS x ve HESC ortam eklemek yıkayın MEF&#39;ler. </li><li> 200 ul bir pipet kullanarak yavaşça yayılması için bir 48 oyuklu bir plakaya kesilmiştir koloninin 1/3 aktarın. Takviye edilmiş CM-MEF ortamı ihtiva eden ilgili bir 96-yuvalı plaka içine kesilmiş koloninin diğer 2/3 aktarın. </li><li> Her gün ortam değiştirilerek iki tabak muhafaza (MEFS ihtiva eden 48 oyuklu plakalar boyunca 96 oyuklu Matrigel kaplı plakalar ve HESC ortam CM-MEF ortamı eklenmiş ve her ikisi de 0.5 ug / ml puromisin ile desteklenmiş). </li><li> 96 oyuklu plakalar,% 100 konfluent ve daha sonra ilk olarak PCR yoluyla taranması kadar aç. </li></ol> 5. Tarama ve pozitif klonların Genişletilmesi <ol><li> Genomik DNA (11 dayanan bir yöntem) hazırlamak tersini plakalar tüm ortamları kaldırmak için, sonra kağıt havlu üzerine kurulayın. </li><li> RT, PBS (100 ul / oyuk her bir yıkama) Aşama 5.1 olarak invert ve blot, her oyuk iki kez yıkayın. -80 ° C f Yeri plakalarya da 1-2 saat hücre lizizi yardımcı olmak için (levhalar böyle süresiz olarak saklanabilir). </li><li> Hücreler sarkosil Lizis Tampon olmak C -80 ° C&#39;de iken (bakınız Tablo 4) (50 ul / kuyucuk). Her kuyuya 5 sonra oda sıcaklığında dakika pipet lizis tamponu için hücreleri, sıcak tabaklar lyse. Nem oluşturmak için, nemli kağıt havlu içeren kapatılabilir bir kap içinde bant, yer her plakanın kenarlarını kapatırlar ve 60 ° C sıcaklıkta O / N inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, -20 ° C mutlak etanol içinde, 10 ml 5M NaCl, 150 ul, iyice karıştırılmakta ve her bir göze 100 ul (Not: NaCI ilave edildiğinde etanol bulutlanmayarak mi?). Dokunun levhalar hafifçe karıştırın (Pipeti yapmak) ve oda sıcaklığında 30 dakika en az bırakmak. Bu süre zarfında çözelti, temiz bir sayfa ve DNA neden olacaktır. </li><li> Daha sonra her bir göze% 70 etanol içinde 150 ul 5.1 adım olarak çözeltisini çıkarın. Yavaşça plaka ters çevirin ve daha önce olduğu gibi kurulayın. Bu adımı bir başka 2x tekrarlayın. Not: Çökelen DNA, doğal Adhedoku kültürü plastik çözünürlük bu yıkama adımları sırasında yerinden olmaz.) </li><li> Son yıkamadan sonra, en yüksek hızda kısa bir süre için santrifüj plakalar en az 30 dakika boyunca, oda sıcaklığında her bir göze daha sonra kurumaya tabanı (veya 37 ° C), DNA&#39;nın konsantre edilmesi için. </li><li> Ekle 40 - 50 ul T0.1E (pH 8.0) ile 1 saat boyunca 65 ° C &#39;de ve her bir göze bir yer plakalarına ya da TE (pH 8.0) (Tablo 5) ya da 4 ° de CO / K PCR kullanılarak yapılmıştır. Yavaşça, plakanın kenarlarına hafifçe vurarak DNA yeniden süspanse edin. Yeniden süspansiyon haline getirildi, DNA / 10 | il PCR reaksiyonu, 1-2 ul kullanın. </li><li> HPITX3 L kol gen Uzun Şablon PCR Sistemi genişletin kullanma. F ve hPITX3 L kol GFP R astarlar 58 ° C tavlama, 45 saniye uzatma, 35 döngü klonların ilk taramasını gerçekleştirmek. </li><li> Bir% 1 agaroz jeli içinde Hyperladder 1kb ile Electrophorese numuneler, 45 dakika boyunca 100 V&#39;ta GelRed ve UV ışıması suretiyle, pozitif klonları tespit içeren. </li><li> Expa genomik DNA&#39;sını sindirerek PCR pozitif klonların doğrulamaSouthern lekeleme için, bir vektör homoloji kollarının Hindlll ve hibritleşen sondalar 5 &#39;ve 3&#39; ile birlikte nded klon (aşağıya bakınız) (daha önce tarif edildiği gibi, 1). Problar primer çiftleri hPITX3 5 &#39;prob F, ve Rı ve hPITX3 3&#39; probu F ve R, EcoRI ile sindirilmiş ve genel bir klonlama vektörüne lige kullanılarak PCR ile üretilmiştir. </li><li> Pozitif klonların sayısına bağlı olarak, MEF&#39;ler (cm2 başına 2.0 x 10 hücre 4) ile ön kaplama ile, 6 gözlü bir plakanın 2 kuyu hazırlar. </li><li> Ertesi gün, 1 saat arasında, en az 10 uM-Y-27632 ile, 48 oyuklu bir plaka içerisinde, pozitif klonları ön muamele. </li><li> HBSS pozitif klonlar yıkayın ve Accutase 300 ul ekleyin. </li><li> Koloniler tek hücreler işlendiğinde HESC ortam 1 ml ilave edilir ve 15 ml&#39;lik bir tüp içine toplar. </li><li> Günlük medya değiştirin. 2. günde,-Y-27632 çekilebilir ve hücreler HESC ortamında yetiştirildi. </li><li> % 80 birleşmiş, alt kültür ve Colo kalanını dondurmak - koloniler 70 olduğundaNY fragmanları. </li></ol>

<ol><li>Nefzger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lmx1a+Allows+Context-Specific+Isolation+of+Progenitors+of+GABAergic+or+Dopaminergic+Neurons+During+Neural+Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).</li>
<li>Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+periods+of+neural+induction+and+propagation+of+embryonic+stem+cell-derived+neural+progenitors+with+EGF+and+FGF2+enhances+Lmx1a+expression+and+neurogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential.</a> Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).</li>
<li>Collin, J., Lako, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+putting+a+finger+on+stem+cell+biology%3A+zinc+finger+nuclease-driven+targeted+genetic+editing+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).</li>
<li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+prospects%3A+zinc-finger+nucleases+as+gene+therapy+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents.</a> Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).</li>
<li>Urnov, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iESCs+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li>
<li>Lombardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+editing+in+human+stem+cells+using+zinc+finger+nucleases+and+integrase-defective+lentiviral+vector+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery.</a> Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).</li>
<li>Boch, J., Bonas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthomonas+AvrBs3+family-type+III+effectors%3A+discovery+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function.</a> Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+embryonic+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+mouse+strain+expressing+four+drug-selectable+marker+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes.</a> Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).</li>
<li>Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+DNA+microextraction%3A+a+method+to+screen+numerous+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples.</a> Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).</li>
<li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).</li>
<li>Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli1+is+an+inducing+factor+in+generating+floor+plate+progenitor+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).</li>
<li>Smidt, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homeodomain+gene+Ptx3+has+highly+restricted+brain+expression+in+mesencephalic+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Raportör hücre çizgilerinin üretimi, etiket görselleştirmek ve hESC türetilmiş bir heterojen popülasyonda ilgi konusu hücrelerin izole edilmesi için güçlü bir araç sunar. Bununla birlikte, geleneksel homolog rekombinasyon yoluyla hedef geni insan EKH 3 için son derece randımansız olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokolde ZFNs ile birlikte yaygın olarak kullanılan hedefleme vektörü kullanılarak hESC, ekson PITX3 lokusunun bir RP içine verilmesi için nispeten basit bir tekniği açıklar. Bizim ellerde gen hed...

Mevcut embriyonik kök hücre (ESC) diferansiyasyon protokolleri, özellikle spesifik sinir hücresi fenotipleri türetme ile ilgili olarak, heterojen hücre popülasyonlarının neden olur. Kültürler, arzu edilen hücresel fenotipi, diğer nöronal içeren rağmen bunlar, nöronal olmayan ve BM-farklılaşmış hücre türleri genellikle 1 bulunmaktadır. Bu özellikler ESC uygulama hücre replasman tedavisinde kullanım için ve in vitro hastalık modelleme hücre kaynaklardan elde edilen sınırlar. Genetik raportör hücre çizgileri, görselleştirmek izlemek ve ilgili hücreleri izole etmek için bir araç sunar, raportör protein (RP) ifadesi, endojen ekspresyonu üretir şartıyla. Bir gen kodlama bölgesinin hemen üst promoterlerin kullanımı ham genetik muhabir elde etmek için kullanılabilir, ancak bu gibi yapılar, endojen gen ekspresyonunu kontrol hassas düzenleyici elemanları yoksundur. Bunun aksine, homolog rekombinasyon sunarfırsat RP yüksek sadakat ifade sağlamak. Geçmişte, ilgi konusu özel konumlara homolog yeniden birleştirme için tasarlanmış hedefleme vektörleri DNA aktarımından 1,2 için bir araç olarak, elektroporasyon kullanılarak fare ESCs (mESCs) olarak RPs hedeflemek üzere kullanılmıştır. Bununla birlikte, homolog rekombinasyon yoluyla, geleneksel raportör hücre çizgilerinin nesil insan EKH (HESC) son derece yetersiz olduğu ve bu nedenle (3 gözden geçirilmiştir) durumlarda bir avuç belgelenmiştir. Çinko-parmak nükleazlar (ZFNs) gibi yaygın olarak bilinen siteye spesifik çinko-parmak motifleri, bir Fok I nükleaz füzyonunu ihtiva eden bir yapılandırılmış, kimerik proteini kullanarak, DNA çift iplikli sonları önceden belirlenmiş genomik lokusları sokulabilir. DNA çift iplik arası her iki taraf için homolojisi olan bir DNA vektörü eklendiğinde, genomik DNA sitesi, donör sekansının bir girişe izin verir, homolog rekombinasyon ile tamir edilebilir. Bu teknik kullanışlı f kanıtlanmıştırveya insan primer hücre 4,5 ve 6,7 HESC hem de genomik düzenleme. Son çalışmalar kullanmıştır transkripsiyon faaliyete geçirme gibi efektör nükleazlar (TALENS), bitki kopyalama faktörleri ile ikinci site-spesifik nükleazlara 9 tasarımında yardımcı olmak için, 8 patojenleri. Aşağıdaki protokolde, insan hipofiz homeoboks 3 (PITX3) lokusu için ZFNs birlikte homolog hedefleme vektörü ihtiva eden bir 6 EGFP elektroporasyon ile HESC raportör hücre hattının üretilmesini göstermektedir. 2-3 hafta boyunca antibiyotik seçimi takiben, doğru entegre DNA ile HESC elle aldı genişletilmiş ve PCR ile başlangıçta ekranlı ve daha sonra Southern lekeleme tarafından onaylanmış olabilir.

<table><tbody><tr><td>Fare Embriyonik Fibroblastları (DR4)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6004G</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, Kalsiyum yok, Magnezyum yok, Fenol Kırmızısı (HBSS)</td> <td>yokYaşam Teknolojileri</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kazıyıcı</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Axon Medchem</td><td>Axon 1683</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci - 40 &mu; m</td><td>BD Biyobilimler</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>33 mm - 0.22 & mu; m filtre</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>rhFGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporatör</td><td>BioRad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>0,4 cm elektroporasyon küveti</td><td>BioRad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>İnsan TV-hPITX3 ileri hedefleme yapısı</td><td>Addgene</td><td>31942</td><td></td></tr><tr><td>ZFN Kiti; İnsan PITX3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CKOZFN1050-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, Nitelikli, Isı ile Etkisizleştirilmiş, ABD Menşeli (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Kalem/Strep</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortam/Besin Karışımı F-12 (DMEM/F12)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt Serum Replasmanı (KSR)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler&nbsp; (NEAA)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-merkaptoetanol</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodyum tuzu çözeltisi (Sarcosyl) (% 30)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61747</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e9884?lang=en&amp; region=US">E9884</a></td><td></td></tr><tr><td>Trizma Hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K çözeltisi (20 mg/ml)</td><td>Bioline Australia</td><td>BIO-37084</td><td></td></tr><tr><td>Uzun Şablonlu PCR Sistemini Genişletin</td><td>Roche Avustralya</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>hPITX3 L kol gen. F (astar): 5' TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3'</td><td>GeneWorks, Avustralya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hPITX3 L kol GFP R (astar): 5' ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3'</td><td>GeneWorks, Avustralya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyperLadder 1 kb&nbsp;</td><td>Bioline Avustralya</td><td>BIO-33025</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Jomar Bioscience, Avustralya</td><td>41003</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan embriyonik kök hücreleri hedefleme Çinko parmak nükleazlar geliştirilmiş gen

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

Mevcut insan embriyonik kök hücre (ESC) farklılaşma protokolleri ile bir büyük sınırlama heterojen hücre popülasyonlarının nesil. Bu kültürler, ilgi hücreleri içerir, fakat aynı zamanda farklılaşmamış EKH, nöral olmayan türevleri ve diğer alt-tipler ile nöronal kirlenir. Bu, in vitro olarak ve bu ilaç keşfi ya da hücre replasman tedavisi için, in vitro modelleme gibi in vivo uygulamalarda, kullanımlarını kısıtlar. Bu aşabilmesi için, görselleştirmek parça ve ilgi hücreleri izole etmek için bir araç sunuyoruz muhabiri hücre hatları, mühendislik olabilir. Geleneksel homolog rekombinasyon son derece verimsiz cihaz aracılığıyla Ancak, insan embriyonik kök hücreleri bunu başarmak için. Bu protokol ile birlikte, Hipofiz homeobox insan embriyonik kök hücreleri 3 (PITX3) lokus site-spesifik çift iplikli DNA kopmalarını tanıtmak özel olarak tasarlanmış, çinko-parmak nükleazlar kullanılarak hedeflenmesi tarifPITX3 - EGFP -spesifik DNA donör vektörü. PITX3 raportör hücre çizgisinin üretilmesi sonrasında, daha sonra, in vitro olarak, Parkinson hastalığı, modelleme ya da hücre tedavisi gibi değiştirme çalışmalarında kullanılmak için yayınlanmış protokoller kullanılarak ayırt edilebilir.

PITX3 birlikte özel olarak tasarlanmış PITX3 çinko-parmak çiftinin eş elektroporasyon izlenerek - EGFP özgü bir DNA vektörü verici ve sonraki puromisin seçimi, pozitif HESC genomik klonları başlangıçta PCR taraması (Şekil 1) ile tespit edilmiştir. Bu PCR ile pozitif klonların 5 've 3' özgü problar Güney benek hibridizasyonu,% 19 oranında bir verim ile, PITX3 konumunda (Şekil 2) 1. ekson doğru hedeflemeyi doğruladı. Şekil 3'te gösteril...

Muhabir hücre çizgileri, görselleştirmek etiket ve heterojen popülasyonlar ilgi hücreleri izole etmek için bir araç sunmaktadır. Bununla birlikte, hedef gen, insan embriyonik kök hücreleri alışılmış homolog rekombinasyon kullanılarak son derece verimsizdir. Bu yazıda, çinko-parmak nukleaz gelişmiş homolog rekombinasyon kullanarak EGFP ile CNS Ortabeyin özel transkripsiyon faktörü PITX3 odağı hedefleme açıklar.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Hedefleme Çinko parmak Nükleazlar Geliştirilmiş Gen

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Bu protokolün genel amacı, bunu yapmak için özel olarak tasarlanmış çinko parmak nükleazları kullanarak insan embriyonik kök hücrelerinde ilgilenilen lokuslara transgenleri verimli bir şekilde hedeflemektir. İnsan embriyonik kök hücreleri veya HSC'ler, elektroporasyon için yeterli materyal üretmek üzere genişletilir, daha sonra tek hücreler elde etmek için sindirilir. Daha sonra, iki özel tasarım çinko parmak nükleazını kodlayan mRNA, doğrusallaştırılmış EGFP donör dizisi ile HSC'lere birlikte elektropore edilir ve hücreler daha sonra taze fare embriyonik, fibroblastlar veya MEF'ler üzerine kaplanır.Elektroporasyonlu çinko parmak nükleazları Hücrelerdeki çukur X üç lokusunun ilk ekzonuna çift iplikli bir kırılma sokun. Daha sonra, DNA çift iplikçik Fren bölgesi dizisine homoloji ile hedefleme kolları ile çevrili olan EFGP donör dizisi, 14 ila 21 gün sonra hücre bölünmesi sırasında dahil edilir. Bireysel bir HESC kolonisinin üçte biri, matrigel kaplı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna geçirilir ve diğer üçte ikisi, taze ME Fs içeren 48 oyuklu bir plakanın karşılık gelen bir oyuğuna aktarılır.96 oyuklu plakalardaki hücreler eş akıcılığına ulaştığında, PCR ile donör dizisinin dahi

zinc-finger-nuclease-enhanced-gene-targeting-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Genetik modifikasyon alanında son gelişmelere rağmen, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) aktarılmasının kaprisli bir süreç olmaya devam etmektedir. Bildiğimiz kadarıyla, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) transfekte etmek için sistematik ve etkili bir yöntem bildirilmemiştir. Burada, biz verimli transfekte ve insan iPSCs nucleofect sağlam protokoller açıklanmaktadır.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücreler transfekte ve Nucleofecting

CompoZr Özel Çinko-Parmak Nükleaz (ZFN) Hizmet kullanıcı tarafından tanımlanan herhangi bir odağı herhangi bir organizma ya da hücre hattı hassas genom düzenlenmesini sağlar. Bu makale CompoZr Özel ZFN Hizmet tasarım, imalat, onaylanması ve uygulanması için süreci anlatılmaktadır.

CompoZr Özel Çinko Parmak Nükleazlar ile Genom Düzenleme (ZFNs)

Bu video, insan pluripotent kök hücrelerinde (hPSC'ler) çinko parmak nükleaz tabanlı genom düzenleme tekniğini göstermektedir. hPSC'ler potansiyel olarak çeşitli hücre tiplerine ayrılabildiğinden, bu teknoloji hastaya özgü bir şekilde in vitro patolojik ve farmakolojik çalışmalar için yararlıdır.

Çinko Parmak Nükleaz Tabanlı Genom Düzenleme: İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde Çift Sarmallı Homoloji Bağımlı Onarım Mekanizması ile Genomu Değiştirme Tekniği

Örneğin çinko parmak nükleazlara (ZFNs) ve transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlara (TALENS) olarak tasarımcı nükleazlar homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ile homolog yeniden birleştirmeye (HR) yolaklar tetikleyerek fare preimplantasyon embriyoların genomunu değiştirmek için kullanılabilir. Bu gelişmeler kesin genetik değişiklikler farelerde hızlı üretimini sağlar.

Tasarımcı nükleazlar kullanılması Fare Genom Mühendisliği

Güvenli liman AAVS1 lokusunda TALEN aracılı gen düzenleme, insan iPSC'lerinde yüksek verimli transgen ilavesi sağlar. Bu protokol, raportör hatları oluşturmak için bir GFP geninin hedeflenen entegrasyonunu sağlamak için TALEN ve donör vektör iletimi için iPSC'lerin hazırlanması, iPSC'lerin transfekte edilmesi ve iPSC klonlarının seçilmesi ve izole edilmesi prosedürlerini açıklar.

Transfeksiyon, Seçim ve İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Colony-toplama AAVS1 Safe Harbor içine GFP geninin ile TALEN-hedefli

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) genom düzenlemesi hızlı ve verimli bir şekilde yapılabilir. Burada, EGFP'yi eksprese etmek ve antibiyotik direncini ortaya çıkarmak için AAVS1 güvenli liman lokusunun düzenlenmesiyle örneklendiği gibi, hPSC'leri genetik olarak tasarlamak için sağlam bir deneysel prosedür sunulmaktadır.

Genom düzenlenmiş İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatları oluşturulması: İzolasyon hedefleyen Gönderen

Burada daha önce tarif edilen sistemler geliştirir insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) arasında AAVS1 lokusunda RMCE göre hızlı ve etkili bir gen düzenleme yöntemi sunulmaktadır. Bu tekniği kullanarak, izogenik hatları hızlı ve güvenilir hPSCs ile transgenesis aracılı araştırma kolaylaştıran, uygun karşılaştırmalı çalışmalar için oluşturulabilir.

içinde Recombinase aracılı Kaset Borsası tarafından Rekombinant insan pluripotent kök hücreleri hızlı ve verimli Nesil<em&gt; AAVS1</em&gt; Odağı

Proteinler genellikle farklı hücresel fonksiyonları sarf edebilirsiniz birden çok etki içerirler. Gen irtibat kutusu kapağı (KO) bu işlevsel çeşitliliği dikkate almaz. Burada, çeşitli işlevsel etki alanları veya bir proteinin varyantlarının moleküler diseksiyon sağlar KO embriyonik kök hücrelerin bir rekombinasyon aracılı kaset değişimi (RMCE) tabanlı bir yapı-işlev yaklaşım sunulmuştur.

Recombinase aracılı Kaset Değişimi Kullanarak Fare Embriyonik Kök Hücre yapı-fonksiyon Çalışmaları

Burada, piggyBac bazlı bir donör plazmid ve Cas9 nickaz mutantı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinde dikişsiz gen düzenleme için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunun ekzon 8'ine iki nokta mutasyonu getirildi.

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

Burada, embriyonik kök hücreler kullanarak, özellikle büyük DNA knock-in (KI) için genetiği değiştirilmiş fare modelleri geliştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, CRISPR / Cas9 genom düzenlemesi kullanılarak ayarlanır ve geleneksel homolog rekombinasyon aracılı doğrusallaştırılmış DNA hedefleme yöntemine kıyasla önemli ölçüde iyileştirilmiş KI verimliliği ile sonuçlanır.

Genle Manipüle Edilmiş Fare Modelleri Geliştirmek için Embriyonik Kök Hücrelerde CRISPR / Cas9 Aracılı Yüksek Verimli Gen Hedefleme

Sunulan yöntem, yüksek verimli bir lentiviral aracılı gen dağıtım sistemi kullanarak L2HGDH genini hedefleyen sgRNA'ları kararlı bir şekilde ifade eden insan embriyonik kök hücre (hESC) hattı H9'da CRISPR aracılı bir gen nakavtının oluşturulmasını açıklar.

Besleyicisiz Koşullar Altında Kültürlenen İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Delesyonuna

Öğrenin, insan embriyonik kök hücrelerinde çinko parmak nükleazlar kullanarak PITX3 lokusuna transgen hedefleme yöntemini. Bu teknik, santral sinir sistemi gelişimi ve gen fonksiyonu çalışmalarında yüksek verimlilik sağlar.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Hedefleme Çinko parmak Nükleazlar Geliştirilmiş Gen

Daha fazla video keşfet