Name: İlköğretim Bağırsak organoid Kültür Retrovirütik Enfeksiyon Bir Video Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-11T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Öğrenin bağırsak organoidlerinde retroviral transdüksiyon yöntemiyle fonksiyonel genetik çalışmalar yapmayı. Bu teknik, gen ifadesini GFP floresansı ile değerlendirerek in vitro ortamda güvenilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Koo BK ve Mustata RC Tıbbi Araştırma Konseyi (MRC) tarafından desteklenen Wellcome Trust ve Andersson-Rolf A Sir Henry Dale Bursu tarafından desteklenmektedir. Fink J Wellcome Trust 4 yıllık Doktora Programı tarafından desteklenmektedir.

Aşağıdaki protokole kullanılan farelerin belirli bir patojenden bağımsız koşullarda tutuldu ve tüm işlemler Birleşik Krallık Ofis düzenlemelerine uygun olarak yapıldı. 1. Hazırlık <ol><li> Kullanılmadan önce 1 saat süreyle ortam hazırlama en az 10 dakika kullanılmadan önce 37 ° C su banyosu içinde ön ısıtma işlemi (Tablo 1 ve Malzeme Listesi daha fazla bilgi için bkz.) </li></ol> 2. Kültürleme Küçük Bağırsak (SI) Organoids NOT: Aksi belirtilmedikçe, tüm inkübasyonlar nemli bir inkübatör içinde 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ile gerçekleştirilir. Canlı hücreler ile temas eden aletler ve tepkime maddeleri steril olması gerekmektedir. Ön ısınma o bodrum matris (Matrıgel veya BME) Yayımlarken dışarı yayılmasını engeller damla gibi doku kültürü plaka önemlidir. Ayrıca, taban matris her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. -20 ° C ve çözülme Mağazasıkullanımdan önce buz üzerinde. <ol><li> Kriptler Yalıtımlı <ol><li> Ince bağırsak izolasyonu için daha sonra, ulusal kurallar ve düzenlemelere göre fare kurban sırtında hayvan koyun ve% 70 etanol ile karın yıkayın. Sternum kasıktan bir uzunlamasına orta hat kesi gerçekleştirin. İlk olarak, deri ve deri altı doku daha sonra kesilir. Mideye çekumdan ince bağırsağı çıkarın. Duodenum, jejunum ve ileumdan izole kript organoid kültürü için de kullanılabilir. </li><li> Kalsiyum ya da magnezyum (PBS0) olmaksızın önceden soğutulmuş fosfat tamponlu serum fizyolojik ile, izole edilen ince bağırsağı yıkayın. </li><li> 3-5 cm uzunluğunda parçalar halinde doku kesmek ve uzunlamasına açık kesmek için makas kullanın. Forseps kullanarak doku yayıldı. </li><li> Lamel kullanarak villus kazımak. Dikkat, çok fazla kuvvet gözyaşı doku neden olur ve aşağıdaki adımları izleyerek kriptalarının verimini azaltacaktır. </li><li> Önceden soğutulmuş bir PBS0 usin içeren 50 ml&#39;lik bir tüpe transfer dokug forseps. Kuvvetli çalkalama ile doku parçaları yıkayıp PBS0 değiştirin. 2-3 x tekrarlayın veya PBS0 az bulutlu dönene kadar. </li><li> Bir tüp silindiri üzerindeki 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 1 mM etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) ile PBS0 30 ml içeren 50 ml&#39;lik bir tüp içinde doku inkübe edin. </li><li> Kuvvetlice çalkalanır tüp ve 5 mM EDTA ile PBS0 30 ml ihtiva eden bir 50 ml tüp doku aktarın. (Daha önce doku ihtiva etmektedir), 1 mM EDTA çözeltisi ve kript villi bir karışımını içerecektir. Genellikle villi yüksek bir oranda içerir, Bu fraksiyon organoids bir tohumlama için uygun değildir. </li><li> Bir tüp silindiri üzerindeki 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca doku daha inkübe edin. </li><li> Kuvvetlice tüp sarsıntı ve temiz bir 50 ml tüp içinde çözeltisinin toplanması. Kript varlığını doğrulamak ve ışık mikroskopisi ile 50 ul crypts sayarak, örneğin sayısını tahmin ediyoruz. 50-100 kriptaları almak ve 1.5 ml t aktarmak için gerekli hacmi hesaplayınube. </li><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de Spin. , Supernatant Önceden ısıtılmış, 24 oyuklu bir plaka içerisinde temel matrisin 50 ul pelet ve tohum yeniden süspanse edin. Matris taban polimerize kadar 5-15 dakika boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde inkübe edin. </li><li> 500 ul ENR ortamı ile Yerleşimi (bakınız Tablo 1). Küçük, yuvarlak bir şekil gösterir kistik organoids tohumlama sonra filizlenen ve yapıları 2-3 gün sonra yaklaşık 24 saat görünür hale gelir. Her 3 günde bir, taze ENR medya değiştirin. </li><li> Geçiş 7 günde kültürler organoid. </li></ol></li><li> Pasajlanması ve bakımı Organoids <ol><li> Her 3 gün ve geçiş 1 medyayı tazeleyerek organoids koruyun: lümen ölü hücreler, yaklaşık her 7 gün ile dolu olur 5: 3 veya 1. </li><li> 1 ml pipetman ucu kullanarak ortamı ile bodrum matris kubbeyi kırmak ve 1.5 ml tüp kuyudan aktarın. </li><li> Mekanik pipetleme ile a organoids ayırmakpproximately 50x cezası (örneğin, 200 ul) ucu kullanarak. </li><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de Spin. </li><li> Süpernatantı atın ve bodrum matris 150-250 ul pelletini. Bir tohum 24-kaynaklı plaka (/ oyuk taban matris 50 ul) önceden ısıtılmış. Kaplamak için bir kez bodrum matris yukarı ve aşağı ucunun duvar pipet ekim önce. Pipet yavaşça yayılmasını önlemek için matris temel kuyunun orta kabarcıkları ve tohum önlemek için. Bu iyi merkezinde taban kalıbının bir kubbe almak için arzu edilir. </li><li> Matris taban polimerize kadar 5-15 dakika boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde inkübe edin. Kuyu başına 500 ul ENR medya ile Yerleşimi. </li></ol></li></ol> 3. Ön enfeksiyon SI Organoids Tedavisi NOT: Şekil 1, iletim prosedürü görüntülemektedir. <ol><li> ENRWntNic Exchange, ENR ortamı (Tablo 1 e bakınız) ve t organoids büyür3 gün veya bir kistik morfoloji kabul kadar en az onun orta. Nikotinamid (Nic) kültür etkinliğini iyileştirir Wnt3a kök ve Paneth hücrelerinin sayısını artırır. </li></ol> 4. Virüs Üretimi <ol><li> Platin-E hücreleri bir 150 mm tabak başına enfeksiyona gereklidir. Tohum yaklaşık puromycin (1 ug / ml) ve blasticidin (10 ug / ml) varlığında, 15-18 ml&#39;lik ortam (DMEM +% 10 FBS) ile 5 x 10 6 hücre. Bunlar% 70-80 ulaştığı zaman, 2-3 gün sonra hücrelerin transfekte. Puromisin olmayan ve de transfeksiyon önce blastisidin, DEM +% 10 FBS ile orta değiştirin. </li><li> Opti-MEM 1 ml içeren tüpler ayırmak için polietilenimin (PEI) retroviral DNA yapısının, 30 ug ve 240 ul ilave edin. Karıştırın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Iki çözeltinin havuzu ve 20-30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edin. Platin-E hücrelerinin ortamına tam karışımı ilave edilip dikkatle plat sallamake DNA PEI komplekslerinin eşit dağılımını sağlamak için. </li><li> Gece boyunca transfeksiyon karışımı ile platin-E hücreleri inkübe ve ortam ertesi gün yenileyin. 2 gün boyunca, yeni bir ortam içinde hücrelerin tutun. </li><li> , 50 ml&#39;lik bir Falcon tüpüne sadece orta toplamak 12-16 saat boyunca 4 ° C&#39;de 8000 x g&#39;de, bir 0.45 um filtre ve santrifüj geçirin. Süpernatantı atın ve İletimi orta 250 ul pelet (bakınız Tablo 1). </li></ol> 5. organoid Fragman hazırlanması <ol><li> Bir enfeksiyonu için bir 24 oyuklu plaka bir de gereklidir. 1 ml pipetman ucu kullanarak ortamı ile bodrum matris kubbeyi kırmak ve 1.5 ml tüp aktarın. </li><li> Ince bir ses ipucu (örneğin, 200 ul ipuçları) pipetle (30-50x) aracılığıyla organoids mekanik bozmaya kullanın. Çözelti bulanık hale ve herhangi bir tam organoids görünür olmalıdır. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüje, 900 x g<html> . </li><li> Süpernatantı atın ve hücre kültürü dereceli rekombinant proteaz (örneğin, TrypLE) 500 ul pelletini. 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. İnkübasyondan sonra fragmanının başına hücre sayısının sayılması, ışık mikroskopisi kullanılarak organoid fragmanlarının boyutunu kontrol edin. 5-10 hücreleri içeren fragmanlar idealdir. Parçalarının çoğunluğu hücrelerinin daha yüksek bir sayı içeriyorsa inkübasyon süresi, aynı anda 2 dakika süre ile arttırılabilir. </li><li> ENR ortamının 500 ul ekleyerek ayrışma süreci sonlandırmak. </li><li> Oda sıcaklığında santrifüj, 5 dakika boyunca 900 x g. Süpernatantı ve buz ya da 4 ° C pelet tutmak. </li></ol> 6. retroviral İletimi <ol><li> Bir 48-yuvalı plakanın bir çukuruna (bölüm 4.5 &#39;dan itibaren) retroviral çözeltisi 250 ul organoid parçaları birleştirin. 1 ml pipetman ucu kullanarak yavaş pipetle hafifçe karıştırın. </li><li> Parafilm plaka mühür. </li></ol>e &quot;&gt; 7. Spinoculation ve Kaplama <ol><li> 1 saat boyunca, 32 ° C, 600 x g&#39;de santrifüje plaka. Parafilm dikkatlice çıkarın ve 6 saat boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde inkübe edin. </li></ol> Enfekte organoid Fragments 8. Tohumculuk <ol><li> 5 dakika boyunca 900 xg&#39;de 1.5 ml tüp, ve spin kuyudan enfekte organoid fragmanlarını ve iletim ortamı aktarın. </li><li> Süpernatantı atın ve serin 5 dakika buz üzerinde pelet içeren tüp koymak. Bodrum matris 100 ul ekleyin ve yukarı ve aşağı yavaşça pipetleme pelletini. </li><li> Yeni 24-oyuklu bir plaka içerisinde 50 uL &#39;karışımı cell temel matris &quot;Tohum düşer. Matris taban katılaşıncaya kadar 5-15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Oyuklara polibren olmayan iletim ortamı ilave edin ve bir doku kültürü inkübatörü içinde inkübe edin. 2-3 gün medya değiştirin. </li></ol> 9. Seçim <ol><li> Başlangıç ​​seortama puromisin (1 ug / ml) ilave edilerek 2-3 gün sonra lection. </li><li> Fragmanlar oluşturan organoids puromycin (1 mcg / ml) ile desteklenmiş, ENR medya ile İletimi ortamı değiştirmek için ne zaman başlıyor. </li></ol> 10. post-enfeksiyon SI Organoids Tedavisi <ol><li> Kültür göre, &quot;Pasajlanması ve organoids muhafaza&quot; protokolü (bölüm 2.2.1) organoids transdük. 1-2 hafta sonra SI organoids yeni kurdukları yapıları geri kazanacak. </li><li> 1 uM&#39;lik bir konsantrasyonda çalışma 4-OH (4-OHT) eklenerek miRNA ya da DNA ekspresyonunu tomurcuklanan yapıların görünüşünü ardından. Bu aşama Addgene (pMSCV-loxP-DsRed-loxP-EGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxP-DsRed-loxP-3xHA-Puro-WPRE (32703) ve ikinci pMSCV, retroviral vektörler kullanılarak halinde geçerli olduğuna dikkat ediniz -Flip-puro-DsRed-GFP-miRNA (32704)) ve kre-ERT2 ifade organoids. </li></ol> Enfeksiyon ve Expr 11. Onayıİlgi geninin salgılamanın ardından / bastırılması <ol><li> Addgene (32702, 32703 ve 32704) için, retroviral vektörler kullanılarak Eğer iletim verimliliği DsRed ifade gözlemi ile teyid edilebilir. Koo ve arkadaşlarına 4 de örneklendiği gibi Buna ilaveten, ilgi konusu genin ifade veya bastırılması, GFP veya (gen demonte için) 3xHA (gen aşırı ifadesi için) epitopu ve QPCR kullanılarak, Western Blot ile teyit edilebilir. </li></ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+and+liver+physiology%22%5BJournal%5D)">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li>
<li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871(2013).</li>
<li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur. Yazarların beyan edilmiş herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

<html> Yüksek transdüksiyon verimi bazı yönleri kritik ulaşmak. Bir yuvarlak Kistik şeklinin benimsenmesi kadar bir ENRWntNic ortamı ile organoids öncesi bir tedavi yöntemidir. Bu kök hücrelerin sayısını ve transgenin kararlı entegrasyonu elde edilmesi, hem de transdüksiyon işlem boyunca SI organoids hayatta kalma oranının artması, dolayısıyla da olasılığını artırır. Diğer bir parametre spinoculation izleyen inkübasyon zamanı. Sırasıyla yoksul iletim verimliliği ve organoids kötü sağkalım, çok kısa veya çok uzun kuluçka sonuçları. Önemli ölçüde transduse organoids yüzdesini arttırdığı halde spinoculation aşaması esas teşkil etmemektedir. Son olarak, yüksek-titreli bir virüs başarılı iletimi için anahtardır. Bu paketleme hücre hattı ve virüs tipine bağlıdır. Platin-D hücre hattı ve murin stem hücre virüsü (MSCV) kombinasyonu, organoids transdüksiyonu için yeterince yüksek bir titreye ürettiği bulundu. ve_content &quot;&gt; Aşağıda başarılı iletimini elde etmek için yardımcı olabilir giderme için ipuçları. paketleme hücre hattının transfeksiyon düşük olup olmadığına, hücrelerin% 70-80 konflüansa ile kuluçkalama süresi bu olduğundan emin olmak Havuza alınan PEİ-DNA karışımı, 20-30 dakika arasındadır. iletimi aşamasında organoids hayatta kalması oldukça parçası boyutuna bağlıdır. çok uzun tripsinizasyon az 3 hücrelerinin oluştuğu parçalarının çoğunluğu neden olmakta ve böylece organoid hayatta kalma azaltır. bir başka etmen Wnt kıvamlandırılmış ortam aktivitesi, etkinliği çok düşük hayatta kalma oranları için 5 uM konsantrasyonda bir çalışma CHIR99021 ilavesi yoluyla da artırılması ise. CHIR99021 artmış Wnt sinyal ile sonuçlanır GSK3 inhibe eder. Ayrıca, Y&#39;nin-27362, burada önler organoids önce iletimine parçaları (1-10 hücresi içeren) için bozulur çünkü anoikis, organoid hayatta kalma artırmak için transdüksiyon ortama ilave edilir. gibi60, yukarıda belirtildiği gibi, spinoculation sonraki kuluçka süresi 6 saat geçmemelidir. Kötü iletim gözlenmesi halinde Son olarak, viral titresi ve retroviral vektör için ek parçanın boyut sınırını etkileyen belirtilen faktör dikkate alınmalıdır. Nakavt etkinliği miRNA son derece bağlıdır. Verimi, hedef gen ve miRNA kombinasyonu ile değiştiğinden dolayı, en iyi işlev yapanlardan belirlemek için bir ekran verim performans değerdir. Bu teknik alan organoid sisteminin epitel fenomeni ile sınırlandırılmıştır. Gelecekte sırasıyla, bağışıklık sistemi kaynaklı bileşenleri olan patojenlere ya da yeniden kurma ko-kültür ile enfeksiyon ya da bağışıklık aracılı hastalıklar çalışma mümkün olabilir. Ayrıca, retrovirüsler sadece nispeten küçük bir boyutta insertleri taşıyabilir. Sonuç olarak, doğal olarak ortaya çıkan düzenleyici bölgeleri hariç tutulması ve dolayısıyla transgen sentezleme bu taklit edilemezendojen gen. Yukarıda zikredildiği gibi, portatif verimi, hedef geni ve miRNA bağlıdır. Uygun Knockdown verimlilik ile hiçbir MiRNA bulunabilir Eğer o belirli hedef geni için tekniğin kullanımını sınırlayabilir. Teorik olarak, organoids hücre çizgileri için kullanılan tüm standart manipülasyonu teknikleri ile uyumludur. Retroviral transdüksiyon 4 rapor edilecek ilk yöntem oldu ve son zamanlarda BAC (bakteriyel yapay kromozom) -transgenesis 5 kullanılabilir hale gelmiştir. 2-3 haftalık bir toplam üretim süresi ile, paketleme hücre hattı viral plazmid transfeksiyonundan sonra, bir transgenik (TG) fare üretimi önemli ölçüde daha hızlıdır. Kök hücrelerin yanı sıra bağırsak epiteli tüm farklılaşmış hücre soyları içeren iken, in vivo crypt-villus mimarisini koruyarak, organoid kültür sistemi tg hayvan ve önceden kullanılan hücre kültürü arasındaki köprüdür. <psınıf = &quot;jove_content&quot;&gt; Burada açıklanan protokol, bir gain- yoluyla in vitro endodermal epitel fenotipik analizi gerçekleştirmek için bir yöntem ve fonksiyon testleri kaybı: içerir. Bu tg farelerde asgari ihtiyacı olan, yetişkin kök hücre biyolojisi fizyolojik ilgili soruları mümkün olur. Örneğin, koşullu nakavt farelerinin kuşak perinatal öldürücülüğü 6, yeni doğan mutantlardan türetilen organoids kullanılarak önlenebilir. Buna ek olarak, teknik, ilave, yok etme 7,8 gerçekleştirerek paralogues rolünü incelemek için, daha önce belirlenmiş knockout farelerden türetilen organoids uygulanabilir. Ince bağırsak organoids kurulmasından sonra, orijinal kültür protokol adaptasyon pankreas, karaciğer, kolon ve mide epiteliyalarının 9-11 kültürlenmesini izin verdi. Bundan başka, insan bağırsak organoids ve tümör organoids primer Aden, normal insan biyopsilerinden elde edilmiştiroma ve kolorektal kanser 10 biyopsisi. Viral enfeksiyon protokolü kolay organoids bu tür genişletilmiş ve insan kaynaklı dokularda fonksiyonel çalışmalar yapmak görülmemiş bir yol sağlar. Birlikte ele alındığında, küçük bağırsak organoids retroviral transdüksiyon kök hücre bakım, farklılaşma ve hücre kader kararı, yanı sıra hücre sinyalizasyon ve hücre-hücre etkileşimleri araştırmak için değerli bir kaynaktır.

Yüksek verim fonksiyonel genetik mevcut temel bilimleri ve tıp artırmak için, vücudun biyolojik anlayışı artırmak için gereklidir. Fare genetiği zaman alıcı ve masraflı hem de olmasına rağmen, in vivo gen fonksiyonlarını araştırmak için altın standart olmuştur. Daha az pahalı olmak için diğer yaygın bir seçim olan hücre çizgileri, daha yüksek bir randıman kapasitesine sahiptir. Ancak, in vivo olarak görülen uygun mikroçevresinin ve böylece fizyolojik cevapları yeniden kendi yetersizlik tarafından aksýyor. Dolayısıyla, maliyet / zaman verimli, yüksek verim analizi süre verir kolay bir-kolu model sistemi için kesin bir ihtiyaç vardır in vivo olarak transgenik (TG) fare deneylerde tespit edilen ve fizyolojik yanıtlar taklit edebilir. Endodermal epiteli böyle bir model sistem 2009 1 çıktı. Bilgisi Lgr5-pozitif bağırsak kök hücrelerin keşfinden elde Arasında edildikök hücre bakımı için gerekli ekstra-hücresel matris ve büyüme faktörlerine tekabül niş hakkında bilgi. O da organoids 2 olarak bilinen &#39;mini cesareti&#39; kurmak mümkün oldu bu bilgiyi kullanmak. En son organoids &#39;enteroids &quot;olarak adlandırılmaktadır, in vitro kültürler, için bir fikir birliği adlandırma 3 önerilmiştir. Hücre hatları gibi, organoids sürekli genişleyen ve ligandlar ve inhibitörlerle tedavi etmek kolaydır. Ancak, bunun yerine iki boyutlu olmanın üç-boyutlu kendi kendini düzenleyen crypt-villus düzenini korur yapılarının yanı sıra kök hücreler ve küçük bağırsak (SI) farklılaşmış hücre soyları vardır. Organoids bir lümen alanını çevreleyen epitel hücreleri, tek bir yüzeyden oluşmaktadır. Çıkıntılı tomurcuklanan yapılar kök hücre bölmesini içeren ince bağırsak crypts gelmektedir. Bunlar, akut MI ile tomurcuklanan yapının ucundan başlayarak projenitör hücrelerinin farklılaşmasınaterminal açıdan farklılaşmış hücreleri, lümenin içine dökülür epitelial doğru rendelenir. Hücre hatlarına kıyasla bu ex vivo olarak daha yakından sistem normal fizyolojisi tekrarlar ve bu nedenle, ince bağırsak epiteli için umut verici bir model sistem. Retroviral transdüksiyon Bu video protokolü, biz bu yeni organoid kültür sistemi ex vivo gen fonksiyon çalışmalarını sağlayan bir yöntem mevcut. Bu adım-adım bir şekilde tarif kültür organoid ile başlar ve transdüksiyon prosedürü takip retrovirüslerin üretimi gösteren devam edin. Son olarak, sorun giderme için ek tavsiye için bir bölüm vardır. Bu tekniğin bir avantajı, bağırsak epitel homeostazı, hücre hayati kararlan ve hücre-hücre etkileşimini incelemek canlı görüntüleme ve ilaç taraması ile birleştirilebilir olmasıdır. Nedeniyle, basit mimarisi ve hızlı ciro oranı, organoids ideal bir model s temsilyetişkin kök hücre biyolojisi çalışmaları için istem. Buna ek olarak Retroviral transdüksiyon, önceden belirlenmiş bir transgenik farelerin yanı sıra insan hasta örneklerinden türetilmiş organoids uygulanabilir. In-knock knock-out yaklaşımlar insanlara uzatılamaz gibi, insan SI organoids cazip bir alternatif oluşturmaktadır. Özetle, retrovirütik iletimi yoluyla gen manipülasyonu insan kaynaklı dokularında çalışmalar için yeni yollar açarken, böylece fare genetiğini ve tamamlayıcı hücre soyları, fare ya da insan doku örnekleri türetilmiş küçük bağırsak organoids fenotipik analiz sağlar. Retroviral transdüksiyon, gain- sağlar ve zarar fonksiyon-çalışmaları organoid 4 kültür sistemi içinde gerçekleştirilmelidir. Bu üç Rs (azaltma, arıtma, ve yedek) uyarınca olurken gen işlevi, yetişkin kök hücre biyolojisi ve hastalığı araştırmak için değerli bir kaynak haline getirmektedir.

<table><tbody><tr><td>Gelişmiş DMEM/F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12634-034</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x&nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N2 takviyesi 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>n-Asetilsistein 500 mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fare EGF 500 ve mikro; g/ml</td><td>Invitrogen Biosource</td><td>PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Noggin 100 & g/ml</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin şartlandırılmış ortam</td><td></td><td></td><td>HEK293 hücrelerinden üretilir, ayrıntılar için Sato ve Clevers 2013'e bakınız.</td></tr><tr><td>Wnt şartlandırılmış ortam</td><td></td><td></td><td>Şartlandırılmış ortam L hücrelerinden üretilir, ayrıntılar için Sato ve Clevers 2013'e bakınız.</td></tr><tr><td>Nikotinamid 1 M</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 10 & mikro; M</td><td>Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Polibren (8 & g/ml)</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Standart BD Matrigel matrisi</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>AMSBIO tarafından sağlanan Temel Matris Özü (Cultrex PathClear BME Azaltılmış Büyüme Faktörü Tip 2, 3533-005-02) alternatif olarak kullanılabilir.</td></tr><tr><td>24 oyuklu</td><td>Plaka Greiner Bio One</td><td>662960</td><td></td></tr><tr><td>48 oyuklu Plaka</td><td>Greiner Bio One</td><td>677980</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma</td><td>A3734-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Platin-E hücreleri</td><td>Hücre Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin</td><td>İnvitrojen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>İnvitrojen</td><td>A1113902</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimin (PEI)</td> <td>Polibilimleri</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>opti-MEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td></td></tr></tbody></table>

İlköğretim bağırsak organoid kültür retrovirütik enfeksiyon bir video protokolü

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-pozitif kök hücreler gerekli büyüme ile takviye edilebilir EGF Noggin, kültür ve in vitro birincil 3D epitel yapıları sürekli genişleyen için bize izin verir R-Spondin, faktörleri. Hem de organoids denilen bu &#39;mini cesaret&#39;, mimarisi ve fizyolojik özellikleri, yakından in vivo çok benzeyen. Bu onları küçük bağırsak epiteli için cazip bir model sistem yapar. Retroviral transdüksiyon ile fonksiyonel genetik hemen koşullu gen aşırı ifadesi ya da devirme ile gerçekleştirilebilir. Bu video organoid kültür prosedürü, retrovirüslerin üretimi ve in vitro olarak küçük bağırsak epiteli fenotipik analizi yardımcı olmak için organoids retroviral iletimini göstermektedir. Retroviral aracılı gen ekspresyonu ile kombinasyon halinde bu yeni Organotipik model sistemi costl gerek olmadan, in vitro olarak gen fonksiyonunun hızlı analiz için değerli bir araç sağlarTransjenik hayvanlar için, y ve zaman alıcı üretimi.

Organoids merkezi lümen bağlı olarak ölü hücreleri (Şekil 2) varlığı karanlık bölme zaman hazırdır. Tedavi öncesi organoids 2-3 gün sonra bir yuvarlak kistik morfoloji (Şekil 3) benimsemelidir. Bu stabil entegrasyonunu elde şansını arttıran kök hücrelerin sayısını artırır. Viral pelet boyutu nedeniyle topak boyutuna hücre artıkları arasında değişen katkısı, viral süpernatanın santrifüjleme ile en muhtemel değişebilir. Transdüksiyon verimliliği net bir korelasyon gözlenmiştir. Olanlar istikrarlı bir entegrasyon kalacaktır yerken seçim prosedürü sırasında sigara transdüksiyonlu organoids, ölecek. MSCV-EGFP retrovirüslerden floresan proteini (Şekil 4) transdüksiyonu takip eden 2-3 gün içinde kistik morfolojiye sahip kalan organoids gelen bu hücrelerde görülmektedir. <img alt> = "Şekil 1" fo: İçerik-width = "6in" src = "/ files / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg" width = "600" /&gt; Şekil 1. retroviral transdüksiyon işlemin şematik bir çizimi. Önceki enfeksiyon organoids için önceden muamele edilmiş bir kistik yapı (aşama 1) ile uyum sağlayıncaya kadar ENRWntNic bulunmaktadır. Platin-E, hücreler paketleme hücre hattı olarak kullanılan, ve% 70-80 gelinceye kadar büyütülür. Bundan sonra, PEI ile retroviral yapı ile transfekte edilir. Virüsler 2 gün sonra (aşama 2) hasat edilmiştir. Organoids 1-10 hücreleri (aşama 3) ihtiva eden fragmanlar elde etmek, tripsinize edilir, ve daha sonra (adım 4) enfekte edilir. Kararlı bütünleşmesi (adım 7) yapılabilir ile spinoculation takiben enfeksiyon verimliliği (adım 5) artırmak için, enfekte organoid fragmanlar pozitif klonlar için (adım 6) ve 2-3 gün sonra seçim ekilir. 1765fig2highres.jpg "width =" 500 "/&gt; Şekil kültür 4-6 gün sonra organoids 2. Temsilcisi görüntü. Lümen, ölü hücreleri ile dolu karanlık görünür yapıyor. Bu aşamada Organoids geçişli hazırdır. <img alt="Statik denge çalışması sırasında bir sıvıdaki hava kabarcıklarının yüzey gerilimini gösteren mikroskopi görüntüsü." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Şekil 3,"> 3-4 gün boyunca ENRWntNic medyada kültüre ince bağırsak organoids Şekil 3. Temsilcisi görüntü. Organoids kistik morfoloji benimsenmesi. <img alt="Hücre morfolojisi görüntüleri, parlak alan ve floresan mikroskobu, hücre yapısı analizi." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Şekil 4"> Ince bağırsak organoids Şekil 4. Temsilcisi görüntüsü (a) viral transgen ifade (b eGFP) gösteriyor ki. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> AdvaAdvanced DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> 4 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın </td></tr><tr><td> Gelişmiş DMEM / F12 </td><td> 500 mi </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> HEPES 1 M </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> Antibiyotikler 100x </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td colspan="2"> ENRWntNic ortamı (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> 2 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın </td></tr><tr><td> Gelişmiş DMEM / F12 +++ </td><td> 7.2 mL </td></tr><tr><td> B27 takviyesi (50x) </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> N2 takviyesi (100x) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> N-asetilsistein (500 mM) </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> fare EGF (500 ng / ml) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Noggin, fare (100 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> R Spondin conditbahsettiğimiz orta </td><td> 2 mi </td></tr><tr><td> Wnt3a koşullandırılmış ortam </td><td> 10 mi </td></tr><tr><td> Nikotinamid (1 M) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> Transdüksiyon ortamı (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Taze hazırlayın </td></tr><tr><td> ENRWntNic orta </td><td> 20 mi </td></tr><tr><td> -Y-27632 (10 uM) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> Polibren (8 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR ortamı (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> 4 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın </td></tr><tr><td> Gelişmiş DMEM / F12 +++ </td><td> 17.4 mi </td></tr><tr><td> B27 takviyesi (50x) </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> N2 takviyesi (100x) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> N-asetilsistein (500 mM) </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> fare EGF (500 ng / ml) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Noggin, fare (100 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> R Spondin koşullu ortam </td><td> 2 mi </td></tr><tr><td colspan="2"> Platin-E hücreleri için ortamı (500 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> 12 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449,45 mi </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu (FBS) </td><td> 50 mi </td></tr><tr><td> Puromisin (1 ug / ml) </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> Blastisidin (10 ug / ml) </td><td> 500 ul </td></tr></tbody></table> Platin-E hücreleri için Gelişmiş DMEM / F12 +++, ENRWntNic orta, Transdüksiyon orta, ENR orta ve orta Tablo 1. Medya bileşimi.

Bu protokol ana Lgr5-pozitif yer alan organoid kültür ve Retroviral transdüksiyonun müteakip bir uygulama açıklanmaktadır. Bu in vitro olarak Organotipik bir roman içinde gerçekleştirilebilir fonksiyonel çalışmalar teslim transjenin uyarımlı Cre aşırı ekspresyonunu veya demonte sağlar ve sağlar model sistem.

İlköğretim Bağırsak organoid Kültür Retrovirütik Enfeksiyon Bir Video Protokolü

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Bu prosedürün genel amacı, organoidlerde fonksiyonel genetik çalışmaların nasıl gerçekleştirileceğini göstermektir. Bu, ilk olarak organoidlerin kistik bir şekle bürünmelerini kolaylaştırmak ve kök hücre sayılarını artırmak için WINT üç A içeren besiyeri ile ön işleme tabi tutulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, virüs üretilir ve organoid fragmanlar daha sonra transdüksiyon ve aşılama yapılır.Son adımda, transfekte edilen organoidler oturtulur ve daha sonra stabil viral entegrasyon için seçilir. Sonuç olarak, ilgilenilen genin ekspresyonu veya baskılanması GFP floresansı ile değerlendirilebilir. Bu tekniğin fare gibi mevcut AL modellerine göre temel avantajı, bu teknikle bağırsak organoidleri ile in vitro fonksiyonel genetik deneylerin yapılabilmesidir.Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Amanda Andro olacak Kriptleri izole etmek için, ince bağırsağı önceden soğutulmuş kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile yıkayarak başlayın. Daha sonra dokuyu üç ila beş santimetre uzunluğunda parçalar halinde kesin ve parçaları makasla uzunlamasına açın. Dokuları açmak için forseps kullanın, bir kapak fişi kullanarak fazla villusları kazıyın ve ardından parçaları soğutulmuş PBS içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.Doku parçalarını iki ila üç kez kuvvetli çalkalanarak yıkayın, son yıkamadan sonra PBS daha az bulanık olana kadar PBS'yi değiştirin, dokuyu bir tüp silindiri üzerinde dört santigrat derecede bir milimolar EDTA ile desteklenmiş 30 mililitre PBS içeren 50 mililitrelik bir tüpte inkübe edin. 30 dakika kuvvetlice bir süre sonra, tüpü tekrar çalkalayın ve dokuyu beş milimolar EDTA ile desteklenmiş 30 mililitre PBS içeren 50 mililitrelik başka bir tüpe aktarın. Tüp silindiri üzerinde dört santigrat derecede bir saatlik inkübasyondan sonra kuvvetlice.Tüpü tekrar çalkalayın ve çözeltiyi 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Ardından 50 mikrolitredeki kripto sayısını sayın. 50 ila 100 kript içeren hacmi hesaplayın ve 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.Ardından, kriptleri aşağı çevirin ve peleti 50 mikrolitre bodrum matrisinde yeniden süspanse edin. Daha sonra kript çözeltisini bir Ön Isıtma 24 Kuyulu plakaya yerleştirin ve plakayı bir doku kültürü inkübatöründe beş ila 15 dakika inkübe edin. Bazal membran polimerize olduktan sonra, matrisi bir hücre kültürü inkübatöründe 500 mikrolitre ENR ortamı ile inkübe edin.Oturduktan yaklaşık 24 saat sonra her üç günde bir ortamı tazeleyen organoidler küçük yuvarlak kistik bir şekil sergileyecektir. İki ila üç gün sonra, organoidler kistik morfolojilerini benimserken tomurcuklanan yapılar görünür hale gelecektir Tohum, yaklaşık beş kez 10 ila altı platin E hücresi 150 milimetrelik bir tabakta 15 ila 18 mililitre ortam ile pur, mycin ve blastin ile desteklenmiştir. İki ila üç gün sonra, ortamı antibiyotiksiz ortama değiştirin ve her biri bir mililitre optimum içeren iki ayrı tüpe 30 mikrogram retroviral DNA yapısı ve 240 mikrolitre pi ekleyin.Daha sonra, tüpleri karıştırın ve oda sıcaklığında inkübe edin. Beş dakika sonra, iki çözeltiyi bir araya getirin ve 20 ila 30 dakika daha oda sıcaklığında inkübe edin. Karışımın tamamını platin E hücrelerine ekleyin ve DNA PI komplekslerinin eşit dağılımını sağlamak için plakayı dikkatlice sallayın.Bir gece inkübasyondan sonra, ortamı yenileyin ve hücreleri tekrar inkübe edin. İki gün sonra, sadece ortamı 50 mililitrelik bir Falcon tüpünde toplayın ve 0.45 mikronluk bir filtreden süzün. Daha sonra çözeltiyi 8.000 kez G ve dört santigrat derecede 12 ila 16 saat santrifüjleyin ve peleti 250 mikrolitre transdüksiyon ortamında yeniden süspanse edin.Organoid fragmanlarını retroviral transdüksiyon için hazırlamak için, organoidleri mekanik olarak parçalamak için önce kültürü 200 mikrolitrelik bir pipet ucuyla 30 ila 50 kez pipetleyin, çözelti bulanıklaşır ve bütün organoidler tespit edilmemelidir. Parçaları döndürdükten sonra, peleti 500 mikrolitre hücre kültüründe inkübe edin, rekombinant proteazı 37 santigrat derecede beş dakika boyunca derecelendirin. İnkübasyonun ardından, organoid fragmanların boyutunu değerlendirmek ve fragman başına hücre sayısını saymak için bir ışık mikroskobu kullanın.Daha sonra ayrışma sürecini sonlandırmak ve hücre parçalarını döndürmek için 500 mikrolitre ENR ortamı ekleyin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti buzun üzerine yerleştirin ve ardından parçaları 48'lik bir kuyuya tohumlayın. Önceden hazırlanmış retroviral çözeltinin 250 mikrolitresinde kuyu plakası.Hücre çözeltisini bir mililitrelik pipet ucuyla nazikçe karıştırın ve ardından aşılama ilk santrifüjünü gerçekleştirmek için plakayı param ile kapatın. 48 oyuklu plaka, 600 kez G ve 32 santigrat derecede bir saat boyunca. Daha sonra para filmi dikkatlice çıkarın ve plakayı bir hücre kültürü inkübatöründe altı saat daha inkübe edin.İnkübasyondan sonra, enfekte olmuş parçaları 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra organoid parçalarını tekrar döndürün ve peleti beş dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Pelet soğuduktan sonra, tüpe 100 mikrolitre bodrum matrisi ekleyin ve peleti yeniden süspanse etmek için yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin.Daha sonra, 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 50 mikrolitrelik parça matris süspansiyonu damlatın ve plakayı 37 santigrat derecede beş ila 15 dakika inkübe edin Bodrum matrisi katılaştıktan sonra, organoidleri poli beyinsiz transdüksiyon ortamı ile inkübe edin. İki ila üç gün sonra, seçimi başlatmak için kuyucuklara saf misin içeren ortam ekleyin. Fragmanlar organoidler oluşturmaya başladığında, transdüksiyon ortamını ENR ortamı ile takviye edilmiş olarak değiştirin.Puram ile Mycin organoidleri, ölü hücrelerin varlığı nedeniyle merkezi lümenleri koyulaştığında bölünmeye hazırdır. Wint üçten iki ila üç gün sonra bir medya ön tedavisinden sonra, organoidler kistik morfolojiye adapte olmalı, kök hücre sayısını arttırmalı ve kök hücrelerde stabil bir entegrasyon elde etme şansını arttırmalıdır. Bu görüntülerde, M-S-C-V-E-G-F-P retrovirüsünden gelen floresan protein ekspresyonu, transdüksiyondan sonraki iki ila üç gün içinde beklenen kistik morfolojiyi elde eden hayatta kalan organoidlerden kaynaklanan hücrelerde gözlemlenebilir.Bu prosedürü denerken, hayatta kalmalarını güçlü bir şekilde etkilediği için organoid fragmanların boyutunu kontrol etmek önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, organoidlerin retroviral transdüksiyonunun nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

a-video-protocol-retroviral-infection-primary-intestinal-organoid

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

Primer fare kolon tümörü organoid kurmak için basit bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem kolon tümör hücreleri hayatta kalmak ve epitel normal bir kolon yok ise, sınırlı büyüme faktörleri içeren ortamlarda organoids içine büyümeye bu özelliği kullanır.

Birincil Fare Colon Tümörler in vitro organoid Kültür

Bu video protokolünde, primer intestinal epitel organoidlerinde lentiviral transdüksiyonun ve bu kültürlerin kantitatif RT-PCR, RNA-mikroarray ve immünohistokimya ile işlenmesi ve aşağı akış analizinin adım adım açıklamasını veriyoruz.

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Burada, hasat korumak ve patojen ilişkili moleküler modelleri (PAMPS) ve Listeria monocytogenes fare ince bağırsak organoids tedavisi için bir protokol da gen ifadesi ve protein için uygun normalizasyon ağırlıklı olarak, tarif edilmektedir.

<em&gt; Ex Vivo</emFare Bağırsak Organoids ve&gt; Kültür ve Desen Tanıma Reseptör Uyarım

Biz iletişim kuralları izolasyon-in vivo dokusundan bağırsak 3D yapılar için mevcut ve organoids ve detay farklı fiksasyon ve protokolleri IMMUNO-etiketleme için Mikrotubul, en iyi duruma getirilmiş boyama vitro Bodrum matris gömülü, centrosomal ve bileske proteinler de gibi hücre kök hücre proteini Lgr5 de dahil olmak üzere işaretler.

IMMUNO florasan mikrotübüller ve Ex Vivo bağırsak dokusu ve 3D Vitro bağırsak Organoids Centrosomal proteinler etiketleme

Biz adım adım talimatları tarif: 1) etkin bir şekilde bağırsak organoidleri Lenti-veya retroviral dönüştürücü için manyetik nano maddeler kullanarak mühendis ve 2) mühendislik organoidler dondurulmuş bölümler oluşturmak. Bu yaklaşım, akım etkilerinin incelenmesi için organoidlerde gen ifadesini verimli bir şekilde değiştirmek için güçlü bir araç sağlar.

Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma

Burada bağırsak apikal spesifik etkileşimlerin modellenmesine izin veren iki protokol sunuyoruz. Organoid türevli bağırsak monolayerleri ve Hava-Sıvı Arayüzü (ALI) kültürleri, hem aydınlık hem de bazolateral taraflardan erişilebilen iyi ayırt edilmiş epitellerin üretilmesini kolaylaştırırken, polarite ters bağırsak organoidleri apikal yanlarını ortaya çıkarır ve yüksek verim testlerine uygundur.

Bağırsak Organoid Modellerini Kullanarak Apikal Spesifik Etkileşimleri İncelemek için Kültür Yöntemleri

Bu protokol, tek hücreli RNA dizileme (scRNAseq) teknolojisini kullanarak tek hücreli düzeyde konakçı/patojen etkileşimlerini karakterize etmek için insan bağırsak organoidlerinin apikal veya bazolateral tarafından nasıl enfekte olduğunu açıklar.

Gastrointestinal Organoidlerin Biyogüvenlik Seviye 3 (BSL-3) Koşullarında Patojen Enfeksiyonu ve Tek Hücre dizilimi için uyarlandırılması

Bu protokol, murin ince bağırsak organoidlerinin oluşturulması, tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücrelerin murin ince bağırsak lamina propriasından izole edilmesi ve bağırsak epitel hücreleri ile tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücreler arasındaki çift yönlü etkileşimleri incelemek için her iki hücre tipi arasında 3 boyutlu (3D) ortak kültürlerin oluşturulması için ayrıntılı talimatlar sunmaktadır.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Burada, sıçan bağırsak organoidleri üretmek ve bunları birkaç aşağı akış uygulamasında kullanmak için bir protokol sunuyoruz. Sıçanlar genellikle tercih edilen bir klinik öncesi modeldir ve sağlam bağırsak organoid sistemi, in vivo çalışmalara eşlik edecek bir in vitro sistem ihtiyacını karşılar.

Sıçan Bağırsak Organoidlerinin Üretimi ve Manipülasyonu

Bu protokol, virüsle enfekte insan bağırsak organoidlerinde kalsiyum görüntüleme yapmak için bir yaklaşımı açıklar ve analize bir yaklaşım sunar.

Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi

Öğrenin bağırsak organoidlerinde retroviral transdüksiyon yöntemiyle fonksiyonel genetik çalışmalar yapmayı. Bu teknik, gen ifadesini GFP floresansı ile değerlendirerek in vitro ortamda güvenilir sonuçlar sunar.

İlköğretim Bağırsak organoid Kültür Retrovirütik Enfeksiyon Bir Video Protokolü

Daha fazla video keşfet