Name: Düşük Bolluk Proteinler saptamak için plazma veya idrar hidrojel Nanoparçacık Hasat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-07T20:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Öğrenin, hidrojel nanoparçacıklar kullanarak plazma veya idrardaki düşük bolluklu proteinleri yakalama, yoğunlaştırma ve koruma yöntemini. Bu teknik, biyobelirteç tespit duyarlılığını artırarak tanısal analizleri geliştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nazik Şekil 5&#39;te gösterilen veri toplama ve analizi ile destekli Michael Henry, Dublin City University,. Bu çalışma ile kısmen desteklenmiştir (1) George Mason Üniversitesi, (2) İtalya / ABD çerçevesinde İtalyan IstitutoSuperiore di Sanita &#39; ABD Sağlık Bakanlığı ve İnsan Hizmetleri, George Mason Üniversitesi ve Halk Sağlığı İtalyan Bakanlığı, (3) NIH, IMAT programı hibe 1R21CA137706-01 ve LAL için 1R33CA173359-01, ve (4) Ceres Nanobilimler, Inc arasında işbirliği anlaşması .

İnsan plazma ve idrar George Mason Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu onaylanan protokollerde aşağıdaki, bilgilendirilmiş yazılı onayı ile, sağlıklı gönüllü vericilerden toplanmıştır. Bağışçılar eşit ayrı ayrı analiz edildi 25 ve 42. Numune yaş arası Kafkas kadınlar ve erkekler arasında dağıtılmış ve havuza değil. Serum veya Plazma Örneklerinin 1. Nanoparçacık İşleme Plazma potansiyel biyo-düşük miktarda hidrojel nanopartiküller ile, çözelti içinde yakalanır. Tanecikleri, yıkandı, santrifüj ile ayrılmış plazma kuluçkaya yatırılır, ilave edilir ve çekilen proteinleri elüte edilir. Elüsyona tâbi tutulmuş proteinler alt-kütle spektrometrisi sekanslama ve tanımlanması için azot akışı altında kurutulur. <ol><li> Mikrosantrifüj tüp içinde 50 mM TrisHCI pH 7 (500 ul serum + 500 ul TrisHCI) 2: serumun 1 500 ul sulandırmak. </li><li> 500 mcL poli (Nipam / AAc) çekirdek nanop Eklemakaleler. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Sabit açılı rotor ile donatılmış bir santrifüj içinde 10 dakika boyunca, 16,100 x g hızında 25 ° C örnek dönerler. Çıkarın ve süpernatant atın. </li><li> Topağa 500 ul sodyum tiyosiyanat (25 mM) eklenir. Kuvvetlice pipetleme ve birden çok kez aşağı nanopartiküller süspanse. </li><li> Sabit açılı rotor ile bir santrifüj içinde 10 dakika boyunca, 16,100 x g hızında 25 ° C örnek dönerler. Çıkarın ve süpernatant atın. </li><li> Nanopartikül pelet MiliQ suyu içinde 500 ul ilave edin. Kuvvetlice pipetleme ve birden çok kez aşağı nanopartiküller süspanse. </li><li> Sabit açılı rotor ile bir santrifüj içinde 10 dakika boyunca, 16,100 x g hızında 25 ° C örnek dönerler. Çıkarın ve süpernatant atın. </li><li> Taze elüsyon tamponu hazırlayın: temiz bir tüp içinde 300 ul amonyum hidroksite ul asetonitril 700 ekleyin. Dikkat: Amonyum hidroksit aşındırıcı olduğunu. Uygun havalandırma ile kullanın. Not: Yıkama tamponu, preparatif olmalıdırared kullanımdan hemen önce. Elüsyon tamponu tutmayın. </li><li> Nanopartikül pelet elüsyon tamponunun 300 ul ilave edin. Kuvvetlice pipetleme ve birden çok kez aşağı nanopartiküller süspanse. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Sabit açılı rotor ile bir santrifüj içinde 10 dakika boyunca, 16,100 x g hızında 25 ° C örnek dönerler. Çıkarın ve temiz, etiketlenmiş bir mikrosantrifüj tüpü içinde eluatın kaydedin. </li><li> 1.10 - Tekrar 1.9 adımları. Bir mikrosantrifüj tüpe iki elüsyonların birleştirin. </li><li> 8 (Şekil 2F) ayarlanmış hava akışı ile, 42.1 ° C &#39;de bir azot evaporatör manifoldunun, azot akışı altında sıvı kısımlar kurutun. </li><li> O / N depolama için oda sıcaklığında kurutuldu eluatın saklayın, ya da uzun süreli depolama için -20 ° C, kütle spektrometresi, Western blotting, ELISA tahlilleri ya da (isteğe bağlı) öncesinde. </li></ol> İdrar Örneklerinin 2. Nanoparçacık İşleme Normal idrar az 30 mg / dl protein içerir ve1+ kandan daha az. Ancak, birçok hastalık / durumlar idrar protein ve normal kan seviyelerini değiştirebilir. Idrar örneği eklemek için nanopartiküllerin uygun hacminin belirlenmesinde yardımcı olmak için, bir idrar toplama nanopartikül önce gerçekleştirilir. İdrar biyolojik göstergeler idrar hacmi nanopartiküllerin oranını optimize gerektirebilir son derece düşük konsantrasyonlarda mevcut olabilir. Bu işlem alt Western blot analizi için idrar örnekleri nanopartikül hasat tarif etmektedir. <ol><li> Temiz, kuru bir plastik kap içinde idrar örnekleri toplamak. Bir 22 ml minimum hacim gereklidir. Analiz için hazır olana kadar mağazası idrar -80 ° C&#39;de numune. </li><li> Oda sıcaklığında ya da 4 ° de CO / N, dondurulmuş idrar çözülme. , Bir girdaplı karıştırıcı ile kısa bir süre karıştırılır. 50 ml&#39;lik konik tabanlı polipropilen tüp içine idrar en az 22 ml dökün. </li><li> 15 dakika boyunca 3700 x g&#39;de dışarı salınan bir rotora sahip bir santrifüj içinde idrar dönerler. Temiz bir 50 ml&#39;lik konik tabanlı polypr içine pelet bozmadan, idrar süzünopylene tüpü. Pelet atın. </li><li> Bir multi-analit &quot;idrar testi&quot; reaktif şerit kullanarak idrar tahlili gerçekleştirin. Not: Doğrudan güneş ışığı ve nem 17, 18 uzak bir sıkıca kapalı bir kapta reaktif şeritler saklayın. <ol><li> Temiz, kuru bir kağıt havlu üzerine reaktif şerit, yüz-up, yatıyordu. </li><li> Adım 2.3 hazırlanan idrar 1 ml aspire bir pipet kullanın. </li><li> 2 dakika için bir zamanlayıcı ayarlayın ama başlamayın. Reaktif şerit her test pad üzerinde idrar 2 damla - Çabuk 1 dağıtın. Hemen sayacını başlatmak. Not: idrar konteyner doğrudan reaktif şerit batırmayın. Ayıraç şerit boya / kimyasal göstergeler potansiyel idrar kabına ayıraç şeridinin dışına yapışabilen. </li><li> Reaktif şerit konteyner üzerindeki zamanda, karşılık gelen renk kodlu indica tek tek reaktif şeritlerin renk karşılaştırılarak bir ayıraç çubuğu üzerindeki çeşitli analitler için niteliksel neticelerin kayıtReaktif kabın üzerine monte edin. Tipik normal idrar Sonuçlar şu şekildedir: (normal veya negatif), kan, protein, lökosit, nitrit, glukoz, keton, bilirubin ve Ürobilinojen tayini için; İdrar pH (5,5-7,0); özgül ağırlığı (1,001-1,020). Not: Bir idrar örneğinde yüksek protein seviyelerinin nanopartiküller bağlanma alanlarında ilgilenilen protein ile rekabet edebilir. Nanopartiküller protein hasat üst düzeye çıkarmak için, nanopartikül hacim / hacim oranında idrar yüksek bolluk proteinlerinden ya da sınır rekabete ayarlanabilir ya da çok düşük konsantrasyonlarda mevcut proteinlerin toplanması için optimize edilebilir. Idrar protein değeri 1+ veya daha fazla ise, aşağıdaki adımda 2,5 nanopartiküllerinin 2x hacimlerini ekleyin. Ilgilenilen analit çok düşük bir miktarda bir protein ise, 2 ml (Şekil 3) &#39;e kadar nanopartiküllerin hacmini artırmak için gerekli olabilir. </li></ol></li><li> Aktarım, temiz 50 ml&#39;lik konik tabanlı polipropilen tüp içine adım 2.3 açıklık idrar 20 mi. Yapamazidrar tüpün alt olabilecek herhangi bir artık / pelet rahatsız. 20 ml idrar numunesi ile nanopartiküller 200 ul ilave edin. , Bir girdaplı karıştırıcı ile kısa bir süre karıştırılır. Idrar protein değeri 1+ veya daha fazla ise, 20 mi idrara nanopartiküllerinin 400 ul ekleyin: edin. </li><li> Sallanan / karıştırma olmadan, oda sıcaklığında 30 dakika için idrar / nanopartikül karışımı inkübe edin. </li><li> 10 dakika boyunca 3700 x g&#39;de dışarı salınan bir rotor ile donatılmış bir santrifüjde idrar / nanoparçacık süspansiyon dönerler. Not: pelet görünür ardından santrifüj değilse, ek bir 2 için örnekler dönmeye -, 7 dakika. </li><li> Çıkarın ve süpernatant atın. Nanopartikül pelet 500 ul, MilliQ su ekleyin. </li><li> Kuvvetlice pipetleme ve birden çok kez aşağı nanopartiküller süspanse. Temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne nanopartikül çözeltisini. </li><li> 10 dakika boyunca 16.100 x g&#39;de sabit açılı rotor ile donatılmış bir santrifüj içinde nano-tanecikleri dönerler. Not: pelet görünür vr değilse7 dakika - santrifüj iyice silinir, ek bir 2 için örnekler döndürün. </li><li> Çıkarın ve süpernatant atın. </li><li> Tekrar nanopartiküller yıkamak için 200 ul 18 MilliQ su ile (iki kez) 2.8 ve 2.11 adımları. </li><li> Taze elüsyon tamponu hazırlayın: temiz bir tüp içinde 30 ul amonyum hidroksite ul asetonitril 970 ekleyin. Dikkat: Amonyum hidroksit aşındırıcı olduğunu. Uygun havalandırma ile kullanın. Not: Yıkama tamponu, kullanılmadan hemen önce hazırlanmış olmalıdır. Elüsyon tamponu tutmayın. </li><li> Nanopartikül pelet 20 ul yıkama tamponu ilave edin. Kuvvetlice pipetleme ve birden çok kez aşağı nanopartiküller süspanse. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 10 dakika boyunca 16.100 x g&#39;de nanopartikül örnekleri dönerler. Çıkarın ve temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü süpernatant kaydedin. Nanoparçacık pelet bozmayan. Biohazard çöpe pelet atın. </li><li> Bir kimyasal davlumbaz rafa örnekleri yerleştirin. Kapaklar açın ve inc30 dakika boyunca oda sıcaklığında Ubate. (- 1, 2 saat) Alternatif olarak, kuru hale gelinceye kadar 40 ° C&#39;de azot akışı altında örnekleri yer. </li><li> Örnekler 15 ul Tris-glisin SDS numune tamponu (2x) ekleyin. Isı 100 ° C&#39;de Açık veya boru içinde kalan hacme kadar kapakları 5 dakika boyunca kuru ısı bloğu, ° C olarak en fazla 20 ul&#39;dir. Not: Bir kaynar su banyosu kullanmayın. Su banyosu nem tampon buharlaşmasını engeller. </li><li> Borular üzerinde kapağını yerleştirin. Isı bloğu tüpleri çıkarın. Numune -80 ° C&#39;de saklandı veya alt Western blot analizi için hemen kullanılabilir. </li></ol>

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Gerszten, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+translating+plasma+proteomics+from+bench+to+bedside%3A+update+from+the+NHLBI+Clinical+Proteomics+Programs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).</li>
<li>Merrell, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+low-abundance%2C+low-molecular-weight+serum+proteins+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry.</a> J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).</li>
<li>Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood+peptidome%3A+a+higher+dimension+of+information+content+for+cancer+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery.</a> Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).</li>
<li>Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+selective+isolation+and+enrichment+of+carrier+protein-bound+low-molecular+weight+proteins+and+peptides+in+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood.</a> Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).</li>
<li>Geho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+serum+components+using+nanoporous+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Fractionation of serum components using nanoporous substrates.</a> Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).</li>
<li>Sennels, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+human+blood+serum+using+peptide+library+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads.</a> J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).</li>
<li>Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+low+molecular+weight+serum+peptidome+using+ultrafiltration+and+a+hybrid+ion+trap-Fourier+transform+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer.</a> J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).</li>
<li>Marshall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+serum+proteins+underlies+the+mass+spectral+fingerprinting+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction.</a> J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+Preservation+of+Very+Low+Abundance+Biomarkers+in+Urine%2C+such+as+Human+Growth+Hormone+%28hGH%29%2C+by+Cibacron+Blue+F3G-A+Loaded+Hydrogel+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Res%22%5BJournal%5D)">Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles.</a> Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).</li>
<li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+hydrogel+particles%3A+biomarker+harvesting%3A+one-step+affinity+purification%2C+size+exclusion%2C+and+protection+against+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation.</a> Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).</li>
<li>Patanarut, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+hydrogel+particles+containing+Cibacron+Blue+F3G-A%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+A+Physicochem+Eng+Asp%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A.</a> Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).</li>
<li>Tamburro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+core-shell+nanoparticles%3A+discovery+of+previously+invisible+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers.</a> J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).</li>
<li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+plasma+proteome%3A+history%2C+character%2C+and+diagnostic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+technology%3A+amplifying+the+effective+sensitivity+of+biomarker+detection+to+create+a+urine+test+for+hGH%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Test+Anal%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH.</a> Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).</li>
<li>Longo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core-shell+hydrogel+particles+harvest%2C+concentrate+and+preserve+labile+low+abundance+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers.</a> PLoS One. 4 (3), e4763(2009).</li>
<li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+technology%3A+addressing+the+fundamental+roadblocks+to+protein+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery.</a> Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).</li>
<li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Analyte+Harvesting+Nanoparticle+Technology+to+the+Measurement+of+Urinary+HGH+in+Healthy+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sports+Med+Doping+Stud%22%5BJournal%5D)">Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals.</a> J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J., Western, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Penna, A., Cahalan, M., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J Vis Exp. (7), 264(2007).</li>
<li>Bosch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+urinary+human+growth+hormone+%28hGH%29+using+hydrogel+nanoparticles+and+isoform+differential+immunoassays+after+short+recombinant+hGH+treatment%3A+preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results.</a> J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+ovarian+and+prostate+cancer+peptidome+for+candidate+early+detection+markers+using+a+novel+nanoparticle+biomarker+capture+technology%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology.</a> AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).</li>
<li>Longo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+biomarker+harvesting+nanotechnology+identifies+Bak+as+a+candidate+melanoma+biomarker+in+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum.</a> Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).</li>
<li>Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F. 3rd, Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+technology%3A+Addressing+the+fundamental+roadblocks+to+protein+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery.</a> J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).</li>
<li>Douglas, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+hydrogel+microparticles+to+sequester+and+concentrate+bacterial+antigens+in+a+urine+test+for+Lyme+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease.</a> Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).</li>
<li>Prakash, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaboratory+reproducibility+of+selective+reaction+monitoring+assays+using+multiple+upfront+analyte+enrichment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies.</a> J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).</li>
<li>Choi, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+lipocalin-2+and+visfatin+levels+in+patients+with+coronary+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease.</a> Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).</li>
<li>Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor+%28PDGF%29%3A+actions+and+mechanisms+in+vascular+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle.</a> Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).</li>
<li>Izycki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+levels+of+IGF-I+and+IGF-II+in+patients+with+lung+cancer+during+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Oncol%22%5BJournal%5D)">Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy.</a> Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).</li>
<li>Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+methylprednisolone+and+mitoxantrone+on+CCL5-induced+migration+of+lymphocytes+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurol+Scand%22%5BJournal%5D)">The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis.</a> Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).</li>
<li>Kitazume, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+insights+into+beta-galactoside+alpha2%2C6-sialyltransferase+secretion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo.</a> Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).</li>
<li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+hepatic+NKT+cells+in+leukocyte+cell-derived+chemotaxin+2-deficient+mice+contributes+to+severe+concanavalin+A-induced+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis.</a> J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).</li>
<li>Struyf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARC%2FCCL18+is+a+plasma+CC+chemokine+with+increased+levels+in+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia.</a> Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).</li>
<li>Michael, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue+kallikrein+5+is+a+member+of+a+proteolytic+cascade+pathway+involved+in+seminal+clot+liquefaction+and+potentially+in+prostate+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression.</a> J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).</li>
</ol>

Benjamin Espina, bu Makalede kullanılan reaktifleri üreten Ceres Nanosciences, Inc.'in bir çalışanıdır. Lance Liotta, Alessandra Luchini ve Virginia Espina, bu Makalede kullanılan nanopartikül teknolojisine ilişkin patentlere (ABD patenti 7,935,518 ve/veya 8,497,137) sahiptir. Üniversite çalışanları olarak, üniversite politikası uyarınca bu patentlerden telif hakkı alma hakkına sahiptirler. Lance Liotta ve Alessandra Luchini, Ceres Nanosciences'ın hissedarlarıdır ve Bilimsel Danışma Kurulu'nda görev yapmaktadır.

Klinik Uygunluk Bir serum ya da plazma numunesi, bir bütün olarak organizmanın durumu ile ilgili bilgiler için zengin bir kaynak temin edebilmektedir proteinler ve peptidler, dolaşımdaki düşük bol miktarda içerir düşünülmektedir. Serum proteomik söze rağmen, klinik yarar 10, 11, 16, 25 biyomarkır keşif ve çeviri thwarting üç temel ve ciddi fizyolojik engeller vardır. 1. Önemli teşhis biyomarkerler kanda çok düşük bulunan (konsantrasyon...

Insan genomu dizileme tamamlanmasına rağmen, önemli ilerlemeler erken evre hastalığın öngörü belirlenmesi biyomarkerlerindeki yapılmamıştır, ya da tedavi sonucu veya prognoz 1 ile ilişkilidir. Bu ilerleme olmaması için bir nedeni olarak birçok potansiyel önemli belirteçler konvansiyonel kütle spektrometresi ve diğer biyobelirteç keşif platformlarda saptama sınırının altında bir konsantrasyonda mevcut olduğunu. Kütle spektrometrisi (MS) ve çoklu reaksiyon takip işlemi (MRM), tipik olarak, bir algılama hassasiyeti daha büyük olan 50 ng / ml olarak ise 50 pg / ml ve 10 ng / ml arasında değişen bir klinik laboratuar düşme ile ölçülen bağışıklık analitlerin çoğunluğu . Bu, özellikle bir hastalığın erken evrede pek biyomarkırlar, geleneksel MS ve MRM 2 ile tespit edilemez anlamına gelir. Ayrıca bu gibi kompleks biyolojik sıvılarda albümin ve immunoglobülin gibi yüksek bolluk proteinlerin varlığı genellikle milyar kat exc ile maskeesini düşük miktardaki, düşük molekül ağırlıklı proteinler ve peptitler 3, 4. bu nedenle birçok örnek hazırlık adımları kütle spektrometrisi sekanslama ve kimlik önce gerekmektedir. Bu gibi bir hazırlık aşaması ticari olarak temin edilebilen tükenme sütunlar 5-8, yüksek miktardaki proteinlerin tükenmesi kullanmaktadır. Genellikle kovalent olmayan bir şekilde kaldırılmakta olan taşıyıcı proteinler ile ilişkili olduğundan, ne yazık ki, bu adım aday biyobelirteç verim azalmaya yol açar. Örnekler toplandığı bir zamanlar başka bir meydan aday biyomarkerların ex-vivo stabilitesi ile temsil edilmektedir. Proteinler, endojen veya eksojen proteazlar 9 ile degradasyona tabi tutulur. Bozulması 10-13 protein korurken hidrojel nanopartiküller, tahlilin aralığı içinde bir düzeye farazi biyolojik işaretleyici konsantrasyonunu yükselterek bu kritik zorlukları aşmak olabilir. Bu th dikkat etmek önemlidirLMW, kanda proteinlerin küçük sağlam proteinler ile birlikte, bu büyük proteinlerin parçalarının bir karışımı bulunmaktadır. 60 kDa&#39;dan daha büyük bir Doku türevli proteinler pasif vasküler bazal zar boyunca kan akışına girmesine kadar büyük, ancak peptidler veya protein parçacıkları 14 kanın temsil edilebilir. Amacımız Hastalığın erken teşhisi, tedavisi için hasta tabakalaşma ve tedaviye yanıtın izlenmesinde için aday olabilir roman dolaşan biyomarkerları ölçmektir. Bizim nanopartiküller anda küçük proteinler ve peptidler yakalama ve başlangıç ​​hacmine göre 100 kat kadar onları konsantre olurken seçici, yüksek bolluk immünoglobinlerin ve albumin dışlamak için oluşturulur. Bizim grup başarıyla proteinler ve peptidler için yüksek afinite moleküler yemler hareket edebilen küçük organik boyaların bir dizi tanımlanır. Protein boya bağlama bağlı olarak, hidrofobik ve elektrostatik etkileşimin bir kombinasyonu olduğu düşünülmektedirs. Boya üzerindeki aromatik halkalar protein yüzey 11 ile hidrofobik cepleri proteinleri ile dönüşümlü olarak çalışır. Yemler, kimyalarına bağlı olarak seçilmiş analitlerin sınıfları için özel bir çekim gücü gösterirler. Yemler proteinler veya peptidlere, örneğin albumin gibi, taşıyıcı proteinler ile rekabet eder. Düşük molekül ağırlıklı proteinler / peptidler parçacık içinde sıkışır. , Albümin ve immunoglobülin gibi yüksek molekül ağırlıklı proteinler nedeniyle hidrojel 11 (Şekil 1) yer alan sınırlayıcı gözenek çünkü eleme yeteneğinin parçacık girmesini engellenir. Hidrojel nanopartiküller amonyum persülfat 11 tarafından başlatılan çöktürme polimerizasyonu ile sentezlenir. N-izopropil (Nipam), akrilik asit (AAC) ve alilamin (AA) ve çapraz bağlayıcı, N, N&#39;-metilenbisakrilamid (BIS) eş-monomerler arasında 1 seyreltik koşullar içinde, 6 saat boyunca 70 ° C&#39;de reaksiyona girmesine imkan verilir1, 13. Poli yüksek protein bağlanma afinitesi (N-izopropil akrilamid-ko-akrilik asit) kovalent (amino içeren boya maddelerinin katılmasıyla, yani., Sulfonatedanthraquinonetriazine boyalar) nanopartiküllerin içine yoluyla elde (poli (Nipam-ko-AAC) nanoparticlesis Boyaların hidrofobik / hidrofilik özelliklere bağlı olarak, sulu ya da organik çözücü maddelerin içinde, bir amidasyon reaksiyonu 11, bir anthraquinonetriazine boyanın klorür atomu ile nanopartikül amin grubuna ait 13. nükleofilik ikamesi, boya ihtiva eden poli (Nipam oluşturmak için kullanılmaktadır CO-allilamin) (AA) 11 12 nanoparçacıklar. iki aşamalı polimerizasyon işlemi vinilsülfonik asit (VSA), 11, 13, bir dış kabuk içeren hidrojel nano-tanecikleri oluşturmak için kullanılır. Hidrojel nanopartiküller, tam kan, plazma, serum, serebrospinal sıvı, ter ve idrar dahil olmak üzere çeşitli biyolojik sıvılar, uygulanabilir. Bir adım olarak, çözelti içinde, nanoparticles (birkaç dakika içinde) hızlı bir haciz ve düşük moleküler ağırlığa sahip konsantrasyonu, 10, 11, 13, 15-18 analitlerini gerçekleştirin. Proteinler daha sonra kullanılarak nanopartiküller yıkanır ve tespit edilir batı spektrometrisi 10, 11, 13, 15, 18, ​​22 kütle, 19-21 lekeleme, 23, bağışıklık / ELISA 10, 11, 15, 18, ​​ya da ters faz, protein mikro-dizi 16 24 deneyleri. Nanopartiküller, kimyasal yem ile fonksiyonalize ve bir çekirdek ya da çekirdek-kabuk mimari, yakalama sunulması ve yem / kabuk fizikokimyasal özelliklerine göre proteinlerin konsantrasyonu. Nanopartiküller dahil farklı boyaların bu nedenle boya afinitesi göre verimlilik, çözeltinin pH değeri ve yüksek miktardaki proteinlerin 13 rakip varlığını / yokluğunu değişen proteinlerin, farklı alt çekecektir. Bundan başka, çözeltinin hacmi ile ilgili olarak nanopartiküllerin miktarı nanopartiküller gelen protein verimi etkileyecektir. Bu yönleriHidrojel nanoparçacık hasat Yüksek miktarda protein içeren plazma numuneleri hasat proteinleri için üç farklı nanopartikül yemler kullanılarak gösterilebilir, ve tipik olarak yüksek miktarda protein içermeyen idrar örnekleri vardır. Bu protokolde, hasat ve poli (Nipam-ko-AAC), Poli (Nipam / boya) ve çekirdek-kabuk nano-tanecikleri kullanılarak plazma numuneleri, tümör nekroz faktörü alfa (TNFa) konsantre göstermektedir (Poli (Nipam-ko-VSA)) . Poli (Nipam / boya) nanopartiküller Mycobacterium tuberculosis ile enfekte bireyler taklit insan idrar örneklerinde eklendi Mycobacterium türleri antijeni, konsantre gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Hidrojel nanopartiküller</td><td>Ceres Nanoscience</td><td>CS003</td><td>NanoTrap ESP parçacıkları</td></tr><tr><td>18 M&Omega;-cm su</td><td></td><td></td><td>Tip 1 reaktif sınıfı su</td></tr><tr><td>Tris HCl, 50 mM pH 7.0</td><td>VWR</td><td>IC816116</td><td>50 mM, pH 7</td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>BDH</td><td>BDH1103-4LP</td> VWR Amonyum Hidroksit NH4OH <td>BDH'den temin edilebilir</td></tr><tr><td></td><td></td><td>BDH3014</td><td>VWR'den temin edilebilir, %28-30 NH 3</td></tr> <tr><td>Sodyum tiyosiyanat 25 mM</td><td>Acros Organics</td><td>419675000</td><td>Serum / plazma örnekleri için</td></tr><tr><td>Çoklu analit İdrar Reaktif Şeritleri</td><td>Siemens</td><td>2161</td><td>İdrar örnekleri için</td></tr><tr><td>Tris-Glisin SDS Numune Tamponu (2X)</td> <td>Life Technologies</td><td>LC2676</td><td>SDS'nin çökelmesini</td></tr> <tr><td>önlemek için RT'de kullanınKuru banyo inkübatörü (100 oC) ısıtma bloklu</td><td>Barnstead</td><td>11-715-125DQ</td><td>Kaynar su banyosu yerine kullanmayın</td></tr><tr><td>Azot evaporatör manifoldu</td><td>Organomasyon Ortakları</td><td>Microvap118</td><td>Serum/plazma örnekleri için</td></tr><tr><td>Santrifüj, açılır rotor</td><td>Sorvall</td><td>Legend serisi</td><td>50 ml tüp kapasitesi, rcf 3.700 x g</td></tr><tr><td>Santrifüj, sabit açılı rotor</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>1.7 ml mikrosantrifüj kapasitesi, RCF 16.000 x g</td></tr><tr><td>50 ml konik santrifüj ve nbsp; tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>İdrar örnekleri için vidalı kapaklı</td></tr><tr><td>1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-755</td><td></td></tr><tr><td>Zamanlayıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>S04782</td><td>Saniye/dakika</td></tr></tbody></table>

düşük bolluk proteinler saptamak için plazma veya idrar hidrojel nanoparçacık hasat

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Roman biyomarkör keşif daha duyarlı ve özgül hastalık tespiti sağlayan çok önemli bir rol oynar. Biyolojik sıvılarda mevcut Ne yazık ki çok düşük miktardaki biyolojik göstergeler kolayca kütle spektrometrisi ya da çok düşük bir konsantrasyonda mevcut olan değişken ve çoğu zaman, albümin veya immünoglobülin gibi proteinler, yüksek miktardaki maskelendiğinden, çünkü bağışıklık ile tespit edilemez. Bait içeren poli (N-izopropil akrilamid) (Nipam) göre nanopartiküller bu fizyolojik engelleri aşmak mümkün. Bir adım olarak onlar yakalama konsantre ve vücut sıvılarından biyomarkerları korumak mümkündür. Düşük molekül ağırlıklı analitler nanopartikül çekirdeğini girip daha yüksek bir afiniteye proteini yemler etki gösteren farklı organik kimyasal boyalar tarafından yakalanır. Nanopartiküller büyüklükte birkaç emir tarafından ilgi proteinlerin konsantre edebiliyoruz. Bu konsantrasyon faktörü proteinleri içindedir böylece protein seviyesini yükseltmek için yeterlidirGeçerli Massenspektrometer, batı lekeleme ve immunoassay&#39;lerin saptama sınırı. Nanopartiküller biyolojik sıvıların bir bolluk ile inkübe edilebilir ve albümin ve diğer yüksek molekül ağırlıklı proteinler hariç ederken, büyük ölçüde düşük molekül ağırlıklı proteinler ve peptidlerin konsantrasyonu arttırmakta edebiliyoruz. Bizim veriler, belirli bir analit konsantrasyonunun 10,000 kez amplifikasyon önceden belirlenemeyen biyolojik işaretleri tespit etmek için kütle spektrometrisi ve immün sağlayarak elde edilebileceğini göstermektedir.

Hidrojel Nanoparçacık Boyutu ve tekdüzeliği Poli (Nipam-AAC) partikülleri ile kümeler içinde son derece yüksek verim ve üretkenlik ile üretilmiştir. Parçacıklar yakalama, depolama ve proteinlerin elüsyonu (en az 48 saat) için gerekli olan süre boyunca, oda sıcaklığında çok iyi bir stabiliteye sahip kolloidal ve nano partiküler çökeltme (Şekil 1) 11 gözlenmemiştir. Koloidal stabilite nanopartiküller ile hızlı bir şekilde, protein / peptid alımı içi...

Bazı patolojik biyobelirteçler, biyolojik sıvılardaki düşük konsantrasyonları, parçalayıcı enzimlerin varlığı ve büyük miktarlarda yüksek moleküler ağırlıklı proteinler nedeniyle mevcut tekniklerle kolayca tespit edilememektedir. Kimyasal olarak işlevselleştirilmiş hidrojel nanopartiküller, daha önce tespit edilemeyen biyobelirteçlerin tespit edilmesini sağlayan düşük bolluktaki proteinleri toplayabilir, koruyabilir ve konsantre edebilir.

Düşük Bolluk Proteinler saptamak için plazma veya idrar hidrojel Nanoparçacık Hasat

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Bu prosedürün genel amacı, biyolojik sıvılardan uygun konsantrasyonlarda düşük bollukta, düşük moleküler ağırlıklı biyobelirteçleri toplamak, konsantre etmek ve korumaktır. Standart protein tahlilleri için bu, önce biyolojik sıvıya, düşük moleküler ağırlığa kimyasal olarak işlevselleştirilmiş hidrojel nanopartiküllerin eklenmesiyle gerçekleştirilir. Analitler, nanopartikülün çekirdeğine girer ve yüksek afiniteli protein yemleri olarak işlev gören farklı organik kimyasal boyalar tarafından yakalanır.İkinci adım, partikülleri santrifüjleme ile biyoakışkandan ayırmaktır. Nanopartiküller, ilgilenilen proteinleri birkaç büyüklük sırasına göre yoğunlaştırır. Nanopartiküller daha sonra yabancı proteinleri uzaklaştırmak için su ile yıkanır.Son adım, yakalanan proteinleri nanopartiküllerden çıkarmaktır. Sonuç olarak, batı lekeleme, kütle spektrometresi veya amino tahlilleri, daha önce tespit edilemeyen hasat edilmiş düşük bolluktaki biyobelirteçlerin varlığını ve/veya konsantrasyonunu göstermek için kullanılır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, nanopartiküllerin yıkanması ve tekrar askıya alınması gerektiğinden mücadele edecektir.Pipet ucunu tıkamadan, nanopartiküller bir hücre kadar kolay bir şekilde tekrar süspansiyon yapmazlar P.So ilk inkübasyondan sonra nanopartikülleri yeterince tekrar askıya almak için kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetlemeniz gerekir. Nanopartiküllerle, tüpe yapışmış olabilecek herhangi bir nanopartikül kalıntısını toplamak için tüpün duvarlarını durulamak önemlidir. Serum örneklerinin nanopartikül işlemesini gerçekleştirmek için, 500 mikrolitre insan serumunu bir ila iki ila 50 milimolar tris, HCL pH yedi ile bir mikro santrifüj tüpünde seyreltin.500 mikrolitre poli ve isop propil akrilamid veya akrilik asit çekirdek nanopartiküllerinin poli nipam co monomerlerini ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Daha sonra numuneyi 10 dakika boyunca 16, 100 kez G ve 25 santigrat derecede döndürün. Sabit açılı bir rotor ile donatılmış bir santrifüjde, pelete 500 mikrolitre sodyum tiyosiyanat eklemeden önce SUP natini çıkarın ve atın, nanopartikülleri birkaç kez kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.Numuneyi daha önce olduğu gibi döndürün ve nanopartikül peletine 500 mikrolitre mili Q su eklemeden önce süpernatanı atın. Bir kez daha, resus, nanopartikülleri birden çok kez kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyerek askıya alır. Numuneyi tekrar döndürdükten sonra, gösterilen tekniği kullanarak 300 mikrolitre taze elusiyen, tampon ve yeniden süspanse ettim.Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Numunenin son bir dönüşünden sonra, EIT'yi çıkarın ve temiz, etiketli bir mikro santrifüj tüpünde saklayın. İkinci kez elute edin ve iki EIT'yi tek bir mikro santrifüjde birleştirin. İki.Ardından, EIT'leri nitrojen akışı altında ve hava akışı altıya ayarlanmış şekilde 42.1 santigrat derecede bir nitrojen buharlaştırıcı manifoldu altında kurutun. Kurutulmuş EIT'yi gece boyunca saklamak için oda sıcaklığında saklayın veya idrar örneklerinin nanopartikül işlemesini gerçekleştirmek için kütle spektrometresi Western blotting veya EISA tahlillerinden önce uzun süreli depolama için negatif 20 santigrat derece ekleyin. Minimum 22 mililitre hacim toplayın ve numuneleri analiz etmeye hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.Donmuş idrarı oda sıcaklığında veya gece boyunca dört santigrat derecede çözdürün. Çözüldükten sonra, bir girdap karıştırıcı üzerinde kısa bir süre karıştırın. Daha sonra 50 mililitrelik konik tabanlı polipropilen tüpe en az 22 mililitre idrar dökün.Daha sonra, idrarı, peleti rahatsız etmeden 15 dakika boyunca 3.700 kez G'de açılır rotorlu bir santrifüjde döndürün. İdrarı temiz bir 50 mililitrelik konik tabanlı polipropilen tüpe boşaltın ve peleti atın. Multianalit idrar çubuğu reaktif şeridi kullanarak idrar tahlili yapın.Reaktif şeridini yüzü yukarı bakacak şekilde temiz, kuru bir kağıt havlu üzerine yerleştirin. Bir mililitre idrarı aspire etmek için tek kullanımlık bir pipet kullanın. Reaktif şeridinin her bir test pedine hızlı bir şekilde bir ila iki damla idrar dağıtın.Reaktif şeridi kabında belirtilen zamanda daha önce iki dakikaya ayarlanmış bir zamanlayıcıyı hemen başlatın. Tek tek reaktif şeritlerinin rengini reaktif kabı üzerindeki karşılık gelen renk kodlu göstergelerle karşılaştırarak reaktif şeridindeki çeşitli analitler için kalitatif sonuçlarını kaydedin. Tipik normal idrar sonuçları, 5.5 ila 7.0 arasında bir pH ve 1.001 ila 1.020 arasında bir özgül ağırlık ile karakterize edilir.İdrar kan proteini, lökositler, nitrit, glikoz, keton, bilirubin ve ürobilinojen için negatif olmalıdır. Daha sonra, 20 mililitre arıtılmış idrarı temiz 50 mililitrelik konik tabanlı polipropilen tüpe aktarın. İdrarı çıkardığınız idrar tüpünün dibinde olabilecek herhangi bir kalıntı peletini rahatsız etmeyin.20 mililitrelik idrar örneğine 200 mikrolitre nanopartikül ekleyin ve bir girdap karıştırıcı üzerinde kısaca karıştırın. Daha sonra idrar nanopartikül karışımını sallanmadan veya karıştırmadan oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İdrar nanopartikül süspansiyonunu, 10 dakika boyunca 3.700 kez G'de açılır rotor ile donatılmış bir santrifüjde döndürün.Süpernatanı çıkarıp attıktan sonra, nanopartikül peletine 500 mikrolitre Milli Q suyu ekleyin. Birden çok kez kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyerek nanopartikülleri yeniden süspanse edin. Nanopartikül çözeltisini temiz bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın.Daha sonra, nanopartikülleri 10 dakika boyunca 16, 100 kez G'de sabit açılı bir rotor ile donatılmış bir santrifüjde döndürün. Bu adımları su ile tekrarlamadan önce süpernatanı çıkarın ve atın. Nanopartikülleri yıkamak için, nanopartikül peletine 20 mikrolitre taze elüsyon tamponu ekleyin ve nanopartikülleri birden çok kez kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Nanoparçacık peletini bozmadan ve süpernatanı temiz bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünde saklamadan snat çıkarmadan önce nanoparçacık örneklerini tekrar döndürün. Peletleri biyolojik tehlike çöp kutusuna atın.Numuneleri kimyasal davlumbazdaki bir rafa yerleştirin. Kapakları açın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Alternatif olarak, numuneleri kuruyana kadar 40 santigrat derecede nitrojen akışı altına yerleştirin.Numunelere 15 mikrolitre tris glisin SDS numune tamponu ekleyin. Kuru bir ısı bloğunda 100 santigrat derecede, kapaklar açıkken veya tüpte kalan hacim 20 mikrolitreden fazla olmayana kadar beş dakika ısıtın. Kapağı tüplerin üzerine yerleştirin ve tüpleri ısı bloğundan çıkarın.Numune eksi 80 santigrat derecede saklanabilir veya aşağı akış Western blot analizi için hemen kullanılabilir. Gümüş leke 1D jel elektroforezi, insan plazmasından nanopartikül yakalama ve tümör nekroz faktörü alfa konsantrasyonunu gösterir. Tümör nekroz faktörü alfa'yı temsil eden bant, yalnızca parçacıklar için P harfi ile gösterilen nanoparçacık EIT'lerinde bulunur, ancak süpernatant nanoparçacıklarda bulunmaz İki farklı kimyasal yem, akrilik asit veya VSA çekirdek kabuğu ile işlevselleştirilmiş, süpernatant ve nanopartikülün plazma batı lekelenmesinden çeşitli konsantrasyonlarda IL 17 toplayabilir.EIT, IL'nin 17.5 kilodalton bandında IL 17'nin varlığını açıkça göstermektedir, ancak süpernatanlar nanopartikülünde olmadığını göstermektedir. İdrar örneklerinin toplanması, bu gümüş lekeli SDS sayfasında bakteriyel antijenleri ve sitokinleri ortaya çıkarabilir. İdrar örneklerinin analizi: U dört ve U altı şeritlerindeki örnekler, RET, ESAT altı, bir mikobakteri tüberkülozu ile ilişkili protein ve IL iki A sitokini içeren idrar örneklerinden nanopartikül EIT'lerdir.Bu proteinler, 15 kilodaltonda öne çıkan bantlar tarafından gösterilir. Bu videoyu izledikten sonra, jel nanopartiküllerin biyolojik sıvılardaki düşük terk edilmiş biyobelirteçleri toplamak, konsantre etmek ve korumak için nasıl kullanılabileceğini ve aynı zamanda istenmeyen terk edilmiş molekülleri nasıl dışlayabileceğini ve böylece mevcut analitik yöntemlerin algılama hassasiyetini önemli ölçüde artırabileceğini iyi anlamalısınız.

hydrogel-nanoparticle-harvesting-plasma-or-urine-for-detecting-low

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu, insan serumu ile düşük molekül ağırlıklı proteinler ve peptitler selektif geri kazanımı için gözenekli silis ince film dayanan bir teknoloji geliştirilmiştir. Bizim gözenekli cips fiziko-kimyasal özellikleri ince peptid zenginleştirme önemli kontrolü sağlamak ve sonuçta tanısal amaçlı serum proteom profil ayarlı edildi.

Biyomarker Discovery için Mezogözenekli Silika İnce Filmler üzerine düşük molekül ağırlıklı Protein Zenginleştirme

Bu el yazması, modifiye edilmiş bir çökeltme tekniği kullanarak eksozomları insan idrarından izole etmek için bir protokolü açıklar.

Bir Modifiye Yağış Yöntemi İdrar eksozomlar yalıtmak için

Bu protokol, 30 dakika içinde 10 μL tam kandaki proteinlerin femto molar algılama duyarlılığının nasıl elde edileceğini göstermektedir. Bu, yüksek yüzey alanının yanı sıra gelişmiş sinyal-gürültü oranı için etkili karıştırma ve yıkama sunan bir disk üzerinde laboratuvara entegre edilmiş elektroeğrilmiş nanolifli matlar kullanılarak elde edilebilir.

Tüm Blood adlı ultrasensitive Protein Algılama için Tam Otomatik Santrifüj mikroakışkan Cihazı

Burada, exosomes plazma ve serum exosomal kan proteinleri azaltılmış ortak arıtma ile arındırmak için bir protokol mevcut. En iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı Ultrafiltrasyon, proteaz tedavi ve boyutu dışlama Kromatografi içerir. Exosomes yararları aşağı akım analizleri veziküller ve proteomik karakterizasyonu daha doğru miktar dahil olmak üzere, geliştirilmiş arıtma.

Protein sindirimi, Ultrafiltrasyon ve boyutu dışlama Kromatografi insan kan plazması ve Serum Exosomes yalıtım en iyi duruma getirmek için

Bu protokol enjekte edilebilir, supramoleküler polimer-nanopartikül (PNP) hidrojel biyomalzemelerin sentezini ve formülasyonlarını açıklar. Bu malzemelerin ilaç dağıtımı, biyofarmasötik stabilizasyon ve hücre kapsülleme ve teslimi için uygulamaları gösterilmiştir.

Hücre ve İlaç Dağıtım Uygulamaları için Enjekte Edilebilir Supramoleküler Polimer-Nanopartikül Hidrojelleri

Yüksek çözünürlüklü bir ışık sıvazlama aracı kullanarak bakteri hücrelerini izole etmek için fotobozunur hidrojellerin kullanıldığı bildirilmektedir. Sürecin temel deneysel prosedürleri, sonuçları ve avantajları gözden geçirilmiştir. Yöntem, heterojen topluluklardan veya popülasyonlardan nadir veya benzersiz işlevler gösteren hedeflenen bakterilerin hızlı ve ucuz izolasyon edilmesini sağlar.

Bakteri Taraması, Seçimi ve İzolasyonu için Fotobozunur Hidrojel Arayüzleri

Biyobelirteç progastrin salgılayan peptid (ProGRP) ile örneklenen kurutulmuş serum örneklerinden düşük bollukta biyobelirteçlerin belirlenmesi için bir protokol sunulmuştur. Antikor kaplı manyetik boncuklar, proteotipik bir ProGRP peptidinin seçici temizliği ve zenginleştirilmesi için kullanılır. Yakalanan peptit daha sonra sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi ile analiz edilir.

Düşük Bolluktaki Proteinlerin Hedeflenen Kütle Spektrometrisine Dayalı Protein Analizinde Mikro Örnekleme

Bu makale, insan plazmasından türetilmiş hücre dışı veziküllerin (EV) izolasyonu, karakterizasyonu ve miktar tayinifisi için bir metodolojiyi açıklar ve sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) kullanılarak EV proteomunun etiketsiz analizi için bir iş akışı sunar.

Kardiyovasküler Biyobelirteç Keşfi için Plazma Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Proteomik Analizi

Bu protokol, nanopartiküller üzerinde kişiselleştirilmiş protein korona profili için SDS-PAGE analizini standartlaştırır ve kansere özgü imzaların tekrarlanabilir, ölçeklenebilir ve düşük maliyetli tespitini sağlar. Pankreas kanaltel adenokarsinomunun erken teşhisi için tasarlanmış olan bu cihaz, hem araştırma hem de klinik ortamlarda karmaşık proteomik yöntemlere pratik, GÜVEN uyumlu bir alternatif sunar.

Erken Kanser Tespitinde Kişiselleştirilmiş Protein Korona Profilleme için Standartlaştırılmış SDS-PAGE İş Akışı

Çok yönlü bir plazma litografi tekniği hücresel eklenti rehberlik için sabit bir yüzey desenleri oluşturmak için geliştirilmiştir. Bu teknik, doğal dokuları taklit eden ve birçok farklı hücre tiplerinde eğitim için kullanılır olmuştur da dahil olmak üzere hücre ağları oluşturmak için uygulanabilir.

Plazma Litografi Yüzey Desenlendirme Hücre Ağları Oluşturma

Öğrenin, hidrojel nanoparçacıklar kullanarak plazma veya idrardaki düşük bolluklu proteinleri yakalama, yoğunlaştırma ve koruma yöntemini. Bu teknik, biyobelirteç tespit duyarlılığını artırarak tanısal analizleri geliştirir.

Düşük Bolluk Proteinler saptamak için plazma veya idrar hidrojel Nanoparçacık Hasat

Daha fazla video keşfet