Name: Bozulmamış Vomeronasal Organ ve Aksesuar Koku Ampul Ex Vivo Hazırlıklar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-04T23:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Öğrenin, fare vomeronazal organ ve aksesuar koku ampulünün fonksiyonel bağlantısını koruyan ex vivo preparasyon tekniğini. Bu yöntem, feromon işlemesi ve elektrofizyolojik kayıtlar için hassas disseksiyon adımlarını görsel olarak sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

, F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) ve UT Güneybatı başlangıç ​​fonları (JPM): Bu araştırma R00 DC011780 (NINDS, NIH JPM) tarafından desteklenmiştir.

Bütün deneyler, UT Güneybatı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokollere uygun olarak gerçekleştirildi ve deney hayvanları yaşadığı stresi, rahatsızlık ve ağrı en aza indirmek üzere seçilmiştir. 1.. Diseksiyon Odası Özel bir diseksiyon odası ve küçük, ince plastik tahta iyi sonuçlar (Şekil 1) için gereklidir. Bu protokolü teşebbüs önceden bu bir bölme ya da inşa elde edilir. 2.. Diseksiyon Çözümleri <ol><li> 3,22-5,4 adımda kullanılmak için standart yapay beyin omurilik sıvısı (CSF) 1 L hazırlayın. NaCl 125 mM, KCl 2.5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO 3 25 mM, NaH 2 PO 4 1.25 mM, miyo-inositol 3 mM, 2 mM sodyum piruvat, 0.4 mM sodyum askorbat ekleyin ve 25, glikoz mM pirojensiz su 1 L. </li><li> Için ilk diseksiyon aCSF (200 mi) Hazırlamaadımlarla 3,3-3,22 kullanabilirsiniz. Standart aCSF 200 ml alın ve MgCl2 heksahidrat 0.366 gr eklenerek 9 mM MgCI2 konsantrasyonu yükseltmek. </li><li> NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl2, 2 mM, MgCl2, 2 mM, NaHCO 3 25 mM, 10 mM HEPES ihtiva eden adım 4,11-5,4 kullanılmak için kanül yoluyla VNO uyarı yapmak için standart Ringer çözeltisi hazırlayın, 10 mM glukoz. </li><li> Balon, kullanıma kadar 15 dakika içinde en az 37 ° C su banyosu içinde% 95 O2,% 5 CO2 gazı ile standart aCSF ve Ringer 0.5 L 0.8 L. </li><li> Kabarcık% 95 O 2 ile ilk diseksiyon aCSF 200 ml, bu 4 ° C&#39;de 15-20 dakika süreyle buz üzerinde% 5 CO 2 gazı ulaşana kadar </li></ol> 3.. Birincil Diseksiyon <ol><li> Diseksiyon alanı hazırlayın. Üç adet 35 mm Petri kapları, koyun oksijenli aCSF, düz makas, Adson forseps, bir 11. derisi diseksiyon diseksiyon makas kavisli decapitation makas,el bıçak ve kolu ve buz üzerinde bir jilet. </li><li> Oksijenli aCSF 4 ° C&#39;ye soğuduktan sonra, derin 2-5 ml Isothesia (% 99.9 izofloran) kullanılarak bir kurutma odasında hayvan anestetize. Hayvan derinden anestezi sağlamak için kuyruk ve ayak tutam testleri gerçekleştirin. </li><li> Derin anestezi onaylandıktan sonra, hayvan başını kesmek ve hemen soğutulmuş diseksiyon aCSF ile dolu bir Petri tabağına yerleştirin baş. NOT: Kullanılmadığı zaman prosedür boyunca serin tutmak için soğuk diseksiyon aCSF içinde doku daldırın. </li><li> Bir kavisli makas ile alt yönü (ventral yutak, alt çene ve dil) sökün. </li><li> Adson forseps deglove (soyma) yüzeysel cilt ve kafatası kas ekleri kullanma. Peel rostral kaudal için gelen kafa derisi ekin sadece sitenin kadar ön dişlerin bitti. Bir kavisli makas kullanılarak bağlanma noktasındaki doku kesilir. Forseps ile tutarak gözleri çıkarın ve hazırlık onu uzağa çekin. Nkulak degloving prosedürün sonunda, üst çene kemikleri serbest kas ekleri Adson forseps kullanarak hassas burun kıkırdak üzerine aşırı kuvvet kaçının. NOT: düz makas ile kafatası kaudal kafa derisi ayırın. </li><li> Makas uçları (hemen önce burun sinüs) frontal kemik içine bir kaç mm kadar düz makas ile, rostral kaudal için gelen kafatasının orta hatta aşağı kesti. </li><li> Adson forseps kullanarak kafatasının parietal ve frontal kemiklerin çıkarın. NOT: frontal kemik parçaları sıklıkla burun sinüs kuyruk burun kemiklerinin bağlı kalacaktır. Koku ampuller temas etmemesine özen, bu parçaları çıkarın. </li><li> Sinüsler frontal lob 2 mm kuyruğu ile koronal kesim yapmak ve daha sonra kesim için beyin caudal kaldırmak için neşter kullanın. Tamamen arka doku koparmaya neşter kişiler ventral kafatası kemik kontur ucu sağlamak. NOT: Bu sağlaryanal koku yollarına veya koku ampuller üzerinde mekanik stres koymadan beynin çoğunluğunun çıkarılması. </li><li> Düz makas ile ventral kafatası maruz kaudal yönlerini çıkarın. Sinüsler ve kalan sinir dokusunu bırakın. </li><li> Düz makas kullanarak kafatasının anatomik sağ tarafında elmacık kemer ve yüz kasları kaldır </li><li> Ağız çatı açığa (ventral yüzü yukarı) dudağını ters çevirin. </li><li> Kesme ve azı dişleri damak hemen kaudal kaldırın. Ağız çatı damak paralel altında neşter bıçak ucu takarak bunu yapın ve sonra ön dişler doğru bıçak taşımak. </li><li> Adson forseps ile damak serbest (rostral) kenarından kavrayın ve kaudal çekerek çıkartın. </li><li> Kafatasının anatomik sol tarafta, azı dişleri yakın küçük foramenden başlayarak, caudally palatin foramen uzatmak için neşter bıçağı kullanın. Neşter bla ucu takarak bunu başarmakazı dişleri yakın boşluğa de ve bileği dönen. NOT: bıçağın ucu kullanın sadece aşırı dikkatli olun - derin bir kesik septal doku zarar verebilir. </li><li> Anatomik sol vomeronasal organ rostral başlayarak, kesici dişlerin üzerinden palatin foramen kesilen neşter bıçak ucu, kullanma. Birden puanlama kesim kullanın. Çok derin bıçak sokarak septal doku ve vomeronasal sinirlere zarar vermeyin. </li><li> Böylece dorsal kafatası yukarı bakacak doku açın ve daha sonra hazırlık kaudal kenarında dikey düz jilet (orta hatta paralel) yönlendirin. </li><li> Doku ventral kenarında, hemen orta hat solundaki tıraş bıçağının kesici kenarı dokunun. Yavaşça bıçak kaya ve sol palatin foramen (Adım 3.14 tanıtıldı bölgeyi kesilmiş) birlikte hareket. </li><li> Doku dorsal kenarında, hemen orta hat solundaki (1 mm den daha az) için tıraş makinesinin kesme kenarı yerleştirin. </li><li> Korumabıçak dokusunun öne doğru bir baskı ile yavaşça jilet kaya, orta hatta paraleldir. Kribriform plaka direnç edin. Bu direnci kırarak hemen sonra durdurun. NOT: Bu noktada, sağ hemisfer sol yarımkürede ayrılabilmektedir. Geriye kalan tek bağlantısı kribriform plakasına dorsal anterior burun boyunca hemisfer arasında olduğunu. </li><li> Eldivenli parmakları ile kuyruk tarafı yakınında onları tutup hafifçe yanal ve öne çevirerek yarıküreyi ayırın. Not: Bu adım özellikle sapmış ya da kırılgan snouts (örneğin, büyük fareler) ile farelerde deneysel değişkenliği kaynağıdır. Ayrıca, güçlü direnç bağ dokuları zayıflatmak için dorsal burun (cribriform plaka anterior) puan karşılaştı ise, birbirinden uzak yarımküresini döndürmek için çalışırken. Bunu yaparken, septal ti zarar verebilir ki, derin neşter eklemek için değil aşırı dikkat çekmekssue ve vomeronasal sinirler. </li><li> Tahta doku yapıştırıcı küçük bir miktar (50-100 ul) uygulayın ve nazikçe Adson forseps kullanarak tutkal üzerine sağ yarımkürenin yan kenarını yerleştirin. Tahta zamanından önce tutkal polimerizasyonu ve gevşek yapışmasını önlemek için bir kağıt havlu kullanarak hazırlık yan tarafındaki aşırı nem çıkarın. Not: doku yapıştırıcısı üzerine yerleştirilir sonra tutkal Polimerleşme işlemini hızlandırmak için, numune üzerinde soğutulmuş diseksiyon aCSF birkaç damla uygulayın. Bu, doku tahta sıkıca tutulan kalmasını sağlar. </li><li> İkincil diseksiyon bölmenin ortasında vakum yağ, az miktarda (3-5 mm çapında, derinlik 2 mm) koyun ve sıkıca yağ karşı doku ters tahta tarafına yerleştirin. Hemen ince diseksiyon alanına transfer ve oksijenli standart aCSF ile perfüzyon başlar, soğuk diseksiyon aCSF ile diseksiyon odasını doldurmak. Koku ampul doğrudan böylece tahta Orienttaze oksijenli standart aCSF akışı. </li></ol> 4. İkincil Diseksiyon <ol><li> Ince forseps kullanarak hazırlanmasından görünür bir taraftaki (sol) koku ampul veya kortikal doku çıkarın. (A yarı kör nokta oluşturan) ince forseps birlikte Kıstırma ve daha sonra orta hatta yakın dorsal ve doku kuyruk kısmına yerleştirin. Nazikçe öne hareketi yavaş yavaş sağ yarımkürede doku soyulması, orta hat boyunca sıkışmak forseps çalıştırın. Kontralateral koku soğanı dokusu da dahil olmak üzere, karşı doku tüm çıkarın. AOB veya vomeronasal sinirine zarar verebilir doku aracılığıyla bıçaklamak için değil aşırı özen gösterin. </li><li> Koku ampul / dorsal medial yüzeyi boyunca beyaz dura mater gözlemleyin. Ince forseps iki çift ile duranın bembeyaz kısmında tutarak koku ampul / dorsal kaudal kenarında bu dura mater gözyaşı ve uzak bu noktadan onları çekin. Dura sıkı birkoku ampuller sarılı ve kaldırılması edilirken kolayca kendisi dokusu ile dilim olabilir. Koku ampul ve AOB kendisinin orta yüzeyine zarar kaçının. NOT: dura bu noktada kolayca yırtarak direnirse, ayrılmasını kolaylaştırmak için ince yay ucu diseksiyon makas ile küçük bir kesim tanıtmak. </li><li> Yavaş ve dikkatli bir şekilde yatan koku ampuller zarar vermeden ince forseps ile frontal korteks soymak. AOB hemen kaudal bir yarı-saydam net olarak görülen kan damarlarının bir koleksiyon gözlemlemek. Elektrofizyolojik deneylerde elektrot penetrasyonunu kolaylaştırmak için ince forseps ile bu net çıkarın. Frontal korteks geri çekilmesi sırasında AOB ayıran olarak forseps ile net kavrayın ve AAM dokunmamaya dikkat ederek, kaudal ve medial çekerek çıkarın. Frontal korteks, koku soğanı ayrılmış sonra, AOB için ventral ve posterior forseps ile keserek çıkarın. NOT: ex alınçok kabaca yapılır ise net kaldırılması ile dikkat treme için glomerüler katman hasar olabilir. </li><li> Maruz karşı burun boşluğunda, ince forseps kullanarak kalan taraf septal doku (kan damarlarını içeren çürük sarımsı tabaka) çıkarın. (Septal kemiği yakınında) kaudal / dorsal bölgedeki dokuyu tutun ve sonra ön tarafına doğru dokusu asansör / çekin. NOT: taraftaki septal doku yanlışlıkla hemiseksiyona adım (Adım 3.20) sırasında kaldırılabilir. Böyle bir durumda, beyaz bir avasküler septal kıkırdak ve hafif şeffaf, vaskülarize septal kemik görüyoruz. Bu durumda, Adım 4.4 atlanabilir. </li><li> Dikkatle septal kıkırdak ve VNO &quot;kanat&quot; (her ikisi de VNOs dorsal kenarı boyunca uzanan kemik dokusunun ince bir parça arasındaki ince forseps tek bir noktadan çalıştırarak kontralateral VNO çıkarın. <ol><li> Kıkırdak kanat dekolmanı ardından, ventral olarak forseps ucu taşımakorta hatta yakın kontralateral VNO içine. Forseps ile açgözlü ve uzak kaldırarak kaldırılacak etkinleştirme, gevşetmek için kontralateral VNO rostral / kaudal ekseni boyunca çeşitli yerlerde bu adımı tekrarlayın. </li></ol></li><li> Ince forseps ile kuyruk / ventral kenarında bir kesim (bu septal kemiğin ventral kenarında beyaz bir avasküler şerit çalışan daraltır nerede) yaparak septal kıkırdak çıkarmak için hazırlayın. </li><li> Yarı kör noktaya yapmak için bir araya ince forseps sıkarak septal kıkırdak çıkarın. Adım 4.6 yapılan kesim belirlemek, bu kesim için (lateral) arkasında sıkışmak forseps yerleştirin ve sonra yavaş yavaş septal doku ve rostrally devam kıkırdak kaldırın. NOT: altta yatan septal doku bozabilir etmeyin. Kıkırdak kaldırdı olarak, nedeniyle kıkırdak gevşek yapışıklıklar septal doku streç yatan sayfasını gözlemlemek. Gevşek a bu sitede boyunca sıkışmak ince forseps bir, periyodik nazik ve kararlı hareketdhesion büyük ölçüde iki yapıların başarılı ayrılmasını kolaylaştırır. </li><li> Septal kemiği kaldırmak için bir bükülmüş ucu ile 3. forseps bir çift kullanın. Bir açıyla septal kemik Yaklaşım yaklaşık septal kemik düzlemine paraleldir. Septal doku ve septal kemik arasındaki kavisli tine yerleştirin. Forseps ile kemik kavrayın ve yavaşça cribriform plaka yakınında çatlaklar kadar geri ve ileri kemik taşıyın. NOT: Bazı durumlarda, septal kemik cribriform plaka yakın kırılma direnecektir. Bu durumda, hafifçe sadece Adım 4.8 tekrarlayın sonra, kribriform plaka anterior dorsal / ventral eksen boyunca septal kemik puan ince forseps kullanabilir. </li><li> Girişinde ince forseps bir çift kısma ve ince forseps başka bir çift ile rostrally çekerek sadece VNO rostral beyaz kıkırdak çıkarın. </li><li> Hızlı bir perfüzyon cihazına polimid kanül takın ve poliimid kanülden Ringer çözeltisi (0.1-0.3 ml / dak) ve akış başlar.NOT: Bir sıralı, küçük hacimli akış ölçer ile ölçün akış hızı. Bilgisayar kontrollü pnömatik uyarıcı anahtarlama cihazının kullanımı uyarılması sırasında akış hızı değişiklikleri azaltır. Yanıtları uyaran özel sağlamak için sahte bir uyarıcı (Ringer çözeltisini kontrol) yanıtları ile uyaranlara test sinir yanıtları karşılaştırın. </li><li> VNO girişinde kanül paralel yönlendirin. Kanül tatmin edici VNO girişine paralel olduğunda çıkış basıncı VNO neden olarak, kan damarının tahliye lider &quot;şişirmek,&quot; izlemek. Hemen bu VNO açıklığına paralel kalır, böylece kanül sabit açısını tutarak, VNO içine kanül yerleştirin. NOT: Bu plastik tahta karşı ince forseps bir çift kanül tutun ve hafifçe yukarı açıya kanül ucu ince forseps başka bir çifti kullanmak yararlı olabilir. Biri yanlışlıkla VNO arkasında kanül yerleştirir eğer, çıkış da VNO kan damarı neden olabilirtahliye, uygun bir kanülasyon yapıldı izlenime yol açar. Uygun yer Ringer çözeltisi içinde bir boya dahil edilmesi ile kontrol edilebilir. Kanül düzgün yerleştirilmiş olduğunda, boya sadece gerektiği VNO girişinde yoluyla çıkış. Ayrıca, bir kanül VNO yarı saydam medial üzerinden kolayca görülebilir sağlayarak uygun yerleştirme onaylamak olabilir. </li><li> AOB VNO gelen kanül çıkarmak için dikkatli olmak, standart aCSF doğrudan akış gelene kadar yavaş yavaş plastik tahta taşıyın. Diseksiyon tamamlandı ve fizyolojik fonksiyonunun değerlendirilmesi hemen başlaması olabilir. Adım 5 kısa bir süre böyle bir değerlendirme yapmak için bir yaklaşımı tarif eder. </li></ol> 5.. Değerlendirme <ol><li> Hücre dışı bir amplifikatör ve osiloskop bağlanmış bir 2-4 MQ borosilikat cam mikro elektrot ile AOB yüzeyini nüfuz. </li><li> Yavaşça 100-200 um&#39;lik bir derinliğe kadar mikroelektrot ilerlemek50 mm / dk &#39;lık bir hızda bir yüzey. NOT: Bu doku derinlikte, bir mikroelektrot gerilim keskin, kısa (~ 1-2 msn) deplasmanlar ile örneklenen arada spontan aksiyon potansiyeli dalga formlarını karşılaşacak. </li><li> Aksiyon potansiyeli dalga biçimi karşılaşmak üzerine, mikroelektrot ilerleyen durdurun. </li><li> Dikkat ve / veya VSN aktivitesi bilinen bir aktivatörü (örneğin, 50 mM KCI ihtiva eden Ringer çözeltisi) için kontrol Ringer arasındaki teşvik teslim solüsyonu değiştirirken aksiyon potansiyeli oranı kaydedin. Diseksiyon başarılı olursa, aksiyon potansiyeli oranı veya yerel alan potansiyel bir uyarıcı bağımlı değişimi görülebilir. Not: Tüm AOB nöronlar (50 mM KCI ihtiva eden Ringer çözeltisi de dahil olmak üzere) ateşleme hızındaki bir artış ile, her uyarana yanıt verir. Ateşleme hızında bir uyarıcı bağımlı azalma da fonksiyonel bağlantı ve başarılı bir diseksiyon gösterir. İki ya da daha fazla nöron karşılaşılan durumunda buVNO stimülasyon yanıt vermeyen, ya da herhangi bir aksiyon potansiyelleri çoklu elektrot sızmalar sonra gözlenir, bu başarısız bir diseksiyon göstermektedir. Bu durumda, yeni bir diseksiyon Kademe 3 de başlatılabilir. </li></ol>

<ol><li>Bruce, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+exteroceptive+block+to+pregnancy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An exteroceptive block to pregnancy in the mouse.</a> Nature. 184, 105(1959).</li>
<li>Bellringer, J. F., Pratt, H. P., Keverne, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+vomeronasal+organ+and+prolactin+in+pheromonal+induction+of+delayed+implantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Involvement of the vomeronasal organ and prolactin in pheromonal induction of delayed implantation in mice.</a> J Reprod Fertil. 59, 223-228 (1980).</li>
<li>Bean, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+agonistic+behavior+by+the+dual+olfactory+system+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Modulation of agonistic behavior by the dual olfactory system in male mice.</a> Physiol Behav. 29, 433-437 (1982).</li>
<li>Meredith, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vomeronasal+organ+removal+before+sexual+experience+impairs+male+hamster+mating+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Vomeronasal organ removal before sexual experience impairs male hamster mating behavior.</a> Physiol Behav. 36, 737-743 (1986).</li>
<li>Hendrickson, R. C., Krauthamer, S., Essenberg, J. M., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+shapes+sex+selectivity+in+the+mouse+accessory+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibition shapes sex selectivity in the mouse accessory olfactory bulb.</a> J Neurosci. 28, 12523-12534 (2008).</li>
<li>Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+vomeronasal+stimulation+reveals+sensory+encoding+of+conspecific+and+allospecific+cues+by+the+mouse+accessory+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2010).</li>
<li>Tolokh, I. I., Fu, X., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+sex+and+strain+discrimination+in+the+mouse+vomeronasal+organ+and+accessory+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reliable sex and strain discrimination in the mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 13903-13913 (2013).</li>
<li>Luo, M., Fee, M. S., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+pheromonal+signals+in+the+accessory+olfactory+bulb+of+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Encoding pheromonal signals in the accessory olfactory bulb of behaving mice.</a> Science. 299, 1196-1201 (2003).</li>
<li>Binns, K. E., Brennan, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+electrophysiological+activity+in+the+accessory+olfactory+bulb+and+medial+amygdala+associated+with+mate+recognition+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Changes in electrophysiological activity in the accessory olfactory bulb and medial amygdala associated with mate recognition in mice.</a> Eur J Neurosci. 21, 2529-2537 (2005).</li>
<li>Leszkowicz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noradrenaline-induced+enhancement+of+oscillatory+local+field+potentials+in+the+mouse+accessory+olfactory+bulb+does+not+depend+on+disinhibition+of+mitral+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Noradrenaline-induced enhancement of oscillatory local field potentials in the mouse accessory olfactory bulb does not depend on disinhibition of mitral cells.</a> Eur J Neurosci. 35, 1433-1445 (2012).</li>
<li>Ames, A. 3r, Gurian, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Recordings+from+Isolated+Mammalian+Retina+Mounted+as+a+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Electrical Recordings from Isolated Mammalian Retina Mounted as a Membrane.</a> Arch Ophthalmol. 70, 837-841 (1963).</li>
<li>Flock, A. F., Strelioff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+hair+cells+in+isolated+coils+from+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Studies on hair cells in isolated coils from the guinea pig cochlea.</a> Hear Res. 15, 11-18 (1984).</li>
<li>Woodbury, C. J., Ritter, A. M., Koerber, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+anatomy+of+individual+rapidly+adapting+low-threshold+mechanoreceptors+innervating+the+%27hairy%27+skin+of+newborn+mice%3A+early+maturation+of+hair+follicle+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Central anatomy of individual rapidly adapting low-threshold mechanoreceptors innervating the 'hairy' skin of newborn mice: early maturation of hair follicle afferents.</a> J Comp Neurol. 436, 304-323 (2001).</li>
<li>Llinas, R., Muhlethaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electrophysiological+study+of+the+in+vitro%2C+perfused+brain+stem-cerebellum+of+adult+guinea-pig%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">An electrophysiological study of the in vitro, perfused brain stem-cerebellum of adult guinea-pig.</a> The Journal of physiology. 404, 215-240 (1988).</li>
<li>Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formyl+peptide+receptor-like+proteins+are+a+novel+family+of+vomeronasal+chemosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors.</a> Nature. 459, 574-577 (2009).</li>
<li>Meeks, J. P., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+preparation+of+the+intact+mouse+vomeronasal+organ+and+accessory+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An ex vivo preparation of the intact mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb.</a> J Neurosci Methods. 177, 440-447 (2009).</li>
<li>Leinders-Zufall, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Nature. 405, 792-796 (2000).</li>
<li>Kato, H. K., Chu, M. W., Isaacson, J. S., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+sensory+representations+in+the+olfactory+bulb%3A+modulation+by+wakefulness+and+experience%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Dynamic sensory representations in the olfactory bulb: modulation by wakefulness and experience.</a> 76, 962-975 (2012).</li>
<li>Meeks, J. P., Arnson, H. A., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+and+transformation+of+sensory+information+in+the+mouse+accessory+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Representation and transformation of sensory information in the mouse accessory olfactory system.</a> Nature. 13, 723-730 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa ilgilendiren önemli çatışmalar var.

Bu protokol açıklanan VNO-AOB ex vivo hazırlık vivo 5-7 ve akut canlı dilim AOB fonksiyonu 17 deneyleri anestezi için kullanışlı bir alternatif. Ayrıca elektrofizyolojik ve optik kayıtlar için devre elemanlarını maruz akut AOB dilim deneylerde, aksine, bu hazırlık tüm duyu ileticileri ve intra-AOB bağlantıları korur. Bu da vivo yaklaşımlar anestezi söylenebilir rağmen, anestezik varlığı mutlaka bu ve diğer koku devrelerde 18 bilgi işlem için çok önemli...

Memeli beyninde, duyusal, duyusal işlem tipik olarak girişten belirli özelliklerini belirler, her biri, çok sayıda karşılıklı olarak bağlantılı nöronal devrelerin kapsamaktadır. Duyusal yollar, erken bilgi işleme, normal algı ve davranış için hayati önem taşımaktadır. Aksesuar koku alma sisteminin (AOS) olarak, aksesuar koku ampul (AOB) hormonal dengeyi 1,2, saldırganlık 3 ve uyarılma 4 dikte aşağı yapıların duyusal çevreye bağlayan temel nöral devresidir. Bu nedenle, bu devre içinde bilgi işlem güçlü bir hayvan davranış değişiklikleri ile bağlantılıdır. Aksesuar koku alma ampul yoğun altındaki ana koku ampul (MOB) dorsal / kuyruk / posterior yönü de fareler ve sıçanlarda bulunan, burun sinüs vaskülarize. AOB vomeronasal organ (VNO) ikamet periferik vomeronasal duyusal nöronların (VSNs) aksonları afferent innervasyon alır, bir küçükSadece yumuşak damak yukarıdaki ön burun l kör uçlu tüp. Bu aksonlar nazal pasajların medial sınırında septal doku hassas levha dolaşırlar. Çeşitli çalışmalar anestezi fareler 5-7 veya özgürce keşfetmek hayvanları 8 kullanarak in vivo (örneğin fare idrar gibi) AOS kokuların kaynaklarına AOB sinir tepkiler problanmıştır var. Kahramanca (a) tracheotomies uçucu olmayan kokuları tanıtmak için derin anestezi sağlamak ve sıvı uyaranlara 5-7 aspirasyon önlemek, servikal sempatik ganglion 6 veya vomeronasal organın 5,7 doğrudan kanülasyonu (b) stimülasyon için ilgili in vivo çalışmalar anestezi ve (c) frontal lob ablasyon olan veya olmayan cerrahinin AOB 6 içine elektrot ilerleme sağlamak için. Uyanık / Çalışmalar Microdrive 8-10 dahil cerrahi implantasyon davranıyor. Özetle, bu deneysel paradigmalar güçlü, ama son derece zordur ve genellikle anestezi gerektirir. 11-15 ile vücudun (ex vivo) dışında canlı duyusal yapıları ve alt sinir devreleri korumak için çalıştı. VNO ve AOB arasındaki bağlantıları ipsilateral kalır ve ortadaki septal doku tek bir yarımkürede oksijenli superfusate maruz olabilir, çünkü biz onların fonksiyonel bağlantı korurken bu yapıların izole etmek için böyle bir tek hemisfer ex vivo yaklaşım geliştirmeye çalıştı çünkü. Biz son zamanlarda bu hedefe 16 almayı başardı. (Orta hat yumuşak septal doku birlikte) akson ve AOB hem oksijenli yapay beyin omurilik sıvısı (superfused erişilebilir 600 mikron özellikleri &lt;nispeten sığ olduğu için 6 saat - Bu hazırlık VNO ve AOB canlı ve fonksiyonel en az 4 için bağlı iki tutar aCSF). Bu VNO-AOB ex vivo hazırlık ince bir kanül yoluyla VNO doğru kontrollü uyaranların girişine izin verir, vehedeflenen elektrot yerleştirme ve / veya canlı floresan mikroskobu için küçük AOB doğrudan görsel erişim. Bir anestetik yokluğunda, bu devrelerin çalışma istediği, bu yöntem avantajlıdır. Bu yaklaşım, santrifüj bağlantıları koparır, çünkü iyi AOB fonksiyon santrifüj modülasyonu içine sorularınız için uygun değildir. VNO-AOB ex vivo hazırlama öğrenmek zordur, ama bir kez elde bu güçlü duyusal devrede devre organizasyon, bilgi işleme ve nöral plastisite araştırmak için bunun üzerine güvenilir bir platform oluşturur.

<table><tbody><tr><td>Düz Makas</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>İnce Makas-Düz</td> Güzel <td>Bilim Aletleri</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>İnce Makas-Kavisli</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Adson Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>#3 Neşter Saplı</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>#11 Neşter Bıçakları</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>Düz Karbon Çelik Tıraş Bıçağı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri Kabı</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-21</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon</td><td>Odası Özel&nbsp;</td><td>N/A Bkz</td>. <td><güçlü>Şekil 1</güçlü></td></tr><tr><td>Delrin plastik tahta 0,6 cm x 1,5 cm x 0,1 cm</td><td>Özel&nbsp;</td><td></td><td></td>Yok</tr><tr><td>Dow Corning Silikon Vakum gresi</td><td>Fisher Scientific</td><td>146355D</td><td></td></tr> <tr><td># 5 Forseps, Öğrenci</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>91150-20</td><td></td></tr> <tr><td># 5 Forseps, Biyoloji Ucu</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11295-10</td><td></td></tr> <tr><td># 5 Forseps, Öğrenci</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Bahar Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>1/16 "Erkek Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-00</td><td></td></tr><tr><td>1/16" Boru</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171-129</td><td></td></tr><tr><td>İki tonluk epoksi</td><td>Grainger</td><td>5E157</td><td></td></tr><tr><td>ValveBank Basınçlı Perfüzyon Kiti</td><td>AutoMate Scientific</td><td>09-16</td><td></td></tr><tr><td>ValveLink dijital/manuel kontrolör</td><td>AutoMate Scientific</td><td>01-18</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2 hekzahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>çeşitli<</td><td></td></tr><tr><td>em>myo-inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>Na-piruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>Na-askorbat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tamponu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>çeşitli</td><td></td></tr></tbody></table>

bozulmamış vomeronasal organ ve aksesuar koku ampul ex vivo hazırlıklar

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Mouse aksesuar koku alma sistemi (AOS) kalıcı sosyal koku, feromonlar ve Kayromonlar tespit için özel bir duyusal yoludur. AOS yolunda ilk nöral devre, aksesuar koku ampul (AOB), bu tür bölgesel saldırganlık ve çiftleşme gibi seks-tipik davranışları kurulmasında önemli bir rol oynar denir. Bu küçük (&lt;1 mm 3) Devre böyle conspecifics salgıları ve dışkı içinde kimyasal duyusal ipuçlarının seks, gerginlik ve stres gibi benzersiz davranış durumları, ayırt etme kapasitesine sahiptir. Bu sistemin organizasyonu aynı zamanda kompakt bir devrenin büyük bölümleri kayıt için benzersiz bir fırsat sunmaktadır da, AOB duyusal işleme araştırılması büyük ölçüde beyindeki deneysel olarak dezavantajlı bir konuma, zor olmaya devam etmektedir. Burada, bağlantı bırakarak anterior fare kafatası tek bir yarıküre içindeki, dokunulmamış AAM kaldırır çok aşamalı bir diseksiyon göstermekher ikisi de çevresel vomeronasal duyu nöronları (VSNs) ve lokal nöronal devre sağlam için iyonları. Prosedür anestezik yokluğunda elektrofizyolojik ve AOB devre elemanlarının optik kayıt kolaylaştıran, görsel muayene yönlendirmek için AOB yüzeyi ortaya koyar. AOB içinde aşağı aktivite kaydederken VSNs evler vomeronasal organ (VNO), içine ince bir kanül yerleştirdikten sonra, biri doğrudan sosyal koku ve feromonlar çevresini açığa çıkarabilir. Bu prosedür, davranış değişiklikleri feromon maruz bağlantı mekanizmalarına ışık tutabilecek, AOS bilgi işlem kontrollü olarak soruşturma sağlar.

Bu hazırlık ile başarıya ulaşmak geniş uygulama alır ve başarısız hangi birkaç adım vardır. Bir başarıya ulaşmak önce birçok deneme gerektirebilir beklemesin. Özel diseksiyon odası bu protokolün başarıyla tamamlanması için gerekli olan ve önceki diseksiyon sonraki aşamalarını başlamadan alınmalıdır. Şekil 1'de sunulan odası tasarımı bu amaç için yeterlidir, ve en az işleme talepleri ile nispeten ucuz plastikten yapılabilir. Böyle bir bölmeyi üretmek için kapasite yoksa, yerel veya çevrimiçi işleme şirke...

Fare aksesuar koku ampul (AOB) duyusal kodlama bağlamında çalışma zor olmuştur. Burada, biz AOB nöronlar fare feromonlar ve Kayromonlar bir bilgi işleme araştırmalarını kolaylaştırmak, onların çevresel girişlerine işlevsel bağlı kaldığı bir ex vivo hazırlık üreten bir diseksiyon göstermektedir.

Bozulmamış Vomeronasal Organ ve Aksesuar Koku Ampul Ex Vivo Hazırlıklar

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Bu prosedürün genel amacı, fonksiyonel olarak bağlı fare ro nazal organının veya VNO'nun, bir aksesuar koku ampulünün veya bir OB'nin ex vivo bir preparatını üretmektir. Bu, ilk önce burun ve koku soğancığının tek bir yarım küresini izole etmek için fare kafatasının kaba bir diseksiyonu yapılarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, hassas VNO aksonları ve bir OB, bir doku perfüzyon odasında ikincil bir diseksiyon yoluyla açığa çıkarılır. Son olarak, VNO'ya koku ve uyaranın sokulabileceği ince bir kanül yerleştirilir.Sonuç olarak, VNO stimülasyonu sırasında A OB içindeki nöral aktiviteyi ölçmek için elektrofizyolojik kayıtlar kullanılabilir. Bu tekniğin in vitro kesit elektrofizyolojisi gibi mevcut tekniklere göre avantajı, bu teknikle duyu organı ve aşağı akış nöral devrelerinin işlevsel olarak bağlı kalmasıdır. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü öğrenmesi zor olan birçok hassas diseksiyon adımı vardır ve bu adımlardan herhangi birindeki hatalar başarısız bir diseksiyonla sonuçlanabilir Birincil diseksiyona başlamak için, önce farenin kafatasının parietal ve frontal kemiklerini çıkarmak için Addin forseps kullanın, koku soğancıklarıyla temas etmemeye dikkat edin.D

ex-vivo-preparations-intact-vomeronasal-organ-accessory-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Multielectrode array (MEA) kayıtları nöronların büyük nüfus elektriksel aktivite eğitimi için bir yöntem sağlar. Burada, aynı anda doku uyarıcı fare vomeronasal epitel kayıt MEA hazırlanması ayrıntılar mevcut.

Vomeronasal Epitel Multielectrode Dizi Kayıtlar

Farelerde, feromonları algılamak için yeteneği esas vomeronasal organ (VNO) tarafından aracılık eder. Burada, kalsiyum görüntüleme yapmak için VNO akut doku dilim hazırlık açıklanmıştır. Bu fizyolojik bir yaklaşımdır alt popülasyonlar ve / veya bireysel nöronlar gözlemleri yaşayan bir doku sağlar ve reseptör-ligand tanımlanması için uygundur.

Görüntüleme Feromon Fare Vomeronasal Akut Doku Dilim Hazırlama içinde Algılama

Vomeronazal organ (VNO), sosyal ve üreme bilgilerini ileten tür içi kimyasal sinyalleri tespit eder. VNO dokusunda G-CaMP2 eksprese eden transgenik fareler kullanarak Ca2+ görüntüleme deneyleri gerçekleştirdik. Bu yaklaşım, vomeronazal nöronların çok sayıda feromon uyarısına verdiği karmaşık yanıt modellerini analiz etmemize olanak tanır.

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

Bu video, bir fare vomeronazal organının (VNO) izolasyonunu ve vibratom kesiti için doku hazırlığını özetlemektedir. Bölümler, belirli bir duyusal nöron grubunun biyofiziksel ve fizyolojik özelliklerini karakterize etmek için kullanılır.

Vibratom kesiti için fare vomeronazal organının hazırlanması

Bu video, farelerde koku alma duyusal nöronlarının (OSN'ler) delikli bir yama kelepçesi tekniği kullanılarak elektrofizyolojik kaydını göstermektedir. Florofor etiketli koku reseptörlerine sahip OSN'leri içeren koku alma epiteli, bir fareden izole edilir ve bir kayıt odasında sabitlenir. Bir kayıt pipeti, bir OSN'nin dendritik topuzuna kenetlenir ve pipet içindeki nistatin, hücre ile elektriksel bağlantı oluşturmak için zarı deler. Son olarak, bir koku uyarıcısı vermek için başka bir pipet...

Farelerde Koku Alma Duyu Nöronlarının Delikli Yama-Kelepçe Kaydı

Protokol videosu, farelerde vomeronazal organın (VNO) duyusal nöronlarından elektrofizyolojik kayıt için bir tam hücre yama kelepçesi oluşturmayı açıklar. Floresan olarak işaretlenmiş duyusal nöronlara sahip bir koronal VNO dilimi, bir kayıt kurulumuna yerleştirilir. Etiketli bir nöron, kimyasal uyaranlara yanıt olarak elektrofizyolojik kayıt için tüm hücre konfigürasyonunda bir kayıt pipeti ile yamalanır.

Vomeronazal Duyusal Nöronlardan Elektrofizyolojik Kayıt için Tam Hücre Yama Kelepçesi Oluşturulması

Korunan Anatomik Örgütü ile bozulmamış Fare Burun Doku hazırlamak için etkili bir Manuel kemik sıyırma Yöntemi

Koku alma duyusal nöronlarının fizyolojik özelliklerini analiz etmek hala teknik sınırlamalarla karşı karşıyadır. Burada, gen hedefli farelerde koku alma epitelinin sağlam bir preparasyonu içinde delikli yama klempi yoluyla kaydediyoruz. Bu teknik, membran özelliklerinin karakterizasyonuna ve tanımlanmış koku alma reseptörlerini eksprese eden nöronların spesifik ligandlarına verilen yanıtlara izin verir.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Burada, tüm hücre yama-klemp kayıtlarını kullanarak fare vomeronazal organının akut koronal doku dilimlerinde tanımlanmış bir duyusal nöron popülasyonunun tanımlanmasına ve derinlemesine analizine izin veren fizyolojik bir yaklaşımı açıklıyoruz.

Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi

Koku duyu nöronları, uygun sinirsel devreleri oluşturmak için çok çeşitli akson sıralama moleküllerini ifade eder. Bu protokol, olfaktör duyu nöronlarının akson ucunda akson sıralama moleküllerinin kombinatoryal ifadelerini görselleştirmek için bir immünohistokimyasal boyama yöntemi tarif eder.

Koku Meşfatının Olfaktör Duyusal Akson Moleküler Kimlik Kodlarının Görselleştirilmesi İçin Dörtlü İmmün Sulanması

Bu makale, tek çekirdekli RNA dizilimi amacıyla murin koku alma epitelinin diseksiyonu ve dissosiyasyonu için kolaylaştırılmış bir protokol sağlar.

Tek çekirdekli süspansiyonlar için fare koku alma epitelinin hızlı diseksiyonu ve ayrışması

Öğrenin, fare vomeronazal organ ve aksesuar koku ampulünün fonksiyonel bağlantısını koruyan ex vivo preparasyon tekniğini. Bu yöntem, feromon işlemesi ve elektrofizyolojik kayıtlar için hassas disseksiyon adımlarını görsel olarak sunar.

Bozulmamış Vomeronasal Organ ve Aksesuar Koku Ampul Ex Vivo Hazırlıklar

Daha fazla video keşfet