Name: Kulakçık ve karıncığa gelen kardiyak miyozitlerde Boru Membran Ağlarının Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Öğrenin, fare kalbinden izole edilen kulakçık ve karıncık kardiyak miyozitlerindeki boru membran ağlarını analiz etme yöntemini. Canlı hücre boyama ve konfokal mikroskopi ile kantitatif görüntü analizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (A05 ve B05 alt projeleri ile S.E.L.) ve KFO 155 (alt proje 4 ile S.E.L.) aracılığıyla destek aldı, E.W.'yi destekleyen S.E.L.'ye bir Halbach Vakfı ödülü; Alman Kardiyak Derneği'nden S.B.'ye bir hibe; ve T.K.'yi Maryland Üniversitesi'nde ziyaretçi olarak destekleyen bir DAAD değişim programı aracılığıyla destek aldı. Bu sonuçlara yol açan araştırma, Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı FP7/2007-2013 kapsamında hibe sözleşmesi kapsamında fon almıştır. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (S.E.L.'ye). S.E.L., Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi'nin (DZHK) baş araştırmacısıdır.

<ol><li>Prosser, B. L., Ward, C. W., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Ca2%2B+signaling+in+the+heart+the+role+of+ryanodine+receptor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular Ca2+ signaling in the heart the role of ryanodine receptor sensitivity.</a> J Gen Physiol. 136 (2), 135-142 (2010).</li>
<li>Wehrens, X. H., Lehnart, S. E., Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+release+and+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium release and cardiac disease.</a> Annu Rev Physiol. 67, 69-98 (2005).</li>
<li>Cheng, H., Cannell, M. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+excitation-contraction+coupling+into+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Propagation of excitation-contraction coupling into ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 428 (3-4), 415-417 (1994).</li>
<li>Williams, G. S., Chikando, A. C., Tuan, H. T., Sobie, E. A., Lederer, W. J., Jafri, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+calcium+sparks+and+calcium+leak+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of calcium sparks and calcium leak in the heart.</a> Biophys J. 101 (6), 1287-1296 (2011).</li>
<li>Sperelakis, N., Rubio, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R.+orderly+lattice+of+axial+tubules+which+interconnect+adjacent+transverse+tubules+in+guinea-pig+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">R. orderly lattice of axial tubules which interconnect adjacent transverse tubules in guinea-pig ventricular myocardium.</a> J Mol Cell Cardiol. 2 (3), 211-220 (1971).</li>
<li>Soeller, C., Cannell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B.+of+the+transverse+tubular+system+in+living+cardiac+rat+myocytes+by+2-photon+microscopy+and+digital+image-processing+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">B. of the transverse tubular system in living cardiac rat myocytes by 2-photon microscopy and digital image-processing techniques.</a> Circ Res. 84 (3), 266-275 (1999).</li>
<li>Song, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+ryanodine+receptors+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">et al. ryanodine receptors in the failing heart.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (11), 4305-4310 (2006).</li>
<li>Oort, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted+junctional+membrane+complexes+and+hyperactive+ryanodine+receptors+after+acute+junctophilin+knockdown+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Disrupted junctional membrane complexes and hyperactive ryanodine receptors after acute junctophilin knockdown in mice.</a> Circulation. 123 (9), 979-988 (2011).</li>
<li>Wagner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+emission+depletion+live-cell+super-resolution+imaging+shows+proliferative+remodeling+of+T-tubule+membrane+structures+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Stimulated emission depletion live-cell super-resolution imaging shows proliferative remodeling of T-tubule membrane structures after myocardial infarction.</a> Circ Res. 111 (4), 402-414 (2012).</li>
<li>Asghari, P., Schulson, M., Scriven, D. R., Martens, G., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+tubules+of+rat+ventricular+myocytes+form+multiple+junctions+with+the+sarcoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Axial tubules of rat ventricular myocytes form multiple junctions with the sarcoplasmic reticulum.</a> Biophys J. 96 (11), 4651-4660 (2009).</li>
<li>Lukyanenko, V., Ziman, A., Lukyanenko, A., Salnikov, V., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+groups+of+ryanodine+receptors+in+rat+ventricular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional groups of ryanodine receptors in rat ventricular cells.</a> J Physiol. 583 (Pt 1), 251-269 (2007).</li>
<li>Shacklock, P. S., Wier, W. G., Balke, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Ca2%2B+transients+%28Ca2%2B+sparks%29+originate+at+transverse+tubules+in+rat+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Local Ca2+ transients (Ca2+ sparks) originate at transverse tubules in rat heart cells.</a> J Physiol. 487 (Pt 3), 601-608 (1995).</li>
<li>Reynolds, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctophilin-2+is+necessary+for+T-tubule+maturation+during+mouse+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Junctophilin-2 is necessary for T-tubule maturation during mouse heart development.</a> Cardiovasc Res. 100 (1), 44-53 (2013).</li>
<li>Di Maio, A., Karko, K., Snopko, R. M., Mejia-Alvarez, R., Franzini-Armstrong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-tubule+formation+in+cardiac+myocytes+two+possible+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">T-tubule formation in cardiac myocytes two possible mechanisms.</a> J Muscle Res Cell Motil. 28 (4-5), 231-241 (2007).</li>
<li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+density+of+transverse+tubules+and+L-type+Ca%282%2B%29+channels+in+canine+tachycardia-induced+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Reduction in density of transverse tubules and L-type Ca(2+) channels in canine tachycardia-induced heart failure.</a> Cardiovasc Res. 49 (2), 298-307 (2001).</li>
<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+T-tubules+and+reduced+synchrony+of+Ca2%2B+release+in+myocytes+from+chronically+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium.</a> Circ Res. 102 (3), 338-346 (2008).</li>
<li>Lyon, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+T-tubules+and+other+changes+to+surface+topography+in+ventricular+myocytes+from+failing+human+and+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Loss of T-tubules and other changes to surface topography in ventricular myocytes from failing human and rat heart.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6854-6859 (2009).</li>
<li>Crossman, D. J., Ruygrok, P. N., Soeller, C., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+organization+of+excitation-contraction+coupling+structures+in+failing+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Changes in the organization of excitation-contraction coupling structures in failing human heart.</a> PLoS One. 6 (3), e17901(2011).</li>
<li>Kemi, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+exercise+training+on+transverse+tubules+in+normal%2C+remodeled%2C+and+reverse+remodeled+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effect of exercise training on transverse tubules in normal, remodeled, and reverse remodeled hearts.</a> J Cell Physiol. 226 (9), 2235-2243 (2011).</li>
<li>Sachse, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+structures+and+function+of+myocytes+impaired+during+heart+failure+are+restored+by+cardiac+resynchronization+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Subcellular structures and function of myocytes impaired during heart failure are restored by cardiac resynchronization therapy.</a> Circ Res. 110 (4), 588-597 (2012).</li>
<li>Arakel, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+electrical+properties+of+the+heart+by+differential+trafficking+of+KATP+ion+channel+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tuning the electrical properties of the heart by differential trafficking of KATP ion channel complexes.</a> J Cell Sciences. 127 (Pt 9), 2106-2119 (2014).</li>
<li>Richards, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transverse+tubules+are+a+common+feature+in+large+mammalian+atrial+myocytes+including+human%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transverse tubules are a common feature in large mammalian atrial myocytes including human.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H1996-H2005 (2011).</li>
<li>Trafford, A. W., Clarke, J. D., Richards, M. A., Eisner, D. A., Dibb, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+microdomains+and+the+t-tubular+system+in+atrial+mycoytes+potential+roles+in+cardiac+disease+and+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling microdomains and the t-tubular system in atrial mycoytes potential roles in cardiac disease and arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 98 (2), 192-203 (2013).</li>
<li>Greiser, M., Schotten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+remodeling+of+intracellular+Ca2%2B+signaling+during+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic remodeling of intracellular Ca2+ signaling during atrial fibrillation.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 134-142 (2013).</li>
<li>Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+atrial+myocytes+for+simultaneous+measurements+of+Ca2%2B+transients+and+membrane+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents.</a> J Vis Exp. (77), 10-3791 (2013).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+genetic+manipulation+of+adult+cardiac+myocytes+for+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging.</a> J Vis Exp. (31), (2009).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>King, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+intact+cardiac+myocyte+mechanics+cross-bridge+and+titin-based+stress+in+unactivated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mouse intact cardiac myocyte mechanics cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells.</a> J Gen Physiol. 137 (1), 81-91 (2011).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%2C+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji, an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+of+histological+sections+Application+to+mammary+gland+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction of histological sections Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li>
<li>Liu, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale+space+approach+to+directional+analysis+of+images%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Scale space approach to directional analysis of images.</a> Appl Opt. 30 (11), 1369-1373 (1991).</li>
<li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochem Biophys Res Commun. 72 (1), 327-333 (1976).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).</li>
<li>Kohl, T., Westphal, V., Hell, S. W., Lehnart, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+microscopy+in+heart+-+cardiac+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Superresolution microscopy in heart - cardiac nanoscopy.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 13-21 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Kardiyak miyositler izole ve yıllardır 32 için çalışılmasına rağmen, bir yeni yorum tutarlı, yüksek kaliteli miyositlerdeki hücre izolasyonları 27 zorlu kalması sonucuna varmıştır. Bu vis-à-vis ortak bir standart yaklaşımlar eksikliği, paylaşılan metadata ve şeffaf hücre kalite belgelerine primer kalp miyositlerin izolasyonu için nispeten karmaşık protokolleri yansıtır. Hücre izolasyonu protokolleri genellikle bireysel gruplar tarafından özelleştirilmiş, hücre izolatlarının, değişken sonuçlar üretmek bireysel modeli ayarlarıyla (örneğin, tür, yaş, eşlik eden kalp rahatsızlıkları) bağlıdır ve genellikle belirli deney koşulları için ayarlanır. Membran çalışmalar ve protokoller Burada yer alan sayısal tats, kalite değerlendirmesi ve belgelerin önemli bir seviyesinin kapsamında metabolik ve izolasyon protokole bağlı değişikliklere yatkındır Bireysel hücre zar yapılarına konfokal mikroskopi veya superresolution ilgilidir, her ikiAM veya VM. Önemlisi, hücre izolatların yüksek verimi sağlıklı sağlam miyositleri göstermese bile, araştırmacılar belgelemek ve eleştirel nedeniyle nedeniyle farklı türlerine özgü değişiklikler karşı izolasyon prosedürleri non-spesifik hasar karşı yüzey ve TATS membran bütünlüğünün morfolojik kriterlere karşı dikkatli her hücreyi yargılamak gerekir müdahalelerin gibi koşulları kontrol etmek için karşılaştırdık. Kalp hücre izolasyonu sırasında önemli bir değişkendir, belirli bir kolajenaz çok spesifik aktivitedir. Kolajenaz yeni bir çok seçmek için çeşitli örneklerin kolajenaz enzimatik aktivitesi, kardiyak miyosit, verim ve kaliteyi değerlendirmek ve üretici talimatlarına göre birbirlerine karşı test edilmelidir. İdeal olarak, kollajenaz, yeni bir sürü, önceki başarıyla kullanılmaktadır sürü benzer kollajenaz aktivitesi ile tanımlanır (olası enzim faaliyetlerinin uzun değerlendirilmesi için malzeme ve yöntemler tabloda &quot;kollajenaz çok seçim aracı&quot; bakınız). TBirlikte Aken, TATS membran görselleştirme nicel yaklaşımlar hücre izolasyon kalitesi ve tersi, izolasyon prosedürleri kritik gözden ve düzeltme tetiklemesi gerekir TATS mikroskopi ile belgelenen spesifik membran hasarına yol açan kardiyak hücre izolasyonları sıkı sıkıya bağlıdır. Hücre izolasyon kalitesi ve TATS membran görselleştirme ve miktar özünde bağlantılı olduğundan, bu makalede açıklanan protokolleri sürekli bir strateji olarak tüm önemli yönlerini kapsar. Ek bir zorluk ve kardiyak çalışmalar, hücre hasarı ve / veya hücre kaybı ortak sorunu miyokard enfarktüsü 9 aşağıdaki metabolik ödün müdahaleler, örneğin nedeniyle meydana, henüz hücre izolasyonu sırasında fark hava embolisi aşağıdaki, potansiyel istenmeyen hasar örneğin karşı değerlendirilecektir gerekir. Hastalıklı kalpleri kardiyak miyositlerin izolasyonu ek, önemli hücre kaybına neden ve hücre verimleri azalmış olabilir. Bu nedenle, karşılaştırmalıhücre izolasyonu ve sayımı sürekli standart protokoller yoluyla uygulanır eğer kontrol ve hastalıklı kalpleri arasındaki izole edilmiş sağlam hücrelerinin toplam sayısının ison anlamlı olabilir. Sonuç olarak, mümkün olan en iyi miyosit hücre izolasyon kalitesini yansıttığı uygun bir kontrol grubu ile sağlanan hücre bütünlüğünü yargılamak için çok önemlidir. Daha da önemlisi, tek tek hücre kalitesi ve miyosit hastalıklı ve sağlıklı karşı canlı hücre mikroskopi yanlışlıkla anlamlı TATS membran ağların analiz etkileyebilir izolasyon prosedürü ile, hasarlı. Burada sunulan protokolleri bu nedenle hücre izolasyonu ve sağlam membranların canlı hücre mikroskopi sırasında fizyolojik membran bileşenlerinin bütünlüğü ve kararlılığı vurgulamak. Tüm iş akışı bu, membran bozulur membran tübüllere gibi izolasyon bağımlı membran eserler sergileyecek yana, başarmak ve hasarlı hücreleri hariç ise sağlam TATS zar bileşenlerini korumak için sürekli bir strateji olarak tasarlanmıştıre blebleri ve değişmiş TATS ağlar yanlışlıkla fazla nicel analiz kontrol koşulları altında ve uzlaşma. Tersi, aynı stratejiler TATS membran değişiklikleri ile gerçek hastalıklı hücreye karşı gerçek sağlıklı arasında anlamlı karşılaştırma kontrolleri sıkı sıkıya bağlıdır TATS membranlar, bozmaya potansiyeline sahip müdahale çalışmaları için çok önemlidir. Ayrıca, AM hücrelerinin teknik olarak çok daha zorlu izolasyonu sağlamak için prosedürler ele. Ilerleme ve geliştirilmiş protokoller rağmen, o VM&#39;lerin yüksek kalitede cep izolasyonların çoğaltmak önemsiz ve daha az güvenilir AM&#39;ler için olmadığını vurgulamak önemlidir. Bu VM bir hücre hasarı hafif derecede bağlı olarak nispeten yüksek bir hücre, hücre süspansiyonu daha az belirgin olabilir, oysa bir hücre izolasyonu sırasında bile, küçük bir hata ya da varyasyonlar PM hücre izolasyonu başarısızlığı tamamlamak yol açabilir PM hücrelerin bütün olarak daha düşük verim nedeniyle numaraları AM karşılaştırıldığında. PM hücreleri c hale gelebilir yanaAşama 4.3 altında tarif edildiği üzere izole etme sonra urved çeşitli ROI analizi ile avantajlı olabilir. Hücre izolasyonu adımların ayrıntılı bir prosedür izlenerek, biz doğrudan integral membran boyama ve confocal veya VM ve AM&#39;ler hem TATS ağlarının STED&#39;in superresolution görüntüleme için bir protokol sağlar. Bu protokoller önce kurulmuş parametreleri aracılığıyla nicel analiz ve TATS membranların seçin bileşenlerinin farklılaşmasını sağlayacak. VM&#39;lere karşılaştırıldığında, 3D organizasyon ve AM&#39;ler atriyal TATS ağının işlevsel davranışları halen yeterince bilinmemektedir. Canlı hücrelerde görüntü TATS zarlarına prosedürler (3,1-3,7 adımları) ticari confocal (Malzeme / Ekipman Tablo) ve ısmarlama STED&#39;in floresan mikroskoplar 9 ile geliştirilmiştir. Floresan görüntü üretimi ve nicel TATS analiz için mikroskop ayarlarını optimize etmek için, aşağıdaki hususlar genel önem taşımaktadır: <ul><li> Amaç </strong&gt; Ampirik, TATS zar yapılarının küçük ayrıntıları çözmek hücrede derin birkaç mikrometre odaklanırken yüksek görüntü kalitesini sağlayan nesnel test etmek için. Bazı konfokal mikroskop burada kullanılan 63X 1.4 NA petrol amacı aksine, su ya da gliserol amaçlarına daha iyi yapabilir. 100X büyütme ile Amacı nanometrik çözünürlükte 34 için daha küçük bir görüş alanını kapalı ticaret, superresolution STED&#39;in mikroskopi için kullanılır. </li><li> Uyarma ve Kazanç Uyarım gücü ve detektör kazanç uygun ayarları mikroskop ışık yolu, lazer performansı ve örnek özelliklerine bağlıdır. İdeal olarak, lazer güç ve kazanç dedektörün tam kapsamlı istismar, henüz görüntü doygunluğu önlemek için ayarlanır. Ticari mikroskobu yazılım paketleri genellikle dinamik aralığının alt ve üst sınırı görselleştirmek arama tabloları sağlar. Bundan başka, boya beyazlatıcı mümkün olan en düşük l kullanılması en aza indirmek içinHala yeterli yapısal TATS membran ayrıntıları sağlar aser güç. Ayrıca, tahrik güç miyosit kontraktürleri ve ölüme yol kümülatif verilmedi hasarı önlemek için yeterince düşük olmalıdır. </li><li> Piksel Boyutu Nyquist örnekleme ile uyumlu bir piksel boyutu, verilen ayarlarla elde yaklaşık yarısı çözünürlüğü kullanın. Konfokal görüntüleme için 100 nm x 100 nm&#39;lik bir piksel boyutu, aynı zamanda, ağartma sınırlar olan uyumludur. Superresolution mikroskopi için önemli ölçüde daha küçük piksel boyutları STED&#39;in mikroskopi 9 örneğin, 20 nm x 20 nm kullanılmaktadır. </li><li> Bekleme Süresi Eşodaklı mikroskoplar bir ortalama fonksiyonu sağlamak. Genel olarak, sinyal ortalama örneğin birlikte ağartma önlemek için kısa piksel bekleme süresini kullanmak, hat-ortalama ≥ 8 sinyal-gürültü-oranı artırmak için. </li><li> Meta-veri ile Uygulamalı Mikroskopi Ayarları Belge Nasıl ayarları kezTATS zar yapılarına görüntü bilgilerini belirli konfokal mikroskop güvenli duruma getirilmiş ve / veya ayarları (protokol meta-veri) belge edildi. Aynı amaca, uyarma gücü, kazanç, piksel boyutu, piksel bekleme süresi ve ortalama fonksiyonu ile hücrelerin bir (veya arasında) grup (lar) içindeki tüm görüntü kazanır. Eşit görüntüleme koşulları bir hücre (veya ile) grup (lar) içinde doğrudan karşılaştırılması ve nicelleştirilmesi için de izin verir. </li><li> Genel rehberlik ve esaslar konfokal mikroskopi uygulamaları hakkında daha fazla bilgi için, Biyolojik Konfokal Mikroskopi (Pawley JB, 3. Baskı, 2006, Springer Science + Business Media, LLC) El Kitabına bakınız. </li></ul> Burada sunulan doğrudan analizi stratejileri, TATS membranlar ve hastalık ile ilgili değişiklikleri açıklayan önceki yayınlar, aksine Fourier transf dayalı nicel strateji 16,17 veya dolaylı bölgesel stratejileri gibi T-tübül yoğunluğu bölgesel agrega okumalarını kullanmışT-tübül bileşen düzenlilik 7 değerlendirmek amacıyla çizgili membran sinyallerin ormation analizi. Aksine, burada açıklanan nicel yaklaşımlar doğrudan bireyin TATS bileşenleriyle ilgili ve membran ağ özellikleri ve A-tübüller yüzdesi gibi özel bileşenler dahil olmak üzere ek parametreler bir dizi sağlamaktadır. Bundan başka, ağ yoğunluğu TATS YG alanı başına tüm ekstre iskeletin normalize uzunluğu belirlenebilir. Üç bireysel üçlü eklemlerin sayısı sürekli bağlı bileşenler tübül TATS zar ağın dallanma karmaşıklığı bir ölçüsü olarak kullanılabilir. Biz küçük TATS bileşenlerin herhangi bir analiz boyama prosedürleri bağlıdır unutmayın. Deneyimlerimize göre, 50 uM, di-8-ANEPPS çözeltisi 800 ul 50000 VM, 9 hücreleri ihtiva eden bir hücre peleti içerisindeki tam TATS ağları leke için yeterlidir. Ancak, hücre topağı kardiak miyositler daha az sayıda içeriyorsa, Güçlü bir floresan dedektör kullanılabilir ve eğer küçük membran bilgilerini ve niceliksel değişiklikler ilgilendiren ziyade genel TATS ağ dağıtım konfokal görüntüleme, düşük miktarda boya konsantrasyonları ampirik test göre de yararlanılabilmektedir. Son olarak, tarif edilen analiz için yazılmış bir yazılım makrosu farklı tedavi grupları (örneğin ilaçlar), hücre tipleri arasındaki karşılaştırma için özellikle yararlı olan daha büyük bir veri kümelerinin analizi kolaylaştırmak için görüntü işleme adımları otomatik olarak kullanılabilir (örneğin, VM karşı AM ) ve patofizyolojik müdahaleler (örneğin, miyokard enfarktüsü karşı plasebo). TATS ağlarının görüntü analizi için, ilke adımların takip sırası uygulanır: 1) yuvarlanan bir top arka-çıkarma (4.5.1) arka plan yoğunluğu mekansal varyasyonları kaldırmak için; 2) Yerel kontrast geliştirme (4.5.2).; 3) görüntü yumuşatma (4.5.3); 4) İstatistiki bölge birleştirme (4.5.4); 5) tanımlayangörüntü Binarization eşik (4.5.6); iskelet verilerin ve 6) hesaplama (4.5.8). Floresan TATS görüntülerin skeletonize esnasında kritik bir safha, Şekil 6&#39;da gösterilen görüntü çiftleme olan. Bağlantılı eşik aşamaları sonunda gerçek zar yapıları arka plan gürültü hata tarafından tespit edilen potansiyel yanlış yapıların karşı yatan TATS bileşenlerini temsil etmek için saptandığı tanımlar. Ikili görüntü analizi için uygun eşik tanımlanması konfokal mikroskopi ve superresolution yaklaşımlar için yeterince yüksek bir sinyal-gürültü oranı (SNR) oranına bağlı olarak, her gerçek tats zar yapıları ile uyumlu olmalıdır. Bu nedenle, yeterli bir görüntü kalitesi birinci ve belirtildiği gibi sonradan parlak alan görüntülerinin belgeleri dahil bireysel hücre kalitesinin kritik kararı ile kombine kurulmalıdır. Alternatif seçenekler belirli bir mikroskop veri çıkışı ve / veya PHYS için görüntü segmentasyonu protokolü adaptemalarla sorular görüntü dekonvulasyon ve İmageJ eklentileri olarak kullanılabilir &quot;Otsu&quot; veya &quot;Iso-veri&quot; gibi diğer eşikleme işlemleri içermektedir. Ne olursa olsun son segmentasyon prosedürünün, biz görüntü bindirmesi ile ekstre edilmiş ve ham veriler arasındaki karşılaştırmayı zorunlu kalite kontrol adım düşünün. Özetle, bireysel izole miyositler, hücre içi TATS membranların yeterli boyanması, floresan görüntüleme için parametre optimizasyonu ve ekstre iskelet veri bindirme kontrolü morfolojik ve membran bütünlüğü tüm floresan TATS görüntüleri ve kantitatif sonuçları kalitesine katkıda bulunacaktır. Fare daha büyük türler hücre izolasyonu için kullanılır ise, hali hazırda protokoller uygun bir şekilde adapte edilebilir. Bir sonraki daha büyük türleri için, sıçan kalpleri kör bir 14 G kanül (dış çapı 2,1 mm) kanüllenmiş ve / dak, 8 ml perfüze. Anlamlı eski veya hastalıklı kalpleri daha büyük kanül boyutları gerektirebilir. Geninderal, kardiyak perfüzyon hazne ve aort arasında veya bir peristaltik pompa kullanılarak sabit akış ile 1 m yüksekliğinde bir su sütunu kullanılarak, örneğin sabit basınçlı yoluyla gerçekleştirilebilir. Kollajenaz sindirim sonunda sabit akış protokolleri tarafından bir dereceye kadar kontrol edilecek sızıntı damar yataklar aşırı perfüzyon oranları neden koroner direnç damarları bozacak beri fareler ve sıçanlar gibi küçük kemirgen kalpleri hücre izolasyonu için sabit akış avantajlı olabilir. Akış hızı ve doğru kanülasyon izlenmesi değiştirilmiş damar direnci davranışlı müdahale model yanı sıra hücre izolasyon prosedürlerinin eğitimi için yararlı olan bir öncelik vardır Buna zıt olarak, sabit basınç perfüzyon avantajlıdır. Yukarıda belirtildiği gibi, yeterli hücre kalite endojen membran sistemleri kantitatif çalışmalar için çok önemlidir. Ancak kalp perfüzyon ve kollajenaz sindirim sırasında çok sayıda faktör cr olabiliritically protokol optimizasyonu veya sorun 27 atış sırasında asla küçümsenmemelidir hücre izolasyonu, kalitesini etkileyebilir. Özellikle, belirli bir kolajenaz aktivitesi çok çalışmanın kalan süresi boyunca muhafaza edilmesi ilgi örneğin, kulakçıklar veya izolasyonu koşulları belirlemek için deneysel çalışmalarda iyi niyetli yürütülmeden önce ventriküllerin spesifik doku için belirlenmelidir. Ayrıca, perfüzyon kurulum su kalitesi, pH, sıcaklık, optimizasyon ve temizleme kirletici ve emboli yersiz bir hasar riskini en aza indirecek, ve potansiyel olarak ek faktörler hücre izolasyonu sırasında optimal homeostatik koşullarını oluşturmak için izlenecek var. BDM (2,3-bütandion-monoxime) miyozin ATPaz çapraz köprü reversibl bir inhibitörüdür yaygın hücre izolasyonların verimini artırır kalp kas gevşemesini sürdürmek için doku diseksiyonu ve sindirim sırasında kullanılır. Bununla birlikte, araştırmacılar t gerekirO BDM hedef dışı etkiler, örneğin, belirli koşullar altında 33, Na + / Ca2 + değişimi akımlarının inhibisyonuna yol spesifik olmayan fosfataz etkinlikler sergileyebilen unutmayın. Bazı deneyler için, zehirli ve nispeten pahalı kardiyoplejik solüsyon, ancak, mikromolar konsantrasyonlarda miyozin için yüksek bir afiniteye sahip bir inhibitörü olarak Blebbistatin ile BDM değiştirilmesi avantajlı olabilir ve diğer hedef dışı etkilere sahip olabilir. İstirahat sağlıklı kardiyomiyositlerde ileri analiz dışlanmamalıdır elektrik stimülasyon ve bu hücrelerin yokluğunda bir kasılmaları göstermemelidir. Diğer taraftan, fizyolojik hücre dışı Ca2 + konsantrasyonlarında, elektrikli uyarılmaya yanıt olarak kardiyak miyosit kasılma ve gevşeme üzerinde sağlıklı kontrol grubuna kıyasla kalp hastalığı, fonksiyonel hücre kalitesi ve / veya anormal davranışlarını değerlendirmek için ek bir önlem olarak, normal kasılma hareketleri kurmak için kullanılabilir hücreler. 21 yanı sıra mikrotübül ağı kantitatif analiz VM 9 TATS membran ağın konfokal mikroskopi ve superresolution uygulanan ve AM edilmiştir sabit kardiyak miyositler (veriler gösterilmemiştir). Böyle farklı gelişim aşamalarında TATS membranların karakterizasyonu veya TATS ağı irtibata membran ilişkili protein veya organel yapıların analizi gibi deneysel sorular çeşitli yollar açabilir protokollerin ve gelecekteki uygulamaları son derece, etki alanı özel sinyalizasyon yerelleştirilmiş uygularken için AM ve VM hücrelerinde fonksiyon.

Sağlıklı çizgisiz kas hücreleri, ana hücre eksenine dik &quot;enine&quot; oryantasyonundaki (T-tübül) ile boru şeklindeki zar yapıları bol miktarda bulunmaktadır. Sonuç olarak, T-tübülleri derin hücrenin merkezine doğru nüfuz sitoplazmada kas hücresi ana &quot;yanal&quot; yüzey zar (sarkolemma) sürekli uzantıları olarak karakterize edilmiştir. Dış yüzey membranı ile sürekli T-tübül fizyolojik rolü voltaj bağımlı L-tipi Ca nanometrik yakınlık bağlanması ile nispeten büyük bir kalp kası hücre hacmi boyunca SER organel temas alanları aracılığıyla oluşturulan uzak hücre içi bölmelerin elektrik bağlantı hızlı bir 2 + kanalları komşu riyanodin reseptörü (RYR2) SER Ca 2 + bültenleri aktive akımı (I Ca) içeri (Cav1.2). Junctional SER alanları ve T arasındaki ventriküler miyositlerde (VM), sürekli olmayan membran kontakları (&quot;kavşaklar&quot;) olarak-tubules her hücrede 1 tek tek hücre içi Ca2 + serbest nanodomains binlerce kontrol edildiği düşünülmektedir. Herhangi bir temas alanı için, yan yana zar bölümleri, T-tübül içinde ve çevre birimini (kavşak) SER, her birbirine yakın 15 nm, dolayısıyla nanodomain olarak tanımlanır yaklaşık olarak. Böylece, çok küçük bireysel sitoplazmik alt uzaylar yarı hücre özerk bölmesi davranışları sağlayacak hangi ayrılmış edilmektedir. Gelen bir hareket potansiyeli sanal makineye, nispeten küçük bir Ca T-tübüllerde Cav1.2 kanallarını aktive olduğunda 2 + içe akım hızlı attoliter boyutlu nanodomain 1 alt uzay Ca2 + konsantrasyonu [Ca2 +] S artacaktır. Sonra, [Ca 2 +] S artış 2+ -geçişli riyanodin reseptörleri (RYR2) yanyana SER membran kavşağında nanometre yakınlık içinde Ca harekete geçirir ve bu birleştirme işlemi, tüm elektriksel çift boyunca oluşurd miyositlerdeki nanodomains. RyR2s 5-10 RYR2 kanal 2 1 Cav1.2 kanal tahmini stokiyometri ile yoğun olarak çok kanallı kümeleri ortaya çıkar. SER-to-sitozolde beri [Ca 2 +] degrade çok dik (oranı 10 4: 1) ve RyR2s işlevsel birleştiğinde kümeler gibi yüksek iletkenlik Ca 2 + salım kanalları işlev, bir nicel büyük Ca RYR2 aktivasyon sonuçları 2+ 1-2 msn 3,4 olan 100 uM veya daha yüksek [Ca 2 +] S yerel altuzaya artan T-tübül birleştiğinde kavşak SER etki akım bırakın. Bu, kalp sinyal amplifikasyonu davranış, serbest Ca 2 + (KTKS) indüklenen Ca2 + olarak ifade edilir. Birlikte ele alındığında, T-tübülleri hızla eksitasyon-kasılma (EC) birleşme sırasında kavşak nanodomain SER kişileri ve hücre çapında KTKS aracılığıyla Ca 2 + sürümü sinyalleri aktive temel membran yapılar vardır. T-tübül ek olarak, eksenel tübülana (uzunlamasına) hücre eksenine önemli ölçüde farklı bir yönelim paralel lar (A-tübüller) elektron mikroskobu (EM), confocal ve 2-foton mikroskopi çalışmaları ile belgelenmiştir. Örneğin, sarkomer Z hatlarının yakınında, T-tübül ile birbirlerine bağlanmış myofibrils arasında bir-tübüllerin bir hücre-hücre-dışı olarak geniş ve sürekli kafes ajanları ve sabit kobay VM 5 EM görüntüleme ile gösterilmiştir. Ekstrasellüler dekstran-bağlantılı floresein boyası kullanılarak ve sıçan VM&#39;lerin 2-foton görüntüleme yaşamak, karmaşık bir retiküler 3D borucuk ağı ~ 60% T-tübüller ve ~ 40% A mikrotüplerin 6 oluşan görüntülendi. Bu çalışmada yalnızca, aynı zamanda EM görselleştirme için kesit doğal enine-eksenel borucuk sistemi (TATS) gibi karmaşık ve dinamik zar ağlarının analizi için sınırlı olduğunu gerçekleştirilmesi, bol A-Tübüllerin 3D görselleştirme yol değil. Sonuç olarak, TATS membran konfokal canlı hücre görüntüleme doğrudan ile boyanmış di-8-ANNEPS geliştirilmiştir. Eğer canlı hücreTATS ağlar Fourier dönüşümü ile analiz edilir, sarkomer Z hatlarının yakınında alanı T-tübül bileşenlerinin normal görünümünü çizgili sinyalleri 7 bir bölgesinden topluluğu güç spektrumu ile yansıtılır. Bu strateji, dolaylı analiz hastalık modellerinde 7 TATS bileşen düzenli hücre genelinde bölgesel değişiklikleri tespit etmek için kullanılmıştır. Örneğin, shRNA aracılı junctophilin-2 knock-down kalp yetmezliği ve izoformu spesifik protein eksikliği nanodomain Ca 2 + sürümü disfonksiyonu 8 T-tübül sonuçlanan yeniden neden oldu. Biz son zamanlarda doğrudan nicel yaklaşımlarla ve daha fazla uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) nanoscopy 9 kullanılarak fare VM&#39;lerde bireysel TATS bileşenlerin canlı hücre superresolution mikroskobu ile TATS membran ağlarının analizini artırdık. Enine 50:50 dağılımın yaklaşık küçük bireysel TATS bileşenlerin doğrudan analizi, izin nanometrik görüntü çözünürlüğüeksenel tübül yönelimleri karşısında, kantitatif sağlıklı fare kalpleri 9 iki bol henüz diferansiyel yönelimli bireysel TATS bileşenlerini doğrulayan. Bu stratejiler daha aşağıda protokol bölümünde özetlenen edilecektir. Yetişkin merkezinde bol miktarda bir-tübül bileşenlerinin fizyolojik rolü anlaşılmaz kalmıştır da EM çalışmaları endojen Ca 2 +, gine domuzu ve sıçan VM 5,10 açma nanodomains süren bir-tübül ilişkili SER zar yapılarına belgelemiştir. Cav1.2 ve RYR2 Konfokal analizi, bir-tübül birleşme 10 ile yardımcı sınırlama yüksek derecede bulundu. VM T-tübülleri genellikle oluşmaz Z-line damarların nispeten uzak kökenli sıçan spontan Ca 2 + kıvılcımlar ~ 20% yana, tek argüman A-tübül ilişkili nanodomains gerçekten var ve fonksiyonu olabileceğini olmuştur Ca 2 + sürümü siteleri gibi 11,12. İlginç bir şekilde, T-tübül oluşumu ve olgunlaşma OCsadece doğumdan sonra sadece alıcılarında mümkündür ve P5 ile ön-madde sarkolemmal invajinasyonları filizlenerek yoluyla, örneğin kalp hücreleri, büyüme, paralellik ve olgunlaşmamış farelerde 13 P10 TATS ağ derlemeleri dallıdır. Bu Junctophilin-2 ShRNA knock-down beri doğum sonrası TATS ağ olgunlaşması için özellikle önemlidir gecikmeli Ca 2 + salınımı ve olgunlaşmamış bir-tübül hakim mimarileri ile tutarlı patolojik TATS örgütü lider SER kavşaklar T-tübül membranların ankrajını engelledi görünür VM 13. Bu gözlemler sonuçta kanıt-of-concept T-tübülleri ek ya da alternatif hücre içi mekanizmaları ile 14 morph olabilir A-tübüller ise membran invaginasyon süreçlerle oluşturmak yol açabilir. Kalp hastalığı TATS membran değişikliklerinden Karakterizasyonu patofizyolojik sorular için önemli bir araştırma alanı haline gelmiştir. Pacing kaynaklı kalp failu bir köpek modelinde ilk raporlarYeniden T tübüller ve Cav1.2 akımı (I Ca) 15 bir kayıp göstermiştir. Iskemik kardiyomiyopati bir domuz model T-tübül yoğunluğu azaltılmış gösterdi ve hücre içi Ca azaltılmış sinkronisinde 16 serbest 2+. Kalp yetmezliği, kendiliğinden hipertansif sıçan (SHR) modeli kullanılarak T-tübüllerin bir kayıp &quot;orphaning RYR2&quot; nin bir mekanizma yolu ile Cav1.2 ve RYR2 azaltılmış nanodomain bağlanması ile ilişkili 7. T-tübül kaybı da iskemik dilate, hipertrofik kardiyomiyopati örnekleri 17 insan sanal makine içerisine gösterilmiştir. Ayrıca, A-tübül bir artışın insan dilate kardiyomiyopati 18 doku kesitlerinde bildirilmiştir. Miyokard enfarktüsü takiben, A-tübül bileşenlerin 9 artar aksine T-tübüller önemli düşüşlere fare sanal makinelerdeki TATS yeniden bir diferansiyel mekanizması gösterdi. Önemli bir şekilde, geliştirilmiş zar yerel kontrast canlı hücre superre yoluyla eldeçözüm STED&#39;in mikroskobu genel TATS ağ uzunluğu artar ve karmaşıklığını 9 dallanma ile bir-Tübüllerin belirgin bir çoğalma gösterdi doğrudan ölçümler aracılığıyla detaylı nicel bileşen analizi sağladı. Ayrıca, miyokard infarktüsü sonra 19 ve KRT atriyal tachypacing kaynaklı kalp yetmezliği 20 köpeklerde T-tübül tersine yeniden biçimlenme yol açabilir sıçanlarda T-tübül biçimlenme ters olabileceğini egzersiz eğitimi gördü. Protokolde belirtilen ve aşağıda bölümleri sonuçları birlikte ele alındığında, hastalıklı insan ve hayvan VM&#39;lerin yanı sıra potansiyel terapötik müdahalelerin hem çalışmalar tartışmasız kaliteli hücre izolasyon prosedürleri ve ayrıntılı kantitatif analiz stratejilerinden yararlanacaktır. Katp kanal TATS membran kaçakçılığı 21 izoformlan karşı yanal yüzeyi ile son zamanlarda gösterdiği gibi Dahası, atriyal m dikkate almak önemlidiryocytes biyolojik olarak farklı olarak sanal makineye karşı karşılaştırmalı kalp hücre modeli olarak (AMS). T-tübüller yakın koyun ve insan AM&#39;ler 22 belgelenmiştir. Mevcut kanıtlar birkaç T-tübülleri küçük kemirgenler 23 koyun ve insanlarda değil gibi büyük memelilerde tipik PM hücrelerde bulunur ve düşündürmektedir. VM&#39;lere aksine, ams hücre içi Ca2 + serbest 2 + işaretli mekansal ve zamansal Ca ile sonuçlanan 23 gradyanlar hücrenin merkezine doğru difüzyon ile hücre yüzeyi ilerleyen meydana gelir gibi görünmektedir. Bu çerçevede bu tür atriyal fibrilasyon 24 gibi hücre içi Ca 2 + yaygın bir hastalık formları için istikrarsızlık sinyal mekanizmaları aydınlatmak için önemli gibi görünüyor. Özetle, sağlıklı ve hastalıklı kalpleri hem AM ve VM hücre izolasyonu ve genellikle her protokolleri kullanılmaktadır. Yeterli hücre kalitede mikroskobik belgelerine göre değerlendirildiği gibi hücre izolasyonu düzgün yapılır Sadece eğer, AM ve VM örnekleri ca olmalıKantitatif analiz TATS ileri rried. Bu duruma göre, aşağıdaki protokol kesitleri fare veya sağlam zarları TATS analiz etmek için bir canlı hücre mikroskobu ile takip diğer türlerden izole edilen yüksek kaliteli hücre kritik bağlıdır. Daha önce de belirttiğimiz gibi, TATS membranların karakterizasyonu tespit ve hazırlık eserler 6, ozmotik değişikliklere bağlı membran değişikliklerinden ve geleneksel ışık mikroskopisi 9 çözünürlük sınırlamaları için bir eğilimi ile zorlu bir araştırma alanıdır. Biz Ca 2 + görüntüleme ve yama-kelepçe ve hücre kültürü için sıçan VM&#39;lerin insan AM&#39;ler izolasyonu için son state-of-the-art protokolleri daha önce bu dergide 25,26 yayınlanmaktadır unutmayın.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Kimyasallar ve Enzimler</td></tr><tr><td>2,3-Bütandion monoksit</td><td>Sigma-Aldrich, Münih, Almanya</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Sığır buzağı serumu</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Almanya</td><td>SH30073</td><td>Üçlü 0.1 & mikro; m steril filtreli.</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, Münih, Almanya</td><td>21115</td><td>100 mM CaCl2 </alt>stok konsantrasyonu elde etmek için MQ suda 1:10 seyreltildi.</td></tr><tr><td>Kollajenaz tip II</td><td>Worthington, Cell Systems aracılığıyla, Troisdorf, Almanya</td><td>istek üzerine</td><td>Enzimatik aktivite, bireysel kollajenaz partilerine bağlıdır. Kollajenaz II ve diğer enzim aktiviteleri (Kazeinaz, Clostripain, Triptik) "kollajenaz lot seçim aracı" nda değerlendirilebilir. Her yeni kollajenaz lotu için hücre verimini ve kalitesini ayrı ayrı belirleyin.</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>HN06.1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Rotexmedica, Trittau, Almanya</td><td>PZN-03862340</td>% <td>0.9 NaCl içinde seyreltilir ve karın derisine deri altına enjekte edilir.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>Forene %100 (V/V)</td><td>Abbott, Libertyville, IL, ABD</td><td>B506</td><td>Aktif ajan: izofluran, 250 ml. Hava/oksijen dağıtıcı cihazında yaklaşık %2 Hacim kullanın.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Laminin (2 mg / ml)</td> <td>BD Biosciences, Heidelberg, Almanya</td><td>354232</td><td>Laminasyon adım 2.1'de açıklanmıştır.</td></tr><tr><td>MgCl<alt>2</alt> ve orta nokta; 6H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>8283.2</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>4984.2</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>HN01.1</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Almanya</td><td>4721.2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Dyes</td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>Moleküler Problar, Yaşam Teknolojileri, Darmstadt, Almanya</td><td>D-3167</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Sigma-Aldrich, Münih, Almanya'da</td> stok çözeltisi 2 mM <td>T8154</td><td>Tripan mavisi, Neubauer sitometresinde hücre sayımından önce hücre süspansiyonu ile uç kesim 1 ml plastik pipet ile 1: 1 oranında hafifçe karıştırılır.</td></tr><tr><td colspan="4">Langendorff Perfüzyon Kurulumu</td></tr> <tr><td>sirkülasyon termostatı</td><td>Lauda, Lauda-K&ouml; nigshofen, Almanya</td><td></td><td>Lütfen Louch et al. (JMCC 2011) kitabına bakın. Perfüzyon tüpündeki termostatı ve tamponları 37 ° C'ye ısıtın; C Kullanmadan 15 dakika önce.</td></tr><tr><td>Peristaltik pompa için esnek silikon boru Tygon</td><td>VWR, Darmstadt, Almanya</td><td>224-2252</td><td>Boruların düzenli olarak değiştirilmesi gerekir.</td></tr><tr><td>Termostat VWR için esnek silikon boru Tygon</td><td>, Darmstadt, Almanya</td><td>228-4340</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma bobini çevreleyen perfüzyon tüpü</td><td>Rettberg, G&ouml; ttingen, Almanya</td><td>ısmarlama</td><td>Isıtma bobini ve borularının kullanıldıktan sonra MQ su ile iyice temizlenmesi gerekir. Deterjan kullanmayın. Cam bileşenleri düzenli olarak yıkanmalıdır&nbsp; gece boyunca 10 mM NaOH içinde.</td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>Ismatec, Wertheim, Almanya</td><td>ISM830</td><td></td></tr><tr><td>Üç yollu durdurma musluğu Discofix C Luer Lock 10 cm</td><td>Braun, Melsungen, İsviçre</td><td>16500C</td><td></td></tr><tr><td>Üç yollu durdurma musluğu Discofix 3SC</td><td>Braun, Melsungen, İsviçre</td><td>4095146</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Instruments</td></tr><tr><td>42 mm cam lameller</td><td>Menzel Gl&auml; ser via Thermo Scientific, Schwerte, Almanya</td><td>istek üzerine</td><td>0,13-0,16 mm kalınlık</td></tr><tr><td>Kanül 21 G</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, ABD</td><td>304432</td><td>~5 mm uzunluğunda kesin, zımpara kağıdı ile pürüzlendirilmiştir.</td></tr><tr><td>Neubauer sitometre 24 x 24 mm</td><td>Menzel Gl&auml için lameller; Talep üzerine Thermo Scientific, Schwerte, Almanya aracılığıyla ser</td><td></td><td>0.38-0.42 mm kalınlık</td></tr><tr><td>Graefe forseps, 0,5 mm uçlar, hafif eğri</td><td>Güzel Bilim Araçları, Heidelberg, Almanya</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>LSM 710 NLO</td><td>Carl Zeiss, Jena, Almanya</td><td></td><td>63X 1.4 NA yağ hedefi</td></tr><tr><td>Neubauer geliştirilmiş sitometre</td><td>Emek Optik, Friedrichsdorf, Almanya</td><td>1100000</td><td>Sayma prosedürü: Sayma haznesiyle birlikte verilen sitometreyi ve lamel %70 etanol ile silin. İki cam yüzeyin temas etmesi ve Newton'un halkalarının görülebilmesi için lamel sayma haznesine hafifçe bastırın. Daha sonra, 10-20 & mikro; l Hücre süspansiyonu, kılcal hareket ile boşluğa emilecek lamel kenarına uygulanabilir. 100 nl'yi yansıtan sitometre ızgarasının karelerini kullanarak sağlam ve kusurlu miyositleri sayın. Sitometrede sağlanan ikinci ızgarada sayma işlemini tekrarlayın. Herhangi bir seyreltmeyi hesaba katarak ve kısayolları sayarak orijinal hücre süspansiyonunuzdaki hücrelerin yoğunluğunu hesaplayın.</td></tr><tr><td>POC-R2 Görüntüleme Odası</td><td>Pecon, Erbach, Almanya</td><td></td><td>Hücre süspansiyon hacmi: 800 & mikro; l; istenen kaplama yoğunluğu: ~1.000 ve ~10.000 VM</td></tr><tr><td>Yaylı makas, 8 mm bıçaklar düz, kör</td><td>Güzel Bilim Aletleri, Heidelberg, Almanya</td><td>15025-10</td><td></td></tr><tr><td>Öğrenci dumont #7 forseps, inox</td><td>Güzel Bilim Aletleri, Heidelberg, Almanya</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Öğrenci iris makası, kavisli, 11,5 cm</td><td>Güzel Bilim Aletleri, Heidelberg, Almanya</td><td>91461-11</td><td></td></tr><tr><td>Öğrenci iris makası, düz, 11.5 cm</td><td>Güzel Bilim Aletleri, Heidelberg, Almanya</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Öğrenci cerrahi makas, düz, keskin, 12 cm</td><td>Güzel Bilim Aletleri, Heidelberg, Almanya</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>Doku forsepsleri, 1 x 2 diş, ince, 10 cm</td><td>Güzel Bilim Aletleri, Heidelberg, Almanya</td><td>11023-10</td><td></td></tr></tbody></table>

kulakçık ve karıncığa gelen kardiyak miyozitlerde boru membran ağlarının analizi

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

Kardiyak miyositlerde, karmaşık bir membran tübül ağı - enine eksenel tübül sistemi (TATS) - derin hücre içi sinyalleşme fonksiyonlarını kontrol eder. Dış yüzey zarı ve ilişkili TATS zar bileşenleri sürekli gibi görünse de, lipit ve protein içeriğinde önemli farklılıklar vardır. Ventriküler miyositlerde (VM'ler), belirli TATS bileşenleri oldukça bol miktarda bulunur ve doğrusal tübül ağlarına ve düzenli dallanan 3B mimarilere katkıda bulunur. Periferik TATS bileşenlerinin, hücre yüzeyinden binlerce uzak hücre içi sarkoendoplazmik retikulum (SER) membran temas alanına aksiyon potansiyellerini yaydığı ve böylece hücre içi Ca2+ salım birimlerini (CRU'lar) aktive ettiği düşünülmektedir. VM'lerin aksine, atriyal miyositlerde ('ler) TATS membranlarının organizasyonu ve işlevsel rolü önemli ölçüde farklıdır ve çok daha az anlaşılmıştır. Birlikte ele alındığında, sağlıklı ve hastalıklı miyositlerde TATS membran ağlarının kantitatif yapısal karakterizasyonu, fonksiyonel plastisite ve patofizyolojik yeniden düzenlemenin daha iyi anlaşılması için önemli bir ön koşuldur. Burada, canlı VM'lerde ve'lerde TATS membran ağlarının doğrudan kantitatif analizi için stratejik bir protokol kombinasyonu sunuyoruz. Bunun için, fare VM'lerinin ve/veya'lerin birincil hücre izolasyonlarına, kritik kalite kontrol adımları ve TATS membranlarının floresan görüntülemesi için doğrudan membran boyama protokolleri ile eşlik ediyoruz. Konfokal veya süper çözünürlüklü TATS görüntü işleme için optimize edilmiş bir iş akışı kullanılarak, TATS ağının ve bileşenlerinin nicel analizi için ikili ve iskeletleştirilmiş veriler oluşturulur. Daha önce yayınlanmış dolaylı bölgesel toplu görüntü analiz stratejilerinden farklı olarak, protokollerimiz, yüksek verim ve açık erişimli yazılım araçları ile belirli bileşenlerin doğrudan karakterizasyonunu sağlar ve canlı miyositlerdeki TATS membran ağlarının karmaşık fizyolojik özelliklerini türetir. Özetle, kombine protokol stratejisi, fizyolojik miyosit adaptasyonu veya hastalık değişiklikleri, farklı kalp veya iskelet kası hücre tiplerinin karşılaştırılması, transgenik modellerin fenotiplemesi ve farmakolojik veya terapötik müdahaleler sırasında kantitatif TATS ağ çalışmaları için kolayca uygulanabilir.

Kardiyak miyozitlerde, boru şeklindeki zar yapıları hücre içi ağları oluştururlar. Biz kalite kontrol, devlet-sanat-floresan mikroskop için ii) canlı hücre boyama dahil fare kalbinden miyositlerin i) izolasyonu için protokolleri optimize tanımlıyor, ve iii) doğrudan görüntü analizi bileşen karmaşıklığı ve hücre içi membran plastisite ölçmek için ağlar.

Kulakçık ve karıncığa gelen kardiyak miyozitlerde Boru Membran Ağlarının Analizi

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Bu prosedürün genel amacı, atriyal ve ventriküler miyositlerdeki tübüler membran ağlarını analiz etmektir. Bu, ilk olarak yetişkin bir fare kalbinden atriyal ve ventriküler miyositlerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, transvers aksiyel tübül sistemi veya tats, sağlam canlı izole kardiyak miyositlerde boyanır.Daha sonra, tats membran ağı konfokal veya sabit floresan mikroskobu ile görselleştirilir ve daha sonra ağın bileşenleri kantitatif olarak analiz edilir. Sonuç olarak, farklı hücre tiplerinin zar ağları arasındaki veya sahte ve tedavi grupları arasındaki farklar, kantitatif tats görüntü analizi ile ortaya çıkarılabilir. Bu hücre izolasyonu ve analiz tekniğinin ana avantajı, izolasyon sürecinin kapsamlı bir iş akışının, miyositlerin doğrudan floresan görüntülemesine yol açması ve dokunmatik membran ağının kantitatif veri analizine izin vermesidir.Bu yöntem, sağlıklı yaşayan kardiyomiyositlerde karmaşık zar ağlarının organizasyonu hakkında bilgi sağlayabilir, ancak aynı zamanda hastalıklı veya transgenik hayvanlardan elde edilen miyositlere de uygulanabilir. Bu protokole yeni katılanlar, yüksek kaliteli kardiyak miyositlerin tutarlı bir şekilde izole edilmesini sağlamak için ek giriş eğitiminden ve tekniğin gerçekleştirilmesi için önemli bir ön koşuldan faydalanacaktır: Miyositleri izole etmek için, organ ekstraksiyonu mümkün olduktan hemen sonra dört dakika boyunca 37 santigrat derece oksijenli perfüzyon tamponu ile 12 haftalık veya daha büyük bir farenin kalbini perfüze ederek başlayın. Daha sonra, kalbi sekiz ila 10 dakika boyunca 37 santigrat derece sindirim tamponu ile inceleyin ve görünen kalp yüzeyi boyunca opaklığı, yumuşaklığı ve asitliği artırmak için doku sindiriminin ilerlemesini izleyin.Sindirimden sonra, sağ atriyal apendiksiyi saptırın ve atriyal ventriküler kapakların hemen üzerindeki sağ atriyumu inceleyin. Diseksiyona sol atriyum ile devam edin ve ardından fibröz kapak aparatını inceleyin ve atın. Sol ve sağ serbest ventrikül duvarlarını ve gerektiğinde septum ve daha küçük doku parçalarını serbest bırakarak diseksiyonu bitirin.Daha sonra, tüm ventriküler dokuyu 2,5 mililitre sindirim tamponu içeren 60 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve ardından dokuyu yaklaşık bir milimetre küp parçalar halinde kesin. Ventriküler miyositleri tek hücreli bir süspansiyona nazikçe ayırmak için doku parçalarını bir transfer pipeti ile yavaşça yediniz ve kabarcıklar veya sıvı jeti hasarını önlemek için dikkatli olun. Ardından hücre süspansiyonuna 7,5 mililitre durdurma tamponu ekleyin.Paralel olarak, sindirilmiş atriyal dokuyu bir mililitre sindirimde yaklaşık bir milimetre küp parçalar halinde kesin, 60 milimetrelik bir Petri kabında tamponlayın ve ardından atriyal miyositleri az önce gösterildiği gibi nazikçe tritrate edin. Mekanik çalkalamayı takiben, atriyal miyosit süspansiyonundaki kalıntı kollajenaz aktivitesini durdurmak için dört mililitre durdurma tamponu ekleyin. Daha sonra hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve izole edilen miyositleri supinat fraksiyonu ile hasat etmeden önce kalan doku parçalarının 15 saniye boyunca çökelmesine izin verin.Bir yıkama adımından sonra, Resus atriyal miyositleri beş mililitre perfüzyon tamponu içinde nazikçe süspanse eder ve ventriküler miyositlerin tat membranlarını boyamak için hücre süspansiyonunu yaklaşık bir kez 10 ila üç hücre alikotunda 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine bölün. İlk olarak, hücrelerin sekiz dakika boyunca yerçekimi ile yerleşmesine izin verin ve atriyal miyositlerde lekelenmek için 1.5 mililitrelik bir reaksiyon tüpü gönderin, hücreleri her iki hücre tipi için oda sıcaklığında 20 kez G'de iki dakika boyunca reddedin. Daha sonra, hücre peletinin gereksiz yere çalkalanmasını önlemek için dikkatli bir şekilde supinatı dikkatlice çıkarın.Daha sonra, hücreleri 800 mikrolitre membrana özgü til boya boyası sekiz ve eps içinde nazikçe yeniden süspanse etmek, koyu yıkamada 15 dakikalık bir inkübasyondan sonra miyositleri hemen bir görüntüleme odasında laminin kaplı örtü fişlerine aktarın. Kapak bir kez kayar ve ardından üzerlerini bir mililitre perfüzyon tamponu ile örtün. Merkezi hücre içi miyosit bölümünün örnek bir görüntüsünü alın ve ardından kırpma penceresini ve son piksel boyutunu 100 x 100 nanometre olarak ayarlamak için kırpma işlevini kullanın.Son görüntüleme düzlemini seçmek için, Z yönünde en uygun görüntüleme düzlemini manuel olarak seçmek için tek görüntü çerçevelerini kullanın. TAs membran ağının hem t tubial hem de tubial bileşenleri içerdiğini ve odak düzleminde görsel olarak görünür olduğunu onaylayın. Tipik bir hücre içi görüntüleme düzleminin, merkezi bir hücre içi referans noktası olarak bir çekirdek içerebileceğini unutmayın.tats membran ağını ve bileşenlerini analiz etmek için, şimdi uygun görüntü analiz yazılımını kullanarak görüntü dosyasını açın. Bu görüntüde gösterildiği gibi, dış yüzey zarını hariç tutarken ve tats zar ağının hücre içi kısımlarını dahil ederken ilgilenilen bölgeyi tanımlamak için çokgen seçim aracını kullanın. Ardından, seçilen ROI'yi oluşturmak için düzenle ve temizle dış komutlarını kullanın, böylece seçilen hücre içi alan, tats ağının yalnızca hücre içi zar kısımlarını içerir, ancak yüzey zarının herhangi bir bölümünü içermez.Şimdi işleme tıklayın ve arka planı çıkarın ve yuvarlanan top yarıçapını beş piksele ayarlayın. Ardından işlemi seçin ve yerel kontrastı geliştirin. Ve blok boyutunu 49'a, histogram kutularını 256'ya, maksimum eğimi üçe ve maskeyi hiçbirine ayarlayın.Eklentiler altında işlem ve pürüzsüzleştir'e tıklayın, segmentasyon ve istatistiksel bölge birleştirmeyi seçin ve parametreyi Q 100 olarak ayarlayın. Ardından ortalamaları göster'e tıklayın. Ardından, görüntü türünü ve sekiz bit'i seçin ve ardından 40 eşiğinden başlayarak görüntü ayarı ve eşiği seçin.Doğru eşik seçiminin, arka plan gürültüsü nedeniyle yanlış pozitif sinyaller değil, yalnızca belirli tats membran yapıları üretmesi gerektiğini unutmayın. Ardından eklentiler altında, iskelet ve iskeletleştirilmiş 2B 3B'yi seçin ve iskeletleştirilmiş 2B görüntüyü evlat edinen bir dosya olarak kaydedin. Şimdi eklentileri tekrar seçin ve nicel veri çıktısı için iskeletleştirilmiş görüntü dosyasını analiz etmek için iskelet 2D 3D'yi analiz edin.Ardından budama döngüsü yöntemi için hiçbiri'ni seçin ve elde edilen veri tablosunun otomatik olarak oluşturulmasını onaylayın. Şimdi, iskeletleştirilmiş görüntü verilerinden uygun vergi ağı bileşenlerinin bireysel yönelimlerini analiz etmek için Fiji eklentisi yönlülüğünü kullanın. Yöntem altında, FURIER bileşenlerini, uç bölmeleri 180'i ve eksi 45 derecelik bir histogram başlangıcını seçin.Son olarak, ekran tablosunu kontrol edin ve bir yönlülük histogramı oluşturun. Bu ilk şekilde, görüntünün X eksenine dik olan enine elemanlardan ve x eksenine paralel olan eksenel bileşenlerden oluşan sağlıklı bir ventriküler miyositteki tatların temsili bir iskeletleştirilmiş görüntüsü gösterilmektedir Yönlülük eklentisinin uygulanması, sıfır derecede karşılaştırılabilir tepe noktalarına sahip ventriküler tatlar için bir oryantasyon histogramı ile sonuçlanır, eksenel oranı temsil eder ve 90 derecede enineyi temsil eder. Buna karşılık, bir atriyal miyositteki tatların temsili bir iskeletleştirilmiş görüntüsü, esas olarak görüntünün X eksenine paralel olan eksenel bileşenlerden oluşur.Bu nedenle, karşılık gelen oryantasyon histogramı, eksenel tats oranını temsil eden sıfır derecelik bölme etrafında baskın bir tepe ve enine tats oranını temsil eden 90 derecede yalnızca küçük bir tepe sergiler Bu prosedürü denerken, hücre izolasyonundan sonraki her adımda, görüntüleme sırasında ve en önemlisi, hücre kalitesini kontrol etmek önemlidir. görüntü analizinden hemen önce. Bu videoyu izledikten sonra, karmaşık zar yapılarının, tes ağlarının ve potansiyel olarak zarla ilişkili proteinlerin nasıl tamamen farklılaştığını iyi anlamış olmalısınız. Erişkin kardiyak miyositler konfokal mikroskopi ile görüntülenebilir ve kantitatif olarak analiz edilebilir.Lipofilik membran gözler, sindirim enzimleri ve potansiyel olarak bulaşıcı kalp hastası ile çalışmanın bir tehlike olabileceğini ve bu prosedürleri gerçekleştirirken demir cilt koruması gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini lütfen unutmayın.

analysis-tubular-membrane-networks-cardiac-myocytes-from-atria

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu hücre içi Ca için kullanılabilecek insan atriyal miyosit izolasyonunu...

Ca aynı anda Ölçümler İnsan Atriyal miyositlerin izolasyonu<sup&gt; 2 +</sup&gt; Geçici ve Membran Akımlar

Yabani tip ve mutant farelerden alınan bireysel kardiyomiyositler, kasılmalarını ve kalsiyum geçişlerini incelemek için kalpten izole edilebilir. Bu, hücresel disfonksiyonun herhangi bir nedenden dolayı kalp disfonksiyonuna katkısının karakterizasyonuna izin verir.

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Kalp hastalıklarının hücre temelinde Mevcut bilgi çok hayvan modelleri üzerinde yapılan çalışmalara dayanmaktadır. Burada açıklamak ve insan ventrikülün küçük cerrahi örneklerinden tek bir canlı kardiyomiyositlerin elde etmek için yeni bir yöntem doğrulamak. İnsan ventriküler miyositler elektrofizyolojik çalışmalar ve uyuşturucu testi için kullanılabilir.

Taze Cerrahi Örneklerden İzolasyon ve İnsan Ventriküler kardiyomiyositlerin Fonksiyonel Karakterizasyonu

Konjenital kalp kusurlarına yol açan mutasyonlar, gelişim sırasında kardiyak yapının in vivo araştırılmasından yararlanır, ancak fare embriyonik kalbindeki yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar teknik olarak zordur. Burada, gelişmekte olan fare kalbindeki kardiyomiyosite özgü yapıları değerlendirmek için sağlam bir immünofloresan ve görüntü analizi yöntemi sunuyoruz.

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

Bu iletişim kuralı bir dağınık şekilde detaylı Sonlu elemanlar modeli cardiomyocytes hücre içi mimarisinin elektron mikroskobu ve confocal mikroskobu görüntüler oluşturmak için yeni bir yöntem özetliyor. Bu dağınık şekilde detaylı model gücünü vaka çalışmaları kalsiyum sinyal ve bioenergetics kullanarak gösterilmiştir.

Cardiomyocyte sistemleri Biyoloji hücresel mimarisi rolü eğitim için bir Cardiomyocyte bir yapısal olarak gerçekçi Sonlu elemanlar geometrik Model oluşturma

Bu protokol, bir öbek sindirim yaklaşımı kullanarak yetişkin fare kalbi tek atriyal kardiyomiyositler izole etmek için kullanılır. Bu yaklaşım, yama kelepçe çalışmalarında atriyal miyosit elektrofizyolojisini karakterize etmek için kullanılabilecek sağ veya sol atriyal miyositleri izole etmek için kullanılır.

Yetişkin fareler atriyal Miyoksit izolasyonu

Miyositlerin ve miyosit olmayanların tek bir yetişkin fare kalbinin hem atria hem de ventriküllerinden eşzamanlı izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, yüksek oranda uygulanabilir kardiyak miyositlerin ve miyosit olmayanların tutarlı verimini sağlar ve fenotipleme ve in vitro analiz için en uygun hücreye özgü kültür koşullarını detaylandırmaz.

Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

Uygun bir sarcomere ağının oluşumu iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin olgunlaşması için önemlidir. Kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin yapısal olgunlaşmasının kantitatif değerlendirmesini sağlayan, kardiyak gelişimi teşvik eden kültür koşullarını iyileştirmek için süper çözünürlük temelli bir yaklaşım savuruyoruz.

Tek Moleküllü Lokalizasyon Mikroskobu Kullanılarak İnsan iPSC Kaynaklı Kardiyomiyositlerde α-Aktinin Ağının Analizi

Burada, önceden ayırt edilmiş insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositler, kardiyak fibroblastlar ve endotel hücrelerinden oluşan 3D kendi kendine monte edilmiş kardiyak mikrotissue dizileri oluşturmak için kullanımı kolay bir metodolojiyi açıklıyoruz. Kardiyak mikrotissues üretmek için teknik gerektiren bu kullanıcı dostu ve düşük hücre, hastalık modellemesi ve ilaç gelişiminin erken aşamaları için uygulanabilir.

İnsan iPSC Türevli Kardiyomiyositler, Kardiyak Fibroblastlar ve Endotel Hücreleri Kullanılarak 3D Kardiyak Mikrotissue Dizilerinin İmalatı

Fare modelleri, aritmogenezin temel mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Bu amaçla, yama-kelepçe ölçümleri yapmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gereklidir. Burada, kalsiyum geçicilerinin ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümlerine izin veren retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla murin atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

İzole sıçan miyositlerinde kalsiyum (Ca2+) geçici ölçümü ile birlikte sarkomer uzunluğu tespiti yoluyla kontraktil fonksiyonun ölçümünü tanımlayan bir dizi protokol sunulmaktadır. Bu yaklaşımın kalp yetmezliğinin hayvan modellerindeki çalışmalar için uygulanması da dahil edilmiştir.

Kemirgen Miyositlerde Kardiyak Kasılma Disfonksiyonu ve Ca2+ Geçicilerinin Analizi

Öğrenin, fare kalbinden izole edilen kulakçık ve karıncık kardiyak miyozitlerindeki boru membran ağlarını analiz etme yöntemini. Canlı hücre boyama ve konfokal mikroskopi ile kantitatif görüntü analizi sağlar.

Kulakçık ve karıncığa gelen kardiyak miyozitlerde Boru Membran Ağlarının Analizi

Daha fazla video keşfet