Anne Hücreleri ve dalgalanma Testleri Manyetik orting birleştiren Mitotic Hücre Yaşlanma sırasında Genom istikrarsızlık Analiz için Saccharomyces cerevisiae

Aşağıdaki deneyin genel amacı, artan replikatif ile mutasyon frekanslarındaki değişikliklerin olup olmadığını belirlemektir. Maya hücrelerinin yaşı, basitçe ek hücre bölünmesi turlarına veya biriken mutasyon oranlarındaki yaşa özgü değişikliklere bağlıdır. Bu, ilk olarak, hücre bölünmesinin her turunda mutasyon birikimi nedeniyle artan yaştaki hücreler için tahmini bir mutasyon frekansını hesaplamak için hücreleri seçici ve seçici olmayan ortamlara yayarak genç hücrelerdeki mutasyon frekanslarını ve oranlarını ölçerek elde edilir.

Daha sonra, bir maya hücresi popülasyonu, sıvı kültürde büyütülen biyotin ile etiketlenir ve orijinal etiketli hücreler, birkaç hücre bölünmesi geçirmiş yaşlı ana hücreleri elde etmek için manyetik sıralama ile geri kazanılır. Daha sonra yaşlı ana hücreler ya yaşlarını artırmak için yeniden büyütülür ve daha sonra tekrar sıralanır ya da popo izleri için boyanır ve daha sonra ortalama replikatif yaşlarını belirlemek için seçici ve seçici olmayan ortamlara yayılır ve mutasyon sıklığı deneysel olarak gözlemlenen mutasyon frekansının hücreler için tahmin edilen mutasyon frekansı ile karşılaştırılmasına dayalı olarak biriken mutasyonlarda yaşa özgü herhangi bir artış veya azalma olup olmadığını gösteren sonuçlar elde edilir. gözlenen ortalama yaş. Bu yöntem, yaşlanma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin genetik hasar biriktirme oranlarındaki değişiklikler normal yaşlanmaya katkıda bulunur mu veya kısmen mutasyon oranlarındaki değişikliklere bağlı olarak çeşitli genetik ve çevresel faktörlerin yaşam süresini değiştiren etkiler midir?

Prosedürü göstermek, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Melissa Patterson olacak, Standart kültür koşulları altında yetiştirilen hücreler için dalgalanma testleri kullanarak hücre üretimi başına bir temel mutasyon oranı oluşturmak. Her çoğaltma kültürü için, hücreleri bir ila 2000 oranında seyreltin ve mililitre başına koloni oluşturan birimleri belirlemek için seçici olmayan ortama bir ila dört mikrolitre yayın. Kalan hücreleri bir mikro santrifüjde bir dakika boyunca 2.400 Gs'de pelet haline getirin ve mutantları tanımlamak için seçici ortama yayılmadan önce bunları yeniden süspanse etmek için 100 mikrolitre su kullanın.

Plakaları üç gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, kolonileri sayın, charmy CCI'yi biyotin ile etiketlemek için ekteki metin protokolüne göre ilk mutasyon oranını ve sıklığını belirleyin Kültürü bir gliserol stoğundan YPD ortamına çizerek başlayın ve bir ila üç gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Steril bir pipet ucu kullanarak, hücreleri plakadan en az bir mililitre suya aktarın. Çizginin kalın bir şekilde büyümüş bir kısmının bir ila bir buçuk santimetresinin sekiz hücreye yaklaşık 10 vereceğini unutmayın.

Her suş veya tedavi koşulu için tam hücre yoğunluğunu belirlemek için bir hemo sitometre kullanın. Üreticinin standart prosedürüne göre toplama noktası başına 10 ila sekiz hücreyi etiketlemek için beş milimolar biyotin reaktif stoğu kullanın. Son yıkamadan sonra tüm santrifüjleme adımlarını dört santigrat derecede beş dakika boyunca gerçekleştirin.

Hücre canlılığını kontrol etmek için etiketli hücreleri mililitrede 10 ila sekiz hücreye asmak için su kullanın, 10 mikrolitre hücreyi 23 mikrolitre su ve 67 mikrolitre% 0.4 Triam mavisi ile seyreltin, bir XPBS'de hücreleri oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin, canlı veya lekesiz ve ölü veya lekeli hücreleri puanlamak için bir hemo sitometre kullanmadan önce. Hücre yaşı ve mutasyon sıklığı için temel değerleri ölçtükten sonra, metin protokolüne göre, biyotin etiketli hücreleri 20 mililitre YPD ortamına aktarın. Sekiz hücreyi taklit edin.

Kültürleri 20 santigrat derecede 16 ila 18 saat boyunca mililitre başına yaklaşık 10 ila sekiz hücreye kadar büyütün. Hücrelerin durağan faza ulaşmasına izin vermeyin ve gerekirse, büyüme süresinin ve toplanmanın zamanlamasını optimize etmek için hücreleri birkaç saat boyunca dört santigrat derecede tutun. Hücre yoğunluğunu belirledikten ve hücreleri dört santigrat derecede peletledikten sonra, 30 mililitre boncuk etiketleme, tampon ve girdap ekleyerek hücreleri yıkayın, ardından süspansiyonu döndürün ve süpernatanı dökün.

İkinci bir yıkamadan sonra, hücreleri 50 mikrolitre boncuk etiketleme tamponunda askıya alıyoruz. Girdap yaparak toplam sekiz hücreye sahip gibi yapın. İki mikrolitre manyetik boncuk ekleyin, toplam sekiz hücreye benzer şekilde yapın ve girdaptan sonra, periyodik olarak ters çevirerek 10 dakika boyunca buz üzerinde kısa bir süre inkübe edin.

Ardından, hücreleri üç kez yıkamak için 30 mililitre boncuk etiketleme tamponu kullanın. Ardından 0,5 mililitre boncuk etiketleme tamponu ekleyin. Toplam sekiz hücreyi taklit edin ve peleti, hücreler yeniden askıya alınana kadar orta bir ayarda kısaca girdaplayın.

Kalan hücre kümelerini çıkarmak için süspansiyonu 40 mikronluk bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe dökün. Gerekirse, kolona yüklemeden önce hücreleri bir ila iki saat buz üzerinde bırakın. Manyetik sütunlar için üreticinin önerdiği protokolü izleyin, her biri 10 ila dokuz toplam hücreye iki kez

Kolonları yüklerken havalandırılabilir olanları çıkarmaya dikkat edin ve hücrelerin boncuklar arasında sıkışmasını önlemek için yıkamalar arasında ayırıcı üzerindeki kolonu çıkarıp değiştirin. Aynı numunenin birden fazla sütununu işlemek için çok sütunlu ayırıcılar kullanırken, işlem süresini kısaltmak ve istenirse hücre kaybını azaltmak için hepsini aynı toplama tüpüne boşaltın. Hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 3000 Gs'de santrifüjleme ile konsantre ettikten sonra ana hücreler tarafından üretilen genç hücreleri analiz etmek için bağlama ve yıkama adımlarından geçen akışı kaydedin, bir mililitre tampon hariç hepsini aspire edin.

Sekiz orijinal biyotin etiketli hücreyi taklit edin. Daha sonra kalan tampondaki hücreleri askıya almak için kısa bir süre girdap yapın. Seyreltilmiş hücrelerin bir alikotunu boyamak için triam mavisi kullanın ve hücre yoğunluğunu ve canlılığını belirlemek için bir hemo sitometre kullanın.

Ardından kurtarılan toplam hücre sayısını hesaplayın. Hücre sayısı beklenenden önemli ölçüde yüksekse, kontamine olan genç hücreleri çıkarmaya çalışmak için elüsyon örneğini başka bir sütundan geçirin. Hücre sayısı beklenenden önemli ölçüde düşükse, kaydedilen akışı geçirin.

İstenirse ana hücrelerin verimini artırmaya çalışmak için başka bir sütundan numune alın. Replikatif yaşı artırmak için hücreleri yeniden büyütün ve biyotin etiketlemesi olmadan boncuk etiketleme ve sıralamayı takip edin. Replikatif yaşı belirlemek için, 25 mikrolitre geri kazanılmış hücreyi 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücrelerin yüzeyindeki tomurcuk izlerini etiketlemek için hücreleri iki kez yıkamak için bir mililitre XPBS kullanın.

Hücreleri yeniden süspanse etmek için 180 mikrolitre bir XPBS ve 20 mikrolitre floresan konjuge WGA kullanın, 1.5 mililitrelik santrifüj tüpünü folyo ile örtün ve inkübasyondan sonra 30 dakika boyunca 30 santigrat derecede hafifçe sallanarak inkübe edin. Hücreleri üç kez yıkamak için bir XPBS kullanın. Daha sonra floresan mikroskobu için, görüntüleme sırasında hücre hareketini önlemek için hücreleri slaytlara monte etmek için bir Antifa reaktifi kullanın.

Slaytları karanlıkta birkaç güne kadar tamamen kürleyin. Hücre yaşının temsili bir ölçüsünü elde etmek için numune başına en az 50 hücrede tomurcuk izlerini sayın. Alternatif olarak, hücreleri bir XPBS'de askıya aldıktan sonra, metin protokolünde belirtilen ayarları kullanarak akış sitometrisi gerçekleştirin: Y ekseninde mikroskopi ile sayılan genç hücreler ve yaş hücreleri üzerindeki tomurcuk izlerini, x eksenindeki aynı hücre popülasyonlarından WGA konjuge floresansının normalleştirilmiş geometrik ortalamasına karşı

Son olarak, bu ilişki için doğrusal bir eğilim çizgisinin denklemini elde edin Sonraki ikame için, denklemdeki X için bir hücre popülasyonunun WGA eşlenik floresan yoğunluğunun normalleştirilmiş geometrik ortalaması ve bir numunenin ortalama hücre yaşını belirlemek için Y'yi çözün. Bu grafik, bir gen kutusundaki mutasyon oranının, biyotin etiketlemesinden önce ve sonra benzer olduğunu göstermektedir: Bağımsız genç maya popülasyonlarında, bir mutasyon frekansları, 20 santigrat derece veya 30 santigrat derecede büyütüldüğünde biyotin etiketlemesinden önce ve sonra genç hücrelerde de benzerdi. Burada gösterilen grafik, biyotin etiketlemesinden sonra geri kazanılan hücrelerin sayımı ve tedavi edilmemiş hücrelerin veya ilk sıralamadan sonra bir milimolar hidrojen peroksit ile muamele edilen hücrelerin sınıflandırılması sırasında nelerin gözlemlenebileceğini göstermektedir.

Hücre sayısı, ilk sıralamadan sonra beklenenden daha yüksek görünebilir ve devam eden sıralama ile küçük bir ilerleyici hücre kaybı beklenir. Replikatif yaş, floresan etiketli floresanların manuel sayımı ile belirlendi, ancak bu şekilde görüldüğü gibi burada gösterildiği gibi hücreler üzerindeki yara izleri belirlendi. Akış sitometrisinden elde edilen floresan ancak yara izi sinyali, anne ve kontrol hücresi popülasyonlarının replikatif yaşının akış sitometrisi ile belirlenmesine izin veren doğrusal bir ilişki elde etmek için manuel sayımlarla karşılaştırıldı.

Bu grafikler, ana hücrelerin ortalama yaşından ve genç hücre popülasyonları için elde edilen mutasyon frekansları ve oranlarından hesaplanan tahmin edilen frekanslara kıyasla, yaşlı ana hücrelerin benzer veya yüksek gözlenen mutasyon frekanslarının örneklerini göstermektedir. Bu prosedürü takiben bir genin genomik konumuna bağlı olarak bir gen olabilir. Hücre fizyolojisindeki hangi değişikliklerin mutasyon birikimindeki yaşa bağlı değişikliklerle ilişkili olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için reaktif oksijen türleri veya ular morfoloji için boyama gibi başka yöntemler de kullanılabilir.