Name: Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon ile Burun Biyopsi Kombine yoluyla elde Koku Nöronlar: Mental Bozuklukların Tedavi Tepki Eğitim Bir Potansiyel Yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Öğrenin, lazer yakalama mikrodisseksiyon ve Real Time RT PCR kullanarak burun biyopsisinden elde edilen koku epitelinde bipolar bozukluk tedavi yanıtlarını moleküler düzeyde analiz etme yöntemini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma USPHS hibeleri MH-091460 (E.N.), MH-084018 (A.S.), MH-094268 Silvo O. Conte center (A.S.), MH-069853 (A.S.), MH-085226 (A.S.), MH-088753 (A.S.), MH-092443 (A.S.) ve MH-096208 (K.I.), DANA (E.N.), Stanley (A.S.), RUSK (A.S.), S-R vakıfları (A.S.), NARSAD (A.S. ve K.I.), ve Maryland Kök Hücre Araştırma Fonu (AS, KI).
Pearl Kim, Maria Papapavlou, Nao Gamo, Youjin Chung, Yukiko Lema ve Mark Christie'nin biyopsi sürecinin koordinasyonuna yönelik çabalarını ve katkılarını içtenlikle takdir ediyoruz.

NOT: Bu çalışmada tüm araştırma gönüllüleri Howard Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu ve Johns Hopkins Üniversitesi tarafından onaylanmış bilgilendirilmiş onam belgeleri verildi. Bilgilendirilmiş onam belgeleri imzalayarak razı Sadece katılımcılar çalışmaya alındı. Bu analiz için çalışma baz oluşuyordu: 20 denek (12 BD ve 10 kontroller;% 30 erkek) ve 38.2 (14.1) yaşını (sd) anlamına gelir. NOT: cam ve plastik yüzeyler RNaz kontaminasyonu kaldırmak için RNaz Zap ile tüm yüzeyleri püskürtün. 1. Biyopsi Prosedürü <ol><li> Çalışma katılımcının burun boşluğunda topikal lidokain (xylocaine) sıvı% 4 ve oksimetazolin HCI 0.05% Sprey ve zaman uyuşturma 15 dakika bekleyin. </li><li> Lidokain ve oksimetazolin oluşan bir karışım içinde yarım x 3 inç cerrahi cottonoids daldırın ve burun bölmesinin üst kısmı boyunca, burun boşluğunda yerleştirin ve 15 dakika bekletin. </li><li> 30 ° sert kullanmanazal endoskop, nazal kavite üst bölümünü bulun birkaç küçük örnekleri alarak, burun septum üstün kısmından yukarı-ısırma burun forseps kullanarak burun mukozasının kaldırmak için. </li></ol> Doku Blokları 2. Hazırlık <ol><li> Hemen önce biyopsi, doku ortamı dondurma standart boy cryomolds doldurun. </li><li> Otoklava cımbız kullanarak, dondurma ortamda taze doku monte ve kuru buz üzerinde dondurma. , Dondurma ortamı ile cryoblock kalanını doldurun kuru buz cryoblock dondurma ve -80ºC de mağaza blokları. </li></ol> 3. Cryosectioning <ol><li> Cryosectioning hemen önce polietilen (PEN) membran cam slaytlar hazırlayın. 5 dakika boyunca RNaz Zap çözelti ile slaytlar püskürtün. Sonra dietilpirokarbonat (DEPC) su içinde slaytlar durulayın ve 30 dakika kurumasını sağlar. 30 dakika UV ışık altında kurutulmuş slaytlar etkinleştirin. </li><li> Cryosection her 30 um tamamen bloke eder. Kuru i slaytlar tutunCE ve bölümler mümkün olduğu kadar donduruldu. Tamamlanmasıyla -80 ºC Mağaza slaytlar. </li></ol> 4. Lazer-Yakalama Mikrodisseksiyon <ol><li> Hemen önce Mikrodiseksiyon slaytları suyunun başlayın. % 60 (2 mi, 15 saniye) ile,% 80 (2 mi, 15 saniye) ile,% 95 (3 mi, 25 sn), 100: Her bir slayt aşağıdaki etanol serisi uygulanır, sonra donmuş slaytlar Let 10 sn için çözülme ve % (7 mi, 60 saniye). </li><li> Üzerine fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) mikroskop çevirin ve set aşağıdaki koşullara: 82 enerji set 10X büyütme için, 74&#39;e odaklanmak ve hız 25 - 30. 20X büyütme için, 63 enerji ayarlamak, 67 odak, ve hız 5 - 6 optimum kesim sonuçları elde etmek için gerekli ayarlayın. </li><li> Görme 20X veya 10X büyütme kullanarak nöronlar tespit. Boyama işlemi kullanılmadan bir mikroskop altında yatan alt mukoza ince yüzey koku nöron tabakası ayırt eder. Yoğun sütunlu görünüm 18 olarak nöronlar gözlemleyin.</li><li> Aşama 4.2 Yukarıda bahsedilen mikroskop Kalem fonksiyonunu kullanarak, nöronal tabaka etrafına iz. Lazerden nöronların yanmasını önlemek için biraz uzakta nöronlardan Trace. Bu yüksek kalitede RNA elde etmek için gereklidir. Sonra lazer güdümlü kesim başlatmak. </li><li> Ince uçlu mikrodiseksiyon forseps kullanılarak disseke bölümleri Pick up ve buz üzerinde 100 ul lizis tamponu içeren bir mikro doku koymak. Tek bir örnekten elde edilen tüm nöronal bölümler için tekrarlayın. 50 dakika geçmemelidir numune başına toplam diseksiyon zamanı. </li><li> Diseksiyon tamamlandıktan hemen vorteks örnek lizatları ve kuru buz üzerinde tutmak kez. Toplam RNA izolasyonu için -80ºC Mağaza örnekleri. </li></ol> Toplam RNA ve Kalite Kontrol Analizi 5. izolasyonu <ol><li> Buz üzerinde çözülme örnek lizatları. (Bkz hiçbir değişiklik ile üreticinin protokolünü takip ederek DNaz-ı inaktivasyonu ile RNAqueous Mikro Kit ile toplam RNA izolasyonu yürütmek &lt;strong&gt; Şekil 1). Toplam elüsyon hacmi yaklaşık 20 ul. </li><li> RNA konsantrasyonu ölçmek ve Bioanalyzer kullanarak RNA Bütünlük sayısı (RIN) ile RNA kalitesini değerlendirmek. Şekil 2 &#39;de kalite kontrol kriterleri yerine getiren örnekler, cDNA sentezi için de kullanılabilir. </li></ol> 6. cDNA Sentezi <ol><li> Bir valide ticari kit kullanılarak cDNA sentez (Reaktifler bkz: İçindekiler). Tüp başına 8 ul toplam hacmine RNA (durumuna bağlı olarak) ve RNazsız su içinde 1.0 ng 0.1 - birleştirerek tavlama aşamasını gerçekleştirir. Daha sonra 10 ul toplam hacim için, tüp başına karışımı oligo d (T) 20 primeri 1 ul 10 mM dNTP ve 1 ul ekle. </li><li> 5 dakika boyunca 65 ° C &#39;de yavaşça girdap ve santrifüj örnekleri ve tavlama örnekleri. Buz üzerinde, reaksiyon tamamlandıktan sonra, derhal soğuk örnekler. </li><li> Tablo 1&#39;de özelliklerine göre ana karışımı çözeltisi hazırlayın. Sonra 9.5 μ eklemekHer tüpe l ana karışımı ve ticari olarak hazırlanmış ters transkriptaz (RT), 0.5 ul. Yerine RT tüp kontrol etmek için 0.5 ul RNaz içermeyen su ilave edilir. </li><li> Hiçbir bisiklet ile 50 dakika, 5 dakika ve son 4 ºC tutuş için daha sonra 85 ºC 50 ºC ilk inkübasyon ile RT reaksiyonu çalıştırın. </li><li> Su ve bölümüyle 5x bütün örnekleri sulandırmak. -80 ° C&#39;de saklayın örnekleri. </li></ol> 7. Real Time PCR - Nöronal Zenginleştirme Onayla <ol><li> . Tablo 2&#39;de özelliklerine göre ana karışımı çözüm hazırlayın gibi GAPDH gibi bir iç kontrol kullanın. Nöronal zenginleştirme belirlemek için undissected dokuda OMP ifade ile microdissected dokuda koku markör proteini (OMP) ifade Karşılaştırması. NOT: OMP koku nöronlar için bir belirteç olduğunu. OMP dizisi: İleri, 5&#39;-CTGTCGGACCTGGCCAAG-3 &#39; , geri 5&#39;-CACCCTCGCCAAAGGTGA-3 &#39; GAPDH dizisi: İleri, 5&#39;-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 &#39; ters 5&#39;-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 &#39;. </li><li> CDNA her bir kuyu ve 3 ul ana karışımı 7 ul ekleyerek PCR plakasını ayarlayın. </li><li> 300 xg (1.300 rpm) 5 dakika santrifüj plakası. Böyle SYBR Greener qPCR gibi ticari Supermix için belirtilen varsayılan termal döngü koşulları kullanılarak Çalışma Real Time PCR reaksiyonu. </li><li> Veri (özellikler için bakınız Şekil 2) analiz edin. </li></ol> 8. Gerçek Zamanlı PCR, - söz konusu genler sentezlenmesi <ol><li> 2 kat veya daha fazla nöron zenginleşme göstermektedir numuneler üzerinde gerçekleştirin. </li><li> Her prob Tablo 3&#39;te özelliklerine göre ayrı tüplere (faiz ve VIC-etiketli GAPDH FAM-etiketli prob) için buz üzerinde ana karışımı hazırlayın. </li><li> CDNA her bir kuyu ve 2 ul 8 ul ana karışımı ile bir PCR plakasını ayarlayın. </li><li> 300 xg (1300 rpm) 5 dakika boyunca plaka santrifüjleyin. Def kullanarak Real Time PCR reaksiyonu çalıştırınüretici tarafından sağlanan gen ifadesi usta karışımı protokolü uyarınca ault termal döngü koşulları. Ifade sonuçlarını (özellikler için bakınız Şekil 2) analiz edin. </li></ol>

<ol><li>Goodwin, F. K., Jamison, K. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodwin%2C+FK+%22Manic-depressive+illness%22">Manic-depressive illness</a>. , Oxford University Press. (1990).</li>
<li>Einat, H., Manji, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+plasticity+cascades%3A+genes-to-behavior+pathways+in+animal+models+of+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cellular plasticity cascades: genes-to-behavior pathways in animal models of bipolar disorder.</a> Biol Psychiatry. 59 (12), 1160-1171 (2006).</li>
<li>Severino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenomics+of+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenomics of bipolar disorder.</a> Pharmacogenomics. 14 (6), 655-674 (2013).</li>
<li>Beech, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+differences+in+peripheral+blood+between+lithium+responders+and+non-responders+in+the+Lithium+Treatment-Moderate+dose+Use+Study+%28LiTMUS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">Gene-expression differences in peripheral blood between lithium responders and non-responders in the Lithium Treatment-Moderate dose Use Study (LiTMUS).</a> Pharmacogenomics J. 14 (2), 182-191 (2013).</li>
<li>Horiuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+cells+via+nasal+biopsy+reflect+the+developing+brain+in+gene+expression+profiles%3A+utility+and+limitation+of+the+surrogate+tissues+in+research+for+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Olfactory cells via nasal biopsy reflect the developing brain in gene expression profiles: utility and limitation of the surrogate tissues in research for brain disorders.</a> Neurosci Res. 77 (4), 247-250 (2013).</li>
<li>Dryer, L., Graziadei, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+the+olfactory+bulb+in+an+elasmobranch+fish%2C+Sphyrna+tiburo%3A+segregation+of+inputs+in+the+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Projections of the olfactory bulb in an elasmobranch fish, Sphyrna tiburo: segregation of inputs in the telencephalon.</a> Anat Embryol (Berl. 190 (6), 563-572 (1994).</li>
<li>Hahn, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+neurogenesis+in+human+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro neurogenesis in human olfactory epithelium.</a> J Comp Neurol. 483 (2), 154-163 (2005).</li>
<li>Cascella, N. G., Takaki, M., Lin, S., Sawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+involvement+in+schizophrenia%3A+the+olfactory+epithelium+as+an+alternative+model+for+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental involvement in schizophrenia: the olfactory epithelium as an alternative model for research.</a> J Neurochem. 102 (3), 587-594 (2007).</li>
<li>Sawa, A., Cascella, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+olfactory+system+for+clinical+and+basic+psychiatry%3A+a+promising+entry+point+to+the+mystery+of+brain+mechanism+and+biomarker+identification+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Peripheral olfactory system for clinical and basic psychiatry: a promising entry point to the mystery of brain mechanism and biomarker identification in schizophrenia.</a> Am J Psychiatry. 166 (2), 137-139 (2009).</li>
<li>Mor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-382+expression+is+elevated+in+the+olfactory+neuroepithelium+of+schizophrenia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-382 expression is elevated in the olfactory neuroepithelium of schizophrenia patients.</a> Neurobiol Dis. 55, 1-10 (2013).</li>
<li>Kano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiling+of+multiple+histone+methylations+in+olfactory+cells%3A+further+implications+for+cellular+susceptibility+to+oxidative+stress+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiling of multiple histone methylations in olfactory cells: further implications for cellular susceptibility to oxidative stress in schizophrenia.</a> Mol Psychiatry. 18 (7), 740-742 (2013).</li>
<li>Toritsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficits+in+microRNA-mediated+Cxcr4%2FCxcl12+signaling+in+neurodevelopmental+deficits+in+a+22q11+deletion+syndrome+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Deficits in microRNA-mediated Cxcr4/Cxcl12 signaling in neurodevelopmental deficits in a 22q11 deletion syndrome mouse model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17552-17557 (2013).</li>
<li>Evgrafov, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+neuroepithelium-derived+neural+progenitor+cells+as+a+model+system+for+investigating+the+molecular+mechanisms+of+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatr+Genet%22%5BJournal%5D)">Olfactory neuroepithelium-derived neural progenitor cells as a model system for investigating the molecular mechanisms of neuropsychiatric disorders.</a> Psychiatr Genet. 21 (5), 217-228 (2011).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+dynamics+are+altered+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion dynamics are altered in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 74 (6), 418-426 (2013).</li>
<li>Ishizuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+symptoms+of+schizophrenia+correlate+with+impairment+on+the+University+of+Pennsylvania+smell+identification+test%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Negative symptoms of schizophrenia correlate with impairment on the University of Pennsylvania smell identification test.</a> Neurosci Res. 66, 106-110 (2010).</li>
<li>Sattler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+nasal+olfactory+epithelium+as+a+dynamic+marker+for+CNS+therapy+development%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human nasal olfactory epithelium as a dynamic marker for CNS therapy development.</a> Exp Neurol. 232 (2), 203-211 (2011).</li>
<li>Rimbault, M., Robin, S., Vaysse, A., Galibert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+profiles+of+rat+olfactory+epithelia%3A+individual+and+age+related+variations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">RNA profiles of rat olfactory epithelia: individual and age related variations.</a> BMC Genomics. 10, 572(2009).</li>
<li>Tajinda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+biomarkers+from+patients+with+mental+illnesses%3A+a+novel+method+through+nasal+biopsy+combined+with+laser-captured+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Neuronal biomarkers from patients with mental illnesses: a novel method through nasal biopsy combined with laser-captured microdissection.</a> Mol Psychiatry. 15 (3), 231-232 (2010).</li>
<li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+molecular+analysis+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).</li>
<li>Fink, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+RT-PCR+after+laser-assisted+cell+picking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative RT-PCR after laser-assisted cell picking.</a> Nat Med. 4 (11), 1329-1333 (1998).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Nurnberger, J. I. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+interview+for+genetic+studies.+Rationale%2C+unique+features%2C+and+training%5BTitle%5D)+AND+%22NIMH+Genetics+Initiative.+Arch+Gen+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Diagnostic interview for genetic studies. Rationale, unique features, and training.</a> NIMH Genetics Initiative. Arch Gen Psychiatry. 51 (11), 849-859 (1994).</li>
<li>Montgomery, S. A., Asberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+depression+scale+designed+to+be+sensitive+to+change%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A new depression scale designed to be sensitive to change.</a> Br J Psychiatry. 134, 382-389 (1979).</li>
<li>Young, R. C., Biggs, J. T., Ziegler, V. E., Meyer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rating+scale+for+mania%3A+reliability%2C+validity+and+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A rating scale for mania: reliability, validity and sensitivity.</a> Br J Psychiatry. 133, 429-435 (1978).</li>
</ol>

Yazarlar ticari çıkarları ile finansal ilişkileri rapor.

Burun biyopsi ve LCM birleştirerek zenginleştirilmiş koku nöronal katmanları elde etmek için bir yeni bir platform sunulmuştur ve bu çalışmada onaylanmıştır. Bu teknik yaygın etkileri olabilir. Bu alanda daha geniş bir etki yaparak, tedaviye yanıt için olanlar da dahil olmak üzere biyomarkır çalışmaları, ve diğer nöropsikiyatrik durumlar için ilaç keşfi çabalarına uygulanabilir. Mansap uygulamalara yatkın, yüksek kaliteli nöronlar elde etmek için, bir kaç kritik ve sorun giderme adımları dik...

Bipolar bozukluk (BD) ruh patolojik değişiklikler ile karakterize ciddi nöropsikiyatrik bozukluk olduğunu, sürücü ve biliş 1. BD tedavisi için kullanılan lityum hayvan çalışmalarında 2 gen çok sayıda sabit durum mRNA seviyeleri değiştirdiği gösterilmiştir, fakat bu moleküllerin herhangi insanlarda 2, klinik yanıt ile ilişkili olup olmadığını da bilinmemektedir. Lityum yanıt mekanizmasını anlamak nöronal dokularda lityum-kaynaklı moleküler değişikliklerin araştırıldığı gerektirecektir. Ne yazık ki, BD hastalarının beyin biyopsileri öncesi ve sonrası lityum tedavisi lityum yanıt moleküler imzalarını tespit elde etmek pratik değildir. Otopsi beyin dokuları BD biyomarkerları incelemek için kullanılır olmuştur, ancak, duygular, biliş ve sürücü dinamik değişiklikleri ile ilişkili moleküler belirteçler değerlendirmek için kullanılamaz; ve geriye dönük tespit lityum tedaviye yanıt geçerliliği sorunlu olabilir 4. Lenfositler ve diğer kan hücreleri yararlı olabilir, ancak kan hücrelerinde moleküler değişiklikler nöronal değişiklikleri 3-5 yansıtmayabilir. Beyin omurilik sıvısı hastalığıyla ilişkili ve ilaç-geri dönüşümlü içsel değişiklikleri yansıtıyor olabilir hücre içi moleküller hakkında bilgi edinmek için yetersiz olabilir. koku epiteli (OE) merkezi sinir sistemi (MSS) eşsiz bir parçasıdır, limbik yapılara 6 embriyolojik ilgili; ve burun biyopsi ile kolayca erişilebilir. Bu oluşur glial benzeri gelişme 7-9 farklı aşamalarında (yani, sustentacular) hücreleri, bazal çoğalan hücreleri ve koku reseptör nöronlar destekler. Bu nedenle, OE accessibly nöropsikiyatrik hastalıklara 7 olan hastaların MSS dinamik değişiklikleri incelemek için eşsiz bir fırsat sunuyor. Çalışmalar bu occ yansıtan hastalıkla ilişkili olayları araştırmak için bir vekil doku olarak OE programı gösteriyorlarbeyin nöronlarının 8,9 urring. Örneğin, çalışmalar psikiyatrik koşullar 10-14 ile ilişkili moleküler profilleri araştırmak için OE kullanmıştır. Koku sistem aynı zamanda şizofreni 15 negatif belirtiler ile ilişkili koku açıkları gibi klinik endophenoytpes tanımlamak için hizmet vermektedir. Ayrıca, nörogelişimsel süreçleri psikiyatrik durumlar 8,9 patofizyolojisinin modellemek için yararlı bir yol sağlayan, hayat boyu OE devam ediyor. Bununla birlikte, bu doku kullanımı için bir sakınca nöronal olmayan hücrelerin 16 koku biyopsilerin önemli konu, kirliliktir. Örneğin, önceki OE çalışmalarında, gen ifade çalışmaları için kullanılmıştır toplam RNA, nöronal olmayan hücrelerin 17 RNA dahil olmak üzere tüm burun biyopsi dokusundan ekstre RNA içeriyordu. Bu nedenle, önceki yaklaşımlar hücre kalitesi ile sınırlı kalmıştır. Bu sorunu aşmak için, yeni bir yaklaşım elde etmek<html> Lazer-yakalama mikrodiseksiyonu (LCM) ile burun biyopsi birleştirerek zenginleştirilmiş nöronal hücre popülasyonları 18 geliştirilmiştir. LCM enfraruj lazer 19-21 ile birlikte, UV lazer kesim kullanılarak hücrelerin seçici izolasyonu sağlayan bir tekniktir. OE yaklaşımı ile birleştirilmesi lcm böylece nöronal hücrelerin 18 zenginleştirilmesini artırılması, nöronal olmayan hücreler tarafından OE önemli kirlenmesini en aza indirir. Ayrıca, nöronal tabaka bu şekilde boyama için ihtiyacı ortadan kaldırarak, bir mikroskop altında alt mukoza tabakası ayırt edilebilir. Nöronal hücre tipleri daha fazla ilgi 7 hücre tipi ile ifade edilir, birincil antikorlar kullanılarak diğer hücre popülasyonlarından ayırt edilebilir. Bu nedenle, bu prosedür, gen ekspresyon çalışmaları, immünohistokimya ve diğer morfolojik araştırmalar için kullanılabilir hemen hemen tamamen nöronal hücre popülasyonunun zenginleştirilmesi için daha kolay bir yöntem ortaya koymaktadır. ve_content &quot;&gt; Bu çalışma hastalık durumlarında ve tedavi yanıtı ile ilişkili koku nöronlar moleküler değişiklikleri araştırmak için deneysel bir platform oluşturmayı amaçlamaktadır. Bu adres için, BD için DSM-IV tanı ölçütlerine göre sigara içilmeyen hastaların küçük bir set dayalı Genetik Çalışmaları Tanı Görüşmesi (DIG) 22 iki burun biyopsi geçmesi işe edildi: lityum ve ikinci biyopsi ile bir biyopsi ön arıtma, günlük oral lityum tedavisinin 6 hafta sonra Ayrıca, uygun BD hastalar olmalıdır:. depresyonun için semptomatik Montgomery-Asberg Değerlendirme Ölçeği (MADRS) 23 uygulanan klinisyen içinde 60 ≥10 puanlama dayalı (YMÖ&#39;nin) hipomani veya mani için semptomatik, Young-Mani Derecelendirme Ölçeği klinisyen üzerinde 56 arasında bir skor ≥10 dayalı . 24;. MADDÖ ve iki ölçek için klinisyenler arasındaki anlaşmanın YMRS Değerlendirici-Inter-Değerlendirici katsayısı hem veya ≥10 biyopsi sonra, nöronlar Enri 0.96 idi&gt; olanLCM tarafından OE dür. Doku ve nöronal zenginleştirme yüksek kaliteli RNA&#39;nın çıkarılmasını sağlamak için, ek kalite kontrol önlemleri ardından, Real Time RT-PCR ilgi genlerin öncesi ve tedavi sonrası ifade düzeylerini araştırmak amacıyla yapılmıştır. takip eden bölümlerde bir bu yaklaşımın geçerliliğinin açıklamasını, protokol optimizasyonu vurgulayarak ve sorun-çekim protokolü uygulanmıştır stratejileri içerir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Doku Hazırlama</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Kalıpları</td><td>Sakura Finetek</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Bileşiği</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cryosectioning</td></tr><tr><td>Membran Slayt 1.0 PEN (D)</td><td>Carl Zeiss Mikroskopi</td><td>415190-9041-000</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>DEPC Arıtılmış Su Kalitesi</td><td>Biyolojik</td><td>351-068-131</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microdiseksiyon</td></tr><tr><td>Mikroskop: PALM Serisi Mikrolazer Sistemi</td><td>Carl Zeiss Mikroskopi</td><td></td><td>Model: Axiovert 200M 
Yazılım: Robo v3.2</td></tr><tr><td>No. 5 Dumont Mikrodissction Forseps</td><td>Roboz</td><td>RS-49085</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">RNA Ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>RNAqueous Mikro Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">cDNA Sentezi</td></tr><tr><td>SuperScript III İlk İplik Sentez Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">OMP qPCR</td></tr><tr><td>SYBR GreenER qPCR SuperMix</td><td>Invitrogen</td><td>11760-500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Taqman qPCR</td></tr><tr><td>TaqMan Ekspresyon Test Probları</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>Çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gen Ekspresyonu Master Mix</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4369016</td><td></td></tr></tbody></table>

lazer yakalama mikrodisseksiyon ile burun biyopsi kombine yoluyla elde koku nöronlar: mental bozuklukların tedavi tepki eğitim bir potansiyel yaklaşım

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar bozukluk (BD) az anlaşılan patofizyolojisi ile ciddi bir nöropsikiyatrik bozukluk olduğunu ve genellikle duygudurum dengeleyici, lityum karbonat ile muamele. Hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalar ayrıca insan genetik çalışmalar lityum nöronal büyüme, hayatta kalma ve olgunlaşması ve Wnt sinyal katılan özellikle moleküller yer alan moleküler hedefleri etkilediğini göstermektedir. Merkezi sinir sistemi (MSS) lityum-yanıt ile ilişkili dinamik moleküler değişiklikler araştırmak için beyin biyopsileri elde etik sorun göz önüne alındığında, kimse bu goal.The koku epiteli koku reseptör nöronları içeren ulaşmak için koku dokulardan elde edilen nöronların kullanımını düşünebilirsiniz geliştirilmesi ve glial benzeri hücreleri desteklemek farklı aşamalarında. Bu güvenle burun biyopsi elde edilen koku doku kullanarak, nöropsikiyatrik hastalıklarda MSS dinamik değişiklikleri incelemek için eşsiz bir fırsat sunuyor. Subst oluşturduğu güçlüğün üstesinden gelmek içinnöronal olmayan hücreler biyopsi yapılan koku doku antial kirlenme, zenginleştirilmiş nöronal hücre popülasyonu elde etmek için yeni bir yaklaşım, lazer yakalama mikro-kesim ile burun biyopsi birleştirerek geliştirilmiştir. Bu çalışmada, nöronal dokuda tedavi ile ilişkili dinamik moleküler değişiklikler araştırmak için bir sistem lityum tedaviye yanıt moleküler mekanizmaların çalışması için işe BD hastalarının küçük bir pilot örneği kullanılarak, geliştirilmiş ve onaylanmıştır.

Moleküler imza çalışmada protokol ve sorun giderme stratejisi başarıyla optimize edildi. Numuneler için, RNA kalitesi ve nöronal zenginleştirme kriterleri daha sonraki alt akış Anlık-PCR analizi kullanılmak üzere standardize edildi. RIN ve RNA konsantrasyonu tespit ifade düzeyleri karıştırıcı faktörler olarak incelendi. 1 arasında değişen rin birkaç numune analize dayalı olarak - 10, yukarıda ~ 3.0 ve en az RIN Bu çalışmada alt analizi için yeterli olduğu tespit edilmiştir. Bunun bir sonucu olarak, cDNA sentezi için bir...

Bu çalışmada, yeni bir platformu geliştirdi ve valide edilmiş bipolar bozukluk (BD) tedavi yanıtının intranöronal moleküler imzaları araştırmak. BD hastaların Koku epitel burun biyopsi ile elde edildi. Sonra lazer yakalama mikrodiseksiyon BD lityum yanıt moleküler imza araştırmak için Gerçek Zamanlı RT PCR ile kombine edilmiştir.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon ile Burun Biyopsi Kombine yoluyla elde Koku Nöronlar: Mental Bozuklukların Tedavi Tepki Eğitim Bir Potansiyel Yaklaşım

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Bu prosedür, koku alma epitel dokusundan nöronal katmanları izole etmek için lazer yakalama mikro diseksiyonunun kullanımını detaylandırır ve ayrıca bazı aşağı akış gen ekspresyon analizlerini ana hatlarıyla belirtir. Koku alma epitel dokusunu elde etmek için burun biyopsisi ile başlayın. Daha sonra nöronal katmanları izole etmek için lazer yakalama mikrodiseksiyonu yapın.Daha sonra örneklerden RNA'yı izole edin. CDNA için ters transkripsiyon yapın ve QPCR ile gen ekspresyonunu analiz edin. Sonuç olarak, lazer yakalama mikrodiseksiyonu, zenginleştirilmiş bir nöron popülasyonunun koku alma epitel dokusundan izole edilebileceğini ve çok sayıda aşağı akış uygulamasına uygulanabileceğini göstermek için kullanılır.Bu tekniğin nöronal hücre kültürleri gibi mevcut metallere göre temel avantajı, nöronal bağlamda hem durum hem de dinamik değişiklikleri incelememize izin vermesidir. Bu proje için ilk olarak, zenginleştirilmiş nöronal popülasyonlar elde etmek için lazer yakalama mikro diseksiyonunu koku biyopsileri ile birleştirmenin potansiyelini keşfettiğimizde aklımıza geldi. Bu yöntem TDA tarafından kurulmuş ve gösterilmiştir.Bu metodolojiyi genişlettik ve hastalarda aşağı akış Q-R-T-P-C-R analizini birleştirdik ve prosedürü gösteren kontroller, Johns Hopkins Üniversitesi'ndeki ekibimizden bir teknisyen olan Chen Chung olacak. Aşağıdaki prosedürler Johns Hopkins tesislerinde çekilecektir: Mikro diseksiyondan hemen önce. Donmuş slaytların 10 saniye boyunca çözülmesine izin verin, ardından metin protokolünde belirtilen süreleri ve hacimleri kullanarak bir etanol serisi kullanarak dokuyu kurutun.Fotoğrafla etkinleştirilen lokalizasyon için mikroskobu açın. Mikroskopi, 10 x büyütme koşullarını 82 x büyütme için 82 enerji, 74 odak ve 25 x büyütme için 30 ila 20 hız olarak ayarladı. Enerjiyi 63'e, odaklanmayı 67'ye ve hızı beşe altıya ayarlayın.Şimdi 20 x veya 10 x büyütme kullanarak nöronları görsel olarak tanımlayın. İnce yüzey koku alma nöron tabakasını, boyama prosedürü kullanmadan mikroskop altında alttaki submukozadan ayırt edin. Kalem işlevini kullanarak nöronları yoğun sütunlu bir görünüm olarak gözlemleyin.Nöronal tabakanın etrafını takip edin, yüksek kaliteli RNA elde etmek için nöronların lazerden yanmasını önlemek için nöronlardan biraz uzağa doğru izleyin. Ardından lazer güdümlü kesimi başlatın. İnce uçlu mikro diseksiyon forsepsleri kullanarak diseke edilen bölümleri alın ve dokuyu buz üzerinde 100 mikrolitre lizis tamponu içeren bir mikro tüpe aktarın.Diseksiyonun tamamlanmasından sonraki toplam 50 dakika içinde tek bir numuneden elde edilen tüm nöronal kesitler için diseksiyonları tekrarlayın, numune lizatlarını hemen vorteksleyin ve kuru buz üzerinde tutun. Daha sonra toplam RNA izolasyonu için numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Numune lizatlarını buz üzerinde çözdürün.Üreticinin protokolünü hiçbir değişiklik yapmadan takip ederek DNA'lı RN sulu mikro kiti ile bir inaktivasyon ile toplam RNA izolasyonunu gerçekleştirin. Toplam 20 mikrolitre hacimde elute. Biyoanalizörü kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün ve RNA bütünlük numarası ile RNA kalitesini değerlendirin.CDNA sentezi için kalite kontrol kriterlerini karşılayan numuneleri seçin, her reaksiyon tüpü için doğrulanmış bir ticari kit kullanarak CDNA'yı sentezleyin. ANIL 0.1 ila 1.0 nanogram RNA, toplam hacimde sekiz mikrolitre RNA serbest su, bir mikrolitre oligo DT primer ve bir mikrolitre 10 milimolar DNTP karışımı. Numuneleri, santrifüjü ve anili 65 santigrat derecede beş dakika boyunca nazikçe girdaplayın.Reaksiyon tamamlandıktan sonra, numuneleri hemen buzun üzerine yerleştirin. Ana karışım çözeltisini belirtildiği gibi hazırlayın. Daha sonra, her bir numune tüpüne 9.5 mikrolitre ana karışım ve 0.5 mikrolitre ticari olarak hazırlanmış ters transkriptaz, 0.5 mikrolitre RNA serbest suda kontrol tüpüne ekleyin.RT enzimi yerine, ilk inkübasyon ile 50 dakika boyunca 50 santigrat derecede bir RT reaksiyonu çalıştırın. Sonra beş dakika boyunca 85 santigrat derece. Ve son dört santigrat derece tutar.Koku alma işaretleyici protein ekspresyonunun nöronal zenginleşmesini belirlemek için tüm numuneleri beş kat su ve alikot ile seyreltin. PCR plakasının her bir oyuğuna G-A-P-D-H dahili kontrolünü kullanarak PCR ana karışım çözeltilerini hazırlayın. Yedi mikrolitre ana karışım ve üç mikrolitre CDNA ekleyin.Daha sonra plakayı 300 g'da beş dakika santrifüjleyin. Ticari süper karışım için belirtilen varsayılan termal döngü koşullarını kullanarak gerçek zamanlı PCR reaksiyonunu çalıştırın. Katlama zenginleştirme için ifade sonuçlarını analiz edin.İki kat veya daha fazla nöronal zenginleşme gösteren örnekleri seçin. Daha sonra, FAM etiketli bir ilgilenilen prob ve G-A-P-D-H etiketli bir vic kullanarak ilgilenilen genlerin ifadesi için gerçek zamanlı bir PCR tasarlayın. Her kuyucukta sekiz mikrolitre ana karışım içeren bir PCR plakası ayarlayın ve iki mikrolitre CDNA plakayı beş dakika santrifüjleyin.300 g'da. Üretici tarafından sağlanan gen ekspresyonu ana karışım protokolüne göre varsayılan termal döngü koşullarını kullanarak reaksiyonu çalıştırın. Şimdi ifade sonuçlarını analiz edin.Bu deneyde, bipolar bozukluğu olan bu iki hastada lityumun koku alma epitelyumundaki glikojen sentaz kinaz üç betanın ekspresyon seviyeleri üzerindeki etkisini ölçmek için lazer yakalama, mikro diseksiyon ve R-T-P-C-R kullanıldı, bu iki Behçet hastasında lityum tedavisi öncesi ve sonrası ekspresyon analizleri GSK üç beta ekspresyonunda bir azalma olduğunu gösterirken, kontrol denekleri gelişiminden sonra önemli bir değişiklik göstermedi. Bu teknik, nöropsikiyatri alanındaki araştırmacıların hasta nöronal hücrelerindeki moleküler değişiklikleri keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, daha sonra aşağı akış gen ekspresyon analizi için kullanılabilecek zengin bir nöron popülasyonunu izole etmek için lazer yakalama mikrodiseksiyonunuzu nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız.

olfactory-neurons-obtained-through-nasal-biopsy-combined-with-laser

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz burada, sıçan ve insan burun boşlukları olfaktör mukoza biyopsi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu biyopsiler, beyin hastalıkları moleküler anomaliler tespit edilmesi ya da beyin travması / hastalık hayvan modellerinde hücre nakli için kullanılabilir multipotent yetişkin kök hücreleri izole ya için de kullanılabilir.

Kemirgenler ve İnsanlar Burun Koku Kök Hücreler Yalıtımlı

Koku ampul Yetişkin doğumlu nöronlar optogenetically Channelrhodopsin2-implant minyatür rostral göçmen akışı ve kronik photostimulation lentiviral enjeksiyon ifade LED kullanılarak kontrol edilebilir.

Kronik Yetişkin doğmuş Koku Nöronlar Seçici Viral İletimi In vivo Optogenetic Uyarım

Olfaktör reseptör nöronları (ORNs) bir reseptör içine ilk sırayla koku ampul içinde ikinci dereceden nöronlara iletilir aksiyon potansiyelleri tetikleyen güncel koku sinyalleri dönüştürmek. Burada aynı anda odorant bağlı reseptör fare ORNs mevcut ve aksiyon potansiyelleri kaydetmek için emme pipet tekniği tarif.

Emme Pipet Tekniği kullanılarak Olfaktör Reseptör Nöronlar Kaydedilmiş odorant bağlı Cevapları

Biz omurgasız koku yolunun ilk üç aşamada koku-uyarılmış yanıtlar karakterize etmek ekstraselüler çoklu ünite kayıt tekniği varyasyonları göstermektedir. Bu teknikler kolayca başka sinir sistemlerinin topluluk etkinliği incelemek için adapte edilebilir.

Locust Sinir Aktivitesi Karakterize Multi-ünite Kayıt Yöntemleri (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktör Devreler

Korunan Anatomik Örgütü ile bozulmamış Fare Burun Doku hazırlamak için etkili bir Manuel kemik sıyırma Yöntemi

Bu protokol, akut tek naris oklüzyonu kullanan sıçanlarda lateralize erken koku tercihi öğrenimini tanıtır. Yanallaştırılmış öğrenme, aynı hayvanlardaki davranışsal sonuçların incelenmesine ve biyolojik mekanizmaların desteklenmesine izin vererek, hayvanlar arasındaki tasarımların neden olduğu varyansı azaltır. Bu protokol, erken koku öğrenimini destekleyen moleküler mekanizmaları araştırmak için kullanılabilir.

Sinir Devresi Temelini Bellek Oluşumunda Diseksiyon için Yenidoğan Sıçanlarda bir Lateralize Koku Öğrenme Modeli

Koku alma duyusal nöronlarının fizyolojik özelliklerini analiz etmek hala teknik sınırlamalarla karşı karşıyadır. Burada, gen hedefli farelerde koku alma epitelinin sağlam bir preparasyonu içinde delikli yama klempi yoluyla kaydediyoruz. Bu teknik, membran özelliklerinin karakterizasyonuna ve tanımlanmış koku alma reseptörlerini eksprese eden nöronların spesifik ligandlarına verilen yanıtlara izin verir.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Bu protokol, lazer yakalama mikrodisseksi kullanarak yüksek doğruluk ve anatomik özgüllük ile amigdala merkezi çekirdeğinden tek nöron, mikroglia ve astrosit toplamak için nasıl açıklar. Ayrıca, bu hücrelerin transkripsiyonu bir alt kümesini ölçmek için mikroakışkan RT-qPCR kullanımımızı açıklarız.

Tek Hücretranskripsiyonel Profillerini Analiz Etmek Için Lazer Yakalama Mikrodisseksive Mikroakışkan QPCR'nin Birleştirilmesi: Opioid Bağımlılığına Sistem Biyolojisi Yaklaşımı

Bu makale, insan burun solunumuyla senkronize koku sunumu sırasında tek ve çift bobinli transkraniyal manyetik stimülasyonu (TMS) tetiklemek için nefesle senkronize bir olfaktometre kullanmayı açıklamaktadır. Bu kombinasyon, hoş ve hoş olmayan kokuların belirli bir bireyde kortikospinal uyarılabilirliği ve beyin etkili bağlantıyı nasıl etkilediğini objektif olarak araştırmamızı sağlar.

Kokuların Kortikospinal Uyarılabilirlik ve Etkili Bağlantı Üzerindeki Etkisini İncelemek için Nefesle Senkronize Olfaktometreyi Beyin Simülasyonu ile Birleştirmek

Bu makale, tek çekirdekli RNA dizilimi amacıyla murin koku alma epitelinin diseksiyonu ve dissosiyasyonu için kolaylaştırılmış bir protokol sağlar.

Tek çekirdekli süspansiyonlar için fare koku alma epitelinin hızlı diseksiyonu ve ayrışması

Öğrenin, lazer yakalama mikrodisseksiyon ve Real Time RT PCR kullanarak burun biyopsisinden elde edilen koku epitelinde bipolar bozukluk tedavi yanıtlarını moleküler düzeyde analiz etme yöntemini.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon ile Burun Biyopsi Kombine yoluyla elde Koku Nöronlar: Mental Bozuklukların Tedavi Tepki Eğitim Bir Potansiyel Yaklaşım (Video) | JoVE Journal

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon ile Burun Biyopsi Kombine yoluyla elde Koku Nöronlar: Mental Bozuklukların Tedavi Tepki Eğitim Bir Potansiyel Yaklaşım

Daha fazla video keşfet