Name: Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Öğrenin yenidoğan fare beyninde intraventriküler AAV enjeksiyonu ile yaygın nöronal transdüksiyon yöntemini. Bu teknik, beyinde gen fonksiyonlarını in vivo çalışmak için uzun ömürlü transgen ekspresyonu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma, Robert A. ve Rene E. Belfer Aile Vakfı, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Vakfı Alzheimer Hastalığı araştırma hibesi A2010097 (JLJ) ve NIA Yaşlanma Biyolojisi Eğitimi hibesi T32 AG000183 (SDG desteği) tarafından desteklenmiştir.

Tüm prosedürleri ve Bakımı ve Kullanımı Laboratuvar Hayvanları Sağlık Rehberi National Institutes göre hayvanlarla ilgili protokolleri gerçekleştirin. Burada anlatılan prosedürleri gözden ve Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Baylor College tarafından kabul edildi. Kemirgen beyin transgen için replikasyon-yetersiz adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörleri Biyo güvenlik seviyesi 1 kullanım için onaylanmıştır. Uygun koruma ve virüs kullanım prosedürleri ile ilgili özel gereksinimler detayları &quot;Mikrobiyoloji ve Biyomedikal Laboratuvarları (BMBL) Biyogüvenlik&quot; ABD Hükümeti yayın için CDC web sitesine bakın. Virüslerin kullanıldığı işlemleri için kurumsal özel gereksinimleri öğrenmek için yerel veteriner ve çevre güvenliği personeli ile kontrol edin. Prosedür odaları, karantina ve biyolojik tehlike kafesleri belirlenmesi ile ilgili yönetmelikler kurumlar arasında farklılık gösterebilir. 1. ÖnP0 Pups ve Foster Anneler pare <ol><li> Bütün hamile ve emziren dişiler üreme ve laktasyon enerji taleplerini desteklemek için yüksek yağ chow sağlayın. </li><li> Akşamları, bir tek yerleşik erkek kafesine bir veya iki sağlıklı kadın ekleyerek bir yetiştirme kafesi yukarı ayarlayın. Sonraki sabah, bir birleşme fiş kadın kontrol etmek ve bir fiş mevcut ise, erkek ve dişileri ayrı gelen. <ol><li> (Örneğin, C57BL / 6 veya C3HeJ) kötü anne özellikleri olan bir genetik geçmişe ikinci yavrular artırmak için koruyucu anneler kullanın. Transfer yavrular üvey annenin kendi çöp dört gün içinde doğmuş olması gerekir üvey anneler başka bir aileden gelen yavrular kabul. </li><li> Kadın iki kümesi yaklaşık olarak aynı zamanda uygulanması ve böylece deneysel yetiştiriciler yanında ICR veya FVB kadın kullanarak ayrı bir birleşme kafes kadar ayarlayın. </li></ol></li><li> Dişiler plan suşu bağlı olarak, fiş tarihinden itibaren 19 ± 1 gün içinde teslim edecek. Üç gün önce d(16 gün fiş tarihinden sonra) elivery, taze iç içe malzeme ve kapalı barınak ile temiz bir kafese hamile kadın yerleştirin. </li><li> Günde iki kez, beklenen doğum tarihinden 2 gün önce (17 gün fiş tarihinden sonra) başlayan yenidoğan yavrular için kontrol edin. Pembe yenidoğan varlığı için alt atmayı ile annelere minimum stresle kafes inceleyin. Fareler genellikle öğleden sonra teslim edecek Sabah, ancak nadir durumlarda yavrular teslim. </li><li> Yavrular, ya da hangisi önce doğum 6 saat, içinde (görünür süt noktalar belirgin olacaktır) hemşirelik gibi kısa sürede enjeksiyonları gerçekleştirmeyi planlıyoruz. </li></ol> 2. Enjeksiyon için donatım hazırlayın <ol><li> Genel P0 yenidoğanlar için 32 G iğne ile 10 ul enjeksiyon şırınga hazırlayın. Steryotaksik enjeksiyon performans ise, manipülatör kolunun üzerine şırınga monte. </li><li> Enjeksiyonlar için bir stereotaksik çerçeve kullanılıyorsa,% 100 Ethan ekleyerek 4-8 ​​° C&#39;ye kadar soğutulması aşamasını yenidoğanol ve bloğun ön ucunda hazneye kuru buz. Yavruların donmaya önlemek için 1 ° C üstünde bir sıcaklığa koruyun. </li></ol> 3. Enjeksiyon için viral seyreltilerde hazırlayın <ol><li> ,% 1 tripan mavi boya solüsyonu (20x stok) hazırlayın. </li><li> Sınıf 2 biyogüvenlik kabini içinde adeno-ilişkili virüs (AAV) stokunun 5-25 ul alikotları hazırlayın. Gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de bu alikotları yerleştirin. Bu iletim etkinliğini kaybedecek virüs neden olur gibi ek donma-erime döngülerinden kaçınmak. </li><li> Çözülmesi için buz üzerine -80 ° C dondurucu ve yerden AAV bir numuneyi çıkarın. </li><li> Buzla soğutulmuş 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içine virüs seyreltilmesi ile enjeksiyon için viral çözelti hazırlayın. Transdüksiyon modeli ilk optimizasyonu için bir on kat seri seyreltme (10 10 8 10, viral partikül / yarıküre) ile başlar. </li><li> % 0.05 kadar bir son konsantrasyon elde etmek için, AAV çözeltiye 20x tripan mavisi ekleyin. </li></ol><psınıf = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Enjeksiyon için Yenidoğan Pups evreleme <ol><li> Soğutmak için buz üzerinde küçük bir alüminyum levha yerleştirin. Kuru görev soğuk metal yavrunun cildi korumak için levhanın üstüne silin yerleştirin. Bu yavrular anestezi ve enjekte edilmesi için düz bir soğuk bir yüzey olarak görev yapar. </li><li> Sıcak önce ve enjeksiyondan sonra neonatal fareler tutmak için uygun bir ısınma dolgusunu hazırlayın. </li><li> Yenidoğan yavrular hemşire başladı sonra, kafesin bunların yaklaşık yarısının kaldırmak ve anneleri ile diğer yarısını bırakın. Enjeksiyonu beklerken ısınma pad üzerinde toplanan yavrular yerleştirin. NOT: biyolojik anne yavrular için umurumda değil, derhal kafesten tüm çöp kaldırmak ve enjeksiyon beklenmeye bir ısınma pad üzerine yavrular yerleştirin. Bu durum C57BL / 6 kadın veya zayıf üreme özelliklerine sahip diğer kendilenmiş suşları ile doğan ilk yavru ile ortaya çıkabilir. Bu durumda, süt noktalar yenidoğan yavrular görünür olmayacaktır. </li><li>Hipotermi anestezi sağlamak, soğuk metal plakanın üzerine ısınma pad itibaren bir yavru aktarın. Yavru tamamen anestezi olmak için 2-3 dk bekleyin. Çok nazikçe bir pençe sıkarak anestezi onaylayın ve hareket ya da solunum eksikliği izlemek. </li></ol> Yenidoğan Farelerde içine AAV&#39;nin 5. Enjeksiyon <ol><li> Ücretsiz el yenidoğan farelere AAV&#39;nin içi enjeksiyon: <ol><li> Yük enjeksiyon şırınga içine% 0.05 tripan mavisi ile seyreltilmiş AAV&#39;nin 5 ul. </li><li> Yavaşça% 70 etanol batırılmış bir pamuklu çubukla anestezi yavru başını silin. </li><li> Her göze lambda dikişine gelen mesafe 2/5 enjeksiyon siteleri belirlemek. Alternatif bir enjeksiyon sitesi yaklaşık 0,8-1 mm yarım lambda ve bregmadan arasındaki, sagital sütür gelen yanal yer almaktadır. Bu görülecek P0 deri yoluyla görebilir. </li><li> Toksik olmayan bir laboratuar kalem ile enjeksiyon yerinde işaretleyin. </li><li> Monitörler için görünür skala ile şırınga tutunçözeltinin hacmini toring dağıtılır. </li><li> Başparmak pistonun üst ulaşmak emin olun. Virüs dağıtım yanlışlıkla önlemek için iğne konumlandırma ederken Sonra pistonu başparmak çıkarın. </li><li> Buz kovası kol bankta dirsek koyarak ve eğilerek enjeksiyon için kol brace rahat bir pozisyon bulun. </li><li> Doğrudan şırınga altında kafası ile yan yavru yatıyordu. İşaretli enjeksiyon sitesi yukarı bakacak şekilde yavrunun kafasını çevirin ve yavaşça ama sıkıca açık bir elinizle bu konumda tutun. </li><li> Kafatasının yüzeyine dikey enjektörü ve yaklaşık 3 mm&#39;lik bir derinliğe kadar işaretli enjeksiyon yerinde iğneyi. Direnç iğne yanal ventrikül içine nüfuz ettiğini göstermektedir, hafifçe düşer kadar iğne enjekte edilir. Referans ihtiyaç varsa, toksik olmayan makinesi iğnesinin ucu 3 mm işaretleyin. Boya t dayalı yavru boyutu ve suş için enjeksiyon derinliğini ayarlayınventriküllerin argeting. </li><li> Piston beyne uzak iğne hareket olmayan depresif olabilir, böylece katı bir şırınga tutun. Enjeksiyon talamus itildiğinde, ağız yoluyla dağıtımı ciddi sınırlı olacaktır. </li><li> Şırınga dağıtılan seviyesini izlerken yavaş virüs enjekte başlayın. Her ventrikül içine 2 ul maksimum hacmi yönetmek. İğne doğru pozisyonda ise, boya ventrikül doldurmak yayılacak. </li><li> Yavaşça iğneyi çıkartın. </li><li> Ilk enjeksiyon sitesi diğer yarımkürede enjekte önce kapatmak için izin verin. NOT: Bir kez daha aynı site daha enjekte etmeyin. Zaten kaçak enjekte ve yavru yaralanma veya ölüme neden olmuştur iğne güçleri virüs reinserting. </li><li> Aynı prosedür kullanılarak, karşı ventrikül enjekte edilir. </li></ol></li><li> Yenidoğan farelere AAV&#39;nin stereotaksik enjeksiyonu: <ol><li> % 0.05 tripan mavisi int ile seyreltildi, AAV&#39;nin yük 5 ulstereotaksik manipülatör tarafından düzenlenen enjeksiyon şırınga o. </li><li> Yavaşça yenidoğan çerçevenin kulak çubukları arasında yavrunun kafasını yerleştirin. Emin baş lambda ve bregmadan arasındaki çizgi sahneye paralel olduğunu kontrol ederek Y-ekseninde seviyesi (önden arkaya) olduğundan emin olun. Emin kafa kulaklar, ya da gözleri arasında bir çizgi arasında bir hayal çizgi, sahneye paralel olduğunu kontrol ederek X-ekseninde seviyesi (yan yana) olduğundan emin olun. </li><li> Yavaşça% 70 etanol batırılmış bir pamuklu çubukla anestezi yavrunun kafasını silin. </li><li> Lambda Yukarıda şırınga konumlandırmak için stereotaksik manipülatör kullanın ve daha sonra X ve Y koordinatlarını sıfır. = (X, Y) stereotaksik kollarını hareket ettirin (0.8, 1.5) standart P0 yavrular için mm. NOT: Pup boyut ve stereotaksik koordinatlar zorlanma ve yaşa göre değişebilir. Lateral ventriküllerin hedef gerektiği gibi boya enjeksiyonu dayalı koordinatları ayarlayın. </li><li> Yavaş yavaş enjeksiyon yerinde içine iğne düşük. Kafatasının yüzeyi ind doyurmayaİğne cildi nüfuz sonra ent ve sonra serbest bırakın. Kafatası normal içbükey şeklini kurtarır kadar iğne geri çekin, ancak cilt altında iğne eğim tutun. Z bu noktada koordinat sıfır. </li><li> Z = -1.7 mm kadar iğne takın ve daha sonra -1.5 mm çekin. </li><li> Yavaş yavaş virüs enjekte. Her hemisfer çözüm 2 ul kadar kabul edebilir. </li><li> Enjeksiyonu tamamlandıktan sonra, 30-60 saniye yerinde tutmak ve şırınga daha sonra yavaş yavaş 1-2 dakika boyunca iğne geri çekilir. </li><li> Enjeksiyon bölgesinde için X-ekseninde negatif koordinatlarını kullanarak, Kontralateral hemisferde için tekrarlayın. Not: enjeksiyon için alternatif koordinatlar (X, Y, Z, (=), 0.8, 2.0, -1.5) mm (1.2, 1.0, -1.5) mm. (0.8, 2.0) ilk enjeksiyonu işlemi, son olarak da (0.8, 2.0), (1.2, 1.0) ve (1.2, -1.0) hareket ettirin. , Hemisfer başına 2 ml&#39;lik bir toplam her yerinde çözeltinin 1 ul enjekte edilir. Les yordamı tamamlamak için enjeksiyonlar arasında hızla hareket10 dakika daha lar. </li></ol></li></ol> 6. Post-enjeksiyon Bakımı <ol><li> Her iki yarımkürede içine enjeksiyon tamamladıktan sonra, normal vücut ısısı ve cilt rengi dönene kadar ısınma pad üzerinde yavru geri yerleştirin ve yavru hareket etmeye başlar. </li><li> Enjekte yenidoğanlar hemşire biyolojik anne kullanıyorsanız bunlar normal hareketini kurtarmak sonra, biyolojik anneye enjekte yavrular dönmek. Isınma pad üzerinde kalan Uninjected yavrular yerleştirin. Tüm farenin enjekte edilene kadar işlemi tekrarlayın. </li><li> Enjekte yenidoğanlar hemşire için üvey annen kullanıyorsanız bunlar normal hareketini kurtardıktan sonra, bakım için üvey annenin bütün enjekte yavrular aktarın. <ol><li> Enjekte edilen hayvanların başarısını sağlamak için çoğu veya kafesinden Üvey anneden ait yavruların tümünü kaldırmak. </li><li> Foster annenin yavruların ve enjekte yavrular aynı göz ve cilt rengi varsa onlar olabilir böylece, bir laboratuar kalem ile beslemek anneden yavrular işaretlemekDaha sonra ayırt. </li><li> Foster annenin yavrularını ve enjekte yavrular ile birlikte onların yatak bazı yerleştirin. Enjekte yavrular yeni yavruların kabul iyileştirmek için onun biyolojik yavruların kokusunu elde emin olun. </li><li> Geri foster annenin kafesine içine sadece enjekte yavrular yerleştirin. Üvey anneden kalan yavrular itlaf. </li></ol></li><li> Anne katılıyor ve kafesin içine yerleştirerek 10 dakika içinde enjekte yavrular hemşirelik emin olun. Anne, bu süre içinde yavrular toplamak değilse, başka bir bakıcı anneye yavrular transfer. </li><li> Bu viral-enjekte hayvanları içerdiğini göstermek için bir biohazard kartı ile kafesi etiketleyin. Ev 72 saat boyunca onaylı bir bölgede kafes. </li><li> 72 saat karantina döneminden sonra, temiz bir kafes anne ve yavrular (ancak hiçbir yatak veya diğer kafes öğeler) aktarın. Herhangi bir viral-kontamine yatak maruz kalmasını önlemek için bir Düzey 2 biyogüvenlik kabini içinde bu transferi gerçekleştirin. Rnormal fare tesisine enjekte edilmiş hayvanlardan olan temiz bir kafes eturn. </li><li> , Biyolojik olarak tehlikeli torba içine kirli kafes yerleştirin otoklavlanarak sterilize edilir ve daha sonra vivaryum için kafes döner. </li></ol> 7. Temizleme <ol><li> Ileride kullanılmak üzere 4 ° C &#39;de, geri kalan virüs çözümü yerleştirin. 4 ° C&#39;de 8 arasında saklandığında en az bir virüs, 2 ay boyunca transdüksiyon etkinliğinin muhafaza eder. </li><li> Iyonu giderilmiş su içinde tekrar kez durulanır ve ardından% 2 ağartıcı ile bir iğne ve şırınga dezenfekte. </li><li> % 70 etanol ile takip% 2 çamaşır suyu ile çalışma alanı temizleyin. </li><li> Plastik biyolojik tehlike torba içinde pipet uçları, tüpler, maske, ve eldivenler dahil tüm tek öğeleri toplamak. Yerel yasalar ve kurumsal politikalar (yani otoklav veya yakmayın) gerektirdiği atık malzemelerin imha ediniz. </li></ol> 8. Görüntüleme Fare Brain hazırlayın <ol><li> 3- bir karbon dioksit ötenazi odasına enjekte fare yerleştirin4 hafta sonrası enjeksiyon. Uygun ötanazi uygulamaları için kurumsal kurallarına uyun. Bu floresan etiketi gidermek olacak gibi paraformaldehitle hayvanları serpmek etmeyin. </li><li> Kafatası bütün beyinleri çıkarın ve 4 ° C de PBS içinde% 4 paraformaldehid içinde 3-12 saat boyunca düzeltin. </li><li> Donmaya karşı koruma sağlamak için,% 30 sakaroza sabit beyin aktarın. Beyin dibine batar kadar 4 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Ince ufalanmış kuru buz bir kova toplayın. Orta hatta aşağı yarısında beyin kesin. Dondurmak için kuru buz içinde beyin yarıyı sakla. </li><li> Kuru buz ve% 100 etanol eklenerek mikrotom sahne soğutun. </li><li> PBS kullanarak aşağı orta çizgisi ile sahneye beyin Güvenli ve donmasına izin. </li><li> Bir donma-kayar mikrotomu kullanılarak 30-45 mikron kalınlığında beyin aracılığıyla Bölüm. </li><li> Antifriz solüsyonu (250 mi, gliserol, 300 ml etilen glikol, 500 ml 0.1 M fosfat tamponu, pH 7.4) içeren 24 oyuklu plakalar içinde yer bölümleri. Kapak plakaları wigelecekte kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de inci kalay folyo ve saklayın. </li><li> 1-4 kuyulardan bölümleri toplayın ve PBS içinde 3x yıkayın. </li><li> Mikroskop slaytlar ve kapak üzerine Dağı bölümleri. Slaytlar karanlık bir konuma kurumasını bekleyin. </li><li> Yerli YFP veya tdTomato uygun filtreleri kullanarak görüntü slaytlar virüs transdüksiyon desen kontrol etmek. </li></ol>

<ol><li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system%3A+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).</li>
<li>Sun, B., Gan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+gene+expression+in+the+central+nervous+system+with+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Manipulation of gene expression in the central nervous system with lentiviral vectors.</a> Methods Mol Biol. 670, 155-168 (2011).</li>
<li>Puntel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+rat+brain+using+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors.</a> Curr Protoc Neurosci. 4, (2010).</li>
<li>Passini, M. A., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+gene+delivery+and+structure-specific+patterns+of+expression+in+the+brain+after+intraventricular+injections+of+neonatal+mice+with+an+adeno-associated+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector.</a> J Virol. 75, 12382-12392 (2001).</li>
<li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraventricular+brain+injection+of+adeno-associated+virus+type+1+%28AAV1%29+in+neonatal+mice+results+in+complementary+patterns+of+neuronal+transduction+to+AAV2+and+total+long-term+correction+of+storage+lesions+in+the+brains+of+beta-glucuronidase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice.</a> J Virol. 77, 7034-7040 (2003).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+transduction+of+the+neonatal+brain+delivers+controllable+genetic+mosaicism+for+visualising+and+manipulating+neuronal+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo.</a> Eur J Neurosci. 37, 1203-1220 (2013).</li>
<li>Chakrabarty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+serotype+and+timing+of+injection+determines+AAV+transduction+in+the+neonatal+mice+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Croyle, M. A., Cheng, X., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+formulations+that+enhance+physical+stability+of+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Development of formulations that enhance physical stability of viral vectors for gene therapy.</a> Gene therapy. 8, 1281-1290 (2001).</li>
<li>Bauer, H. C., Bauer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction+of+the+blood-brain+barrier%3A+still+an+enigma%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neural induction of the blood-brain barrier: still an enigma.</a> Cellular and molecular neurobiology. 20, 13-28 (2000).</li>
<li>Cearley, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+repertoire+of+AAV+vector+serotypes+mediate+unique+patterns+of+transduction+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Expanded repertoire of AAV vector serotypes mediate unique patterns of transduction in mouse brain.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1710-1718 (2008).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> J Virol. 82, 5887-5911 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Yenidoğan fare beyin yaygın dağıtımı için bir araç olarak kullanılarak AAV nöronal gen ekspresyonunu kontrol etmek için bir çok yönlü bir prosedür tarif edilmiştir. Böyle utero elektroporasyon 1 veya sterotaksik intrakranial enjeksiyon 2,3 olarak nöronal transgenesis diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, yenidoğan viral enjeksiyon nispeten kolay ve basittir. Temel prosedür, sadece bir buz kovası ve bir mikrolitre şırınga ile birkaç dakika içinde yapılabilir. Optimal sağkalım ve transgen ifade bir...

Nöral gen ifadesini değiştirerek geleneksel yöntemler zaman alıcı ve pahalı germlıne manipülasyonlar gerektirir. De novo Alternatif hızlı sonuçlar ve daha az maliyetlidir fakat karmaşık cerrahi müdahale 1-3 gerektiren bir dezavantajına sahip utero elektroporasyon veya steryotaksik Lentiviral enjeksiyon gibi yaklaşımlar. Ayrıca, transgen ifade bu yöntemler ile sınırlı mekansal yelpazesine sahiptir. Burada, neonatal fare beyin adeno-ilişkili virüs (AAV) intraventriküler enjeksiyon ile yaygın nöronal manipülasyon için bir hızlı, kolay ve ekonomik bir yöntem tarif etmektedir. Bu yöntem ilk olarak, AAV, bu olgunlaşmamış ependim bariyerden ile beyin parankiması 4, lateral ventriküllere geçtiği gibi beyin omurilik sıvısı içinde dağılmasına izin onlar küçük bir parçacık boyutuna önerilen 2001, John Wolfe Marco Passini tarafından tanımlanmıştır 5. F içindeki AAV&#39;nin intraventriküler enjeksiyonuirst doğum verimleri bulbuslarında gelen beyin sapı 6,7 için, beynin her bölgesini kapsayan nöral altkümelerin yaygın viral transdüksiyon sonra 24 saat. Viral-teslim transgenler ifade ve enjeksiyon gün içinde aktif ve transdüksiyon sonra bir yıl kadar daha devam edilir. Dolayısıyla, bu çok yönlü manipülasyon erken doğum sonrası beyin gelişiminde gelen yetişkin yaşlanma ve dejenerasyon kadar çalışmaları sağlar. Bu nöronlar 6 transducing de en verimli olduğu için bizim özel deneysel ihtiyaçlarına tekniği adapte olarak, öncelikle AAV8 serotipinden odaklanmıştır. Viral titre genetik manipülasyon deneyler test hücre iç sonuçlardan transduse nöronların yoğunluğunu kontrol etmek için seyreltilmiş edilebileceğini göstermektedir. Buna ek olarak, iki virüs için seçilen serotipler bağlı olarak, bu durum nöron ayrı veya üst üste gelen kümeler doğru bastırılmaktadır salgılanma modellerini üretmek için birlikte enjekte edilebilir olduğunu göstermektedirViral ambalaj. Çalışmalarımız deneysel nörobilim ayarları geniş bir yelpazede kullanım için bu tekniğin çok yönlülük genişler.

<table><tbody><tr><td>ICR soylu fareler</td><td>Harlan</td><td>Hsd:ICR (CD-1)</td><td>Bu suş aynı zamanda CD-1</td></tr><tr><td>FVB olarak da bilinir Akraba</td><td>fareler Jackson Laboratuvarı</td><td>1800</td><td>5-6 haftalık</td></tr><tr><td>Nestlets</td><td>Laboratuvar Kaynağı</td><td>NESTLETS</td><td></td></tr><tr><td>Çoban kulübeleri</td><td>Laboratuvar Kaynağı</td><td>SS-fare</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek yağlı kemirgen yemeği</td><td>Purina Mills</td><td>PicoLab Fare diyeti 20, #5058</td><td>Bu bizim standart damızlık yemimiz</td></tr><tr><td>Yüksek yağlı kemirgen yemi (alternatif)</td><td>Harlan Laboratories</td><td>Teklad Global %19 proteinli kemirgen diyeti #2019S</td><td>Fitoöstrojen düşükse otoklavlanabilir diyet gereklidir</td></tr><tr><td>Enjeksiyon şırıngası</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>10 ml şırınga</td></tr><tr><td>Enjeksiyon iğneleri</td><td>Hamilton</td><td>7803-04, RN 6PK PT4, 0.375 "</td><td>32 G, standart P0 enjeksiyonları için</td></tr><tr><td>Metal plaka kriyoanestezi</td><td>McMaster Carr</td><td>8975K439</td><td>Ham alüminyum levha, 6 "x 12", 0.25" kalınlığında, 3 eşit parçaya kesilmesi ve kenarların yerel makine atölyesi tarafından zımparalanması gerekecektir</td></tr><tr><td>Dijital okumalı küçük hayvan stereotaksik cihaz</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 940</td><td></td></tr><tr><td>İğne destek ayağı ile üniversal şırınga tutucu</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 1772-F1</td><td></td></tr><tr><td>Yenidoğan çerçevesi</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td>Resmi olarak fare ve yenidoğan sıçan adaptörü olarak adlandırılır</td></tr><tr><td>Steril göstergeli biyolojik tehlike imha torbaları</td><td>VWR</td><td>14220-030</td><td>Önemli! &ndash; Enstitünüzü öğrenmek için yerel veterinerlik ve çevre güvenliği personeline danışın' Biyolojik Tehlikeli Atık Bertarafı için S Protokolü</td></tr></tbody></table>

kalıcı ve yaygın nöronal İletim için yenidoğan fare beyin intraserooroventriküler viral enjeksiyon

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Bilimsel gelişmeler hızlanarak ile, yeni yöntemler hızlı ve kolay fare beyninin gen ifadesini işlemek için deneysel nörobilim için gereklidir. Burada ilk yenidoğan fare beyninin içine viral olarak kodlanmış Transgenlerin doğrudan intrakranial teslimat için Passini ve Wolfe tarafından tanıtılan bir tekniği açıklar. En temel formunda, prosedür sadece bir buz kovası ve bir mikrolitre şırınga gerektirir. Bununla birlikte, aynı zamanda, iletişim kuralı tekniğe yeni araştırmacı tutarlılığını arttırmak için sterotaksik çerçeveler ile birlikte kullanılmak üzere adapte edilebilir. Bir yöntem olup, astarlama ependim hala doğumdan sonraki ilk 12-24 saat içinde ise olgunlaşmamış beyin parankimasma içine serebral ventriküller serbestçe hareket adeno-ilişkili virüs (AAV) de yeteneklerine bağlıdır. Beyin boyunca nöronların yaygın iletiminde bu yaş sonuçlara AAV&#39;nin intraventriküler enjeksiyonu. İfade enjeksiyon gün içinde başlar ve lifetim için devamhayvan örn. Viral titresi floresan proteini ko-ekspresyonu kalıt aktarımlı hücrelerin önemli bir etiket sağlar iken, transduse nöronların yoğunluğunu kontrol etmek için ayarlanabilir. Hem off-the-raf, ambalajlı reaktifler ve özel viral hazırlanmasını sağlamak viral çekirdek tesislerin yükselen durumu ile, bu yaklaşım, hızlı, kolay ve çok daha az pahalı fare beyninin gen ifadesini değiştirmek için bir zamanında bir yöntem sunuyor Geleneksel germlıne mühendislik daha.

Başarılı ventrikül içi enjeksiyon, viral verimleri ve yaygın nöronal sağlam ifade. Burada YFP veya tavuk beta aktin promoteri (CBA promotör) kontrolü altında tdTomato floresan genler kullanılarak viral transdüksiyon değerlendirildi. Bu yapılar AAV8 içine paketlenmiş ve neonatal (P0) ICR fındık fareleri lateral ventriküllere enjekte edildi. Yüksek virüs titerleri (hemisfer başına 10 10 parçacıklar) (sol, Şekil 1A) yoğun bir koku ampul etiketleme, striatum, serebral korteks, hipokamp ve beyinci...

Burada, adeno-ilişkili virüsün yenidoğan fare beynine intraventriküler enjeksiyonu ile yaygın nöronal transdüksiyon için bir teknik gösteriyoruz. Bu yöntem, viral olarak verilen transgenlerin yaşam boyu ekspresyonunu elde etmek için hızlı ve kolay bir yol sağlar.

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Bu prosedürün genel amacı, beyindeki nöronları viral olarak dönüştürmektir. Bu, yenidoğan yavruların kriyo anestezitizasyonu ve ardından yenidoğanın enjeksiyon için soğutulmuş aşamaya aktarılması ile gerçekleştirilir. Daha sonra, Lambda sütürü ile her bir göz arasındaki lateral ventrikülleri veya Lambda ile Bgma arasındaki sagital sütürden lateral ventrikülleri hedeflemek için enjeksiyon bölgesini belirleyin.Son adım, iğneyi doğru derinliğe sokmak ve her yarım kürenin lateral ventrikülüne iki mikrolitreye kadar virüs solüsyonunu yavaşça infüze etmektir. Sonuç olarak, intraventriküler enjeksiyondan kaynaklanan transgen ekspresyon modelini göstermek için ilgilenilen gen için bir floresan etiketi veya immünofloresan kullanılır. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler, lateral ventrikülleri doğru bir şekilde hedeflemekle mücadele edeceklerdir.Bu teknik, hem serbest el intrakraniyal enjeksiyon hem de stereotaktik enjeksiyon yoluyla gösterilmiştir, bu da serbest el tekniğinin laboratuvarımda başka bir doktora sonrası için geçerli olacağını göstermektedir. Başlamak için, genel doğum sonrası sıfırıncı gün yenidoğanlar için 32 gauge iğneli 10 mikrolitrelik bir enjeksiyon şırıngası hazırl

intracerebroventricular-viral-injection-neonatal-mouse-brain-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Somatik kök hücre genişleme kontrolü kendi çalışma ve tedavide kullanımı engelleyen önemli bir faktördür. Burada geçici olarak fare beyin üretilen nöron sayısını artırmak için kullanılabilir geliştirme ve yetişkinlik döneminde nöral kök hücrelerinin genişlemesi, kontrol etmek için bir sistemi tanımlamak.

Tarafından Embriyonik ve Erişkin Nöral Kök Hücre Genişletme<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporasyon veya Viral Stereotaksik Enjeksiyon

Bu videoda, yenidoğan farelerin ventriküllerine enjekte edilen transpozon DNA'yı kullanarak glioblastomları (GBM) indüklemek için etkili bir teknik açıklanmaktadır. Plazmidi alan subventriküler bölgenin hücreleri, insan GBM'sinin histopatolojik özelliklerine sahip tümörleri dönüştürür, çoğalır ve oluşturur.

SB Aracılı Transpozisyon Kullanılarak Glioblastoma İndüksiyonu: SB Plazmidinin Yenidoğan Fare Beynine Transpozon Aracılı Entegrasyonu Kullanılarak Yeni Fare Modeli Oluşturmak İçin Bir Teknik

Bu video, yenidoğan fare beyninde murin sitomegalovirüs (MCMV) dağılımını incelemek için intraserebroventriküler enjeksiyon sürecini göstermektedir. Görünürlük için gelişmiş bir yeşil floresan proteini (EGFP) ifade etmek üzere tasarlanan MCMV, bir fare yavrusunun beyninin yan ventrikülüne enjekte edilir. Enjekte edilen virüs, beyin omurilik sıvısında dolaşır ve marjinal bölge, koroid pleksus ve subventriküler bölge dahil olmak üzere periventriküler bölgedeki hücreleri enfekte eder.

Yenidoğan Fare Beyninde Murin Sitomegalovirüs Dağılımını Analiz Etmek için İntraserebroventriküler Enjeksiyon

Kaynak: Pereira, M. et. al., Viral Vektörlerin İntraserebral Enjeksiyonu ile Yerleşik Glial Hücrelerin İnternöronlara İn Vivo Doğrudan Yeniden Programlanması. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, Cre'ye bağımlı nöronal yeniden programlama ve floresan raportör genleri glial hücrelere iletmek için transgenik bir farenin serebral korteksine adeno-ilişkili bir virüsün stereotaksik enjeksiyonunu göstermektedir.

Bir fare modelinde glial hücre yeniden programlaması için viral vektörlerin stereotaksik enjeksiyonu

Yenidoğanların İnsan Sitomegalovirüs (HCMV) enfeksiyonu zeka geriliği önemli bir nedeni temsil, henüz virüs kaynaklı patogenezinde yol açan moleküler olayların hala tam olarak anlaşılamamıştır. Beyin enfeksiyon dinamiğini incelemek için, bütün hayvan...

Kullanımı<em&gt; In vivo</em&gt; Görüntüleme Yenidoğanlar Deneysel Fare Sitomegalovirüs Enfeksiyon ilerleme Monitör

Pediatrik hastalığın hayvan modelleri erken başlangıçlı ve agresif hastalığın ilerlemesini yaşayabilirsiniz. Klinik genç fare modelleri ile ilgili tedavi teslimat teknik olarak zor olabilir. Bu protokol, yaşamın ilk iki doğum sonrası gün içinde yeni doğmuş fareler için invazif olmayan bir damar içi enjeksiyon yöntemi tarif etmektedir.

Yenidoğan Farelerde intravenöz enjeksiyonlar

Burada, viral partiküllerin veya floresan mikroboncukların yenidoğan fare beynine intraserebroventriküler ve intravasküler enjeksiyonu için basit bir yöntemi açıklıyoruz. Virüs ve nanopartiküllerin lokalizasyon paterni, mikroskobik değerlendirme veya in situ hibridizasyon ile tespit edilebilir.

Yenidoğan Beyin içine Viral Parçacıklar ve Floresan mikro boncuklar intraserebroventriküler ve İntravasküler Enjeksiyon

Biz yenidoğan fare beyni striatum microinjecting reaktifler için ev yapımı bir baş-sabit aygıt ile bir protokol stereotaksik cerrahi açıklamak. Bu teknik, yenidoğan fare beyni, özel bölgelerin nöronal hücrelerin genetik manipülasyon sağlar.

Yenidoğan fare beyin Striatal hücrelerdeki genetik manipülasyon için stereotaksik cerrahi

Bu protokol, doğum sonrası yaşlarda yenidoğan sıçanlarda hücrelerin alt popülasyonlarına somatomotor kortekse anterograd kemogenetik modifiye edici ve servikal omuriliğe retrograd taşınabilir bir Cre rekombinaz enjekte ederek gen terapileri uygulamak için yeni bir yöntem göstermektedir.

Yenidoğan Sıçanlarında Kortikospinal Sistemin Kombine Beyin ve Omurga Cerrahisi Kullanılarak Çift Viral Vektörle Hedeflenmesi

Mevcut protokol, gen düzenleme ve ilaç dağıtımı için yenidoğan farelerde intratekal enjeksiyonların gerçekleştirilmesi için adım adım talimatları özetlemektedir.

Genom Düzenleme ve İlaç Dağıtımı için Yenidoğan Farenin İntratekal Enjeksiyonu

Subaraknoid virüs infüzyonu kullanan adeno ilişkili virüsün yaygın olarak verilmesi için yeni bir teknik tanımlanmıştır. Bu yöntem sadece fare neokortikal nöronlarının yüzeysel katmanlarda yaygın olarak transdüksiyonunu sağlamakla kalmaz, aynı zamanda seçici olmayan bir promotör kullanıldığında bile beşinci katman piramidal nöronlarında transgenin seçici ekspresyonu ile sonuçlanır.

AAV2'nin Subaraknoid Enjeksiyonu ile Fare Neokortikal Nöronlarının Yaygın Transdüksiyonu

Öğrenin yenidoğan fare beyninde intraventriküler AAV enjeksiyonu ile yaygın nöronal transdüksiyon yöntemini. Bu teknik, beyinde gen fonksiyonlarını in vivo çalışmak için uzun ömürlü transgen ekspresyonu sağlar.

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

Daha fazla video keşfet