Name: Kullanımı Ex vivo Chandler Döngü Aparatı Modifiye Polimer Kan Kondüit biyouyumuna De¤erlendirilir (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-20T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Keşfedin, Chandler Döngü modeliyle rekombinant CD47 modifiyeli polimerlerin biyouyumunu değerlendirin. Bu yöntem, yabancı cisim reaksiyonunu azaltarak implant edilebilir tıbbi cihazların reddini önlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

RecCD47 ile 1. değiştirme Polimer Yüzeyler NOT:. Protokol, Şekil 1 &#39;de şematik olarak özetlenmiştir Şekil 1A, tiol-reaktif polimer yüzeylerinin oluşumunu göstermektedir Şekil 1B, tiol-reaktif recCD47 yaratılışını gösterir.. <ol><li> 1. Gün <ol><li> , Steril su içinde bir PDT-BzPh çözeltisi (1 mg / ml) ve potasyum bikarbonat (KHCO 3) (0.7 mg / ml) hazırlayın. 4 ° C (ışıktan koruma) gece boyunca karıştırın. </li></ol></li><li> Gün 2 <ol><li> (Dönen tekerlekler etrafında sığacak kadar uzun) 40 cm uzunluğunda parçalar halinde polimerik borunun kesin. </li><li> Bir çalkalama ya da Chandler döngü aygıtı üzerinde oda sıcaklığında 90 dakika boyunca hexacylpyridinium bir% 0.1 sulu çözelti içinde tüpler bekletin. 90 dakika bekletin sonra steril su 3x tüpleri durulayın. </li><li> (% 15 sulu potasyum fosfat monobazik eklenerek Gün 1 PDT BzPh çözeltisinin asitleştirilmesi KH 2 </sub&gt; PO 4). Bulanık bir misel çözeltisinin oluşturulması, PDT BzPh ml&#39;si başına 50 ul KH 2 PO 4 ekleyin. </li><li> Bir çalkalama veya aparat üzerinde oda sıcaklığında 40 dakika boyunca asidifiye PDT BzPh çözelti içinde tüpler bekletin. </li><li> Bir defa, seyrek asetik asit (1.000 1) ile boru durulayın. </li><li> 60 dakikalık bir toplam süresi boyunca UV-ışını tüpleri için Açığa. Tüm yüzey alanını aydınlatmak için her 15 dakikada ¼ tüpler döndürmek. </li><li> Bir çalkalama veya aparat üzerinde oda sıcaklığında 20 dakika boyunca, 20 mg / ml potasyum bikarbonat çözeltisine (KHCO 3) tüpler bekletin. </li><li> , Steril su içinde, 4 ° C&#39;de steril su ve 3 x deposuyla tüpleri durulayın. </li></ol></li><li> Gün 3 <ol><li> (: Çeker ocak içinde gerçekleştirme Dikkat) 200 ul dimetilformamid (DMF) içerisinde 5 mg Sülfo-SMCC çözülür. </li><li> RecCD47 poli-lizin çözeltisi 0.1 mg / ml aşama 1 &#39;de hazırlanmış olan Sülfo-SMCC çözeltisi 50 ul, ve RO&#39; de 60 dakika karışmasınaom sıcaklığı. </li><li> 60 dakika süreyle karıştırılmaya sırasında gazını Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ve bir kenara, steril. </li><li> Saflaştınlır Sülfo-SMCC, üretici talimatlarına göre bir 7K molekül ağırlıklı bir kesim sıkma tuz giderme kolonu kullanılarak recCD47 tepki gösterdi. Nihai akış yoluyla (yüksek kaliteli tiol-reaktif recCD47) toplayın ve kat DPBS ile borunun iç için gerekli hacme kadar seyreltin. </li><li> Steril ile 2 gün tüpleri durulayın, DPBS 3x gazı alındı. </li><li> En az 2 dakika süreyle gazdan arındırılmış DPBS içinde 20 mg / ml &#39;si ile tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorür (TCEP) bir çözeltisi ile, tüplerin olarak değiştirilmiş bir yüzeyi React. Steril gazı alınmış DPBS 4x&#39;te tüpleri durulayın. </li><li> Tüplerine Sülfo-SMCC-reaksiyona recCD47 ekleyin ve bir çalkalama cihazında ya da 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. </li></ol></li></ol> Modifiye Yüzeyler üzerinde recCD47 2. İmmünotest Kantitasyonu <ol><li> Modifiye tüpleri durulayın Gün 3 zekâ gelen sayısal edilecekh DPBS 3x. Mağaza tüpler 4 ° C&#39;de DPBS ölçümü için kullanılmaz. </li><li> 96 çukurlu bir levhanın gözleri içine biyopsi zımbaları çift boru örnekleri yapmak ve yerleştirmek için 4 mm biyopsi zımbası kullanın. </li><li> Tespit antikoru ile tedavi edilmeyen modifiye edilmemiş bir boru numunesinin oluşan bir negatif kontrol hazırlayın. Tespit antikoru ile tedavi edilmiş bir modifiye edilmemiş boru numunesi aşağıdakilerden oluşan bir antikor kontrolü hazırlayın. Tespit antikoru ile muamele edilmiş tadil edilmiş boru test numunelerini hazırlayın. </li><li> Bir karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında 60 dakika boyunca DPBS içinde% 0.4 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ile blok örnekleri. </li><li> Engelleme aspirat BSA ve tris-tamponlu tuzlu su ve% 1 Tween-20 (TBST) 3x, bir çalkalayıcı üzerinde 10 dakika her biri ile yıkayın. </li><li> Bağışıklık için üreticinin tavsiye edilen seyreltme göre% 0.4 BSA içinde antikorun bir seyreltme çalışma hazırlayın. İnsan CD47 Antikor B6H12-FITC 1 seyreltilir: 100% 0.4 BSA içinde. </li><li> Uygun oyuklara antikor seyreltme 200 ul ilave edin. Tekni% 0.4 BSA, sadece Te negatif kontrol eder. Bir çalkalayıcı üzerinde 60 dakika boyunca (ışıktan koruma) için oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> TBST&#39;dir 3x, 10 dakika bir çalkalayıcı her ile durulayın. Son TBST&#39;dir durulama aspire ve tüp numune kuyulara 200 ul DPBS ekleyin. </li><li> Nihai akış yoluyla yüksek kalitede tiol-reaktif rekombinant CD47 bir toplayın ve kat DPBS ile tüplerin iç için gerekli hacme kadar seyreltin. </li><li> FITC uyarma (485 nm) ve emisyon (538 nm) ayarları ile bir mikrotablaya okuyucu kullanarak FITC sinyal yoğunluğu okuyun. </li><li> Hesaplayın recCD47 otomatik floresans ve non-spesifik antikor, kontrol örneğinden bağlayıcı oluşturacak şekilde standart değerlere dayalı polimer yüzeyine bağlanır. </li></ol> 3. Chandler Döngü Aparatı Protokolü Kan toplama protokolü Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) onayı ve bilgilendirilmiş onam evrak önce insan kan numunelerinin toplanması başlamadan isteyin. Bilgi edininonaylanmamis bir insan kanı donörden onayı. Not: aparatı gösteren bir diyagramı Şekil 2 de gösterilmiştir. <ol><li> Yaklaşık olarak 1/2 tekerleklerinin çapı kadar damıtılmış su ile doldurun su banyosu içine monte edilmiştir. % 10 ağartıcı çözelti yapmak için su banyosu için yeterli çamaşır suyu ilave edin. Ayarlama, su 37 ° C banyo ısısı ve dengelenmeye gelmeye bırakın. </li><li> Metal (Şekil 1 B &#39;de gösterildiği gibi) bağdaştırıcılar, modifiye edilmemiş ve modifiye edilmiş boru boru toplayın, ve Şekil 1C&#39; de gösterildiği gibi, cihaz tekerlekleri etrafında bir araya getirin. Bu boru yerine metal adaptör ile tekerleğin etrafında kuytu uyduğundan emin olun. </li><li> Sitrat ya da diğer antikoagülan, 2 ml ile doldurulmuş bir şişe içinde, bir IRB onaylı protokol kullanılarak 30 ml&#39;lik bir kan örneği elde edilir, ve numune, bir kez tıkama bilmek çevirerek karıştırın. </li><li> Tüp içinde bir hava bırakarak metal valfi ve bir şırınga kullanarak her bir tüp için kan yaklaşık 10 ml ilave edilir. Valf kapağını ve r Secure3 saat boyunca otate. </li><li> % 10 çamaşır suyu çözeltisi ile muamele edilmiş bir atık behere kan akıtmak (ya da kurumsal politika tarafından gerekli). </li><li> Yavaşça bütün kan izlerini kaldırmak için DPBS boru içini durulayın. Akış yoluyla atık beher toplayın. Kurumsal politikası uyarınca kan imha edin. </li><li> Aparatı ve yüzeyleri% 10 çamaşır suyu çözeltisi kullanılarak ya da kurumsal politikaya göre temas herhangi bir kan dezenfekte edin. </li><li> Fluoresan mikroskobu ya da tarama elektron mikroskobu için işlem örnekleri aşağıda tarif edildiği gibi. </li></ol> 4. Floresan Mikroskopi ve Hücre Sayım <ol><li> % 4 paraformaldehid (PFA) solüsyonu (Dikkat: davlumbaz gerçekleştirin) hazırlayın. </li><li> 4 ° C de bir gece% 4 PFA çözeltisi içinde boru inkübe edin. </li><li> Gece boyunca inkübasyondan sonra,% 4 PFA çıkarın ve DPBS filmler çok yavaşça çalkalayın. </li><li> Boyama için lümen yüzey ortaya bölüme hortumu kesilir. </li><li> LekeOda sıcaklığında 30 dakika boyunca 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile ortam monte edilmesi için bir kaç damla ise, borunun bir bölümü (ışıktan koruma). Boyama sonra, arka plan DAPI sinyali azaltmak için DPBS ile çok yavaşça tüp durulayın. </li><li> DAPI filtre ve dijital kamera ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanılarak görüntü 200X büyütmede görüntüsü altında 9 körü körüne seçilen alanlarda hücrelerin sayısını saymak için. </li><li> Tutanak hücre görüş alanı başına sayar ve sonuçların istatistiksel önemini belirlemek için uygun istatistiksel analizler gerçekleştirmek. </li></ol> 5. Taramalı Elektron Mikroskobu <ol><li> % 2 glutaraldehit çözeltisi (Dikkat: davlumbaz gerçekleştirin) hazırlayın. </li><li> Gece boyunca 4 ° C&#39;de% 2 glutaraldehid solüsyonunda boru inkübe edin. </li><li> Gece boyunca inkübasyondan sonra, yavaşça DPBS ile boru 3 kez yıkayın. </li><li> Ozmiyum tetroksit bir% 1 çözeltisi hazırlayın (Dikkat: Şiddetli inhalasyon tehlike! ) Davlumbaz kullanın. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca ozmiyum tetroksit bir% 1 çözeltisi içinde boru inkübe edin. </li><li> Yavaşça DPBS boru 3x durulayın. </li><li> Etanol konsantrasyonları bir dizi (% 25,% 50,% 75,% 95 ve% 100 etanol) hazırlayın. </li><li> Etanol konsantrasyonu dizi içinde inkübe edilerek, boru kurutmak. % 25,% 50,% 75, ve 20 dakika her biri için% 95 etanol içinde inkübe edin. 30 dakika boyunca% 100 etanol içinde inkübe edin. </li><li> Süper kritik nokta nemi çıkarmak için 45 dakika boyunca CO2 ile boru kurutun. </li><li> Gümüş macun veya grafit ile bir örnek saplama Mount tüp bölümleri. </li><li> Altın paladyum 12.5 nm ile kaplayın tüp bölümleri. </li><li> Bir taramalı elektron mikroskobunda inceleyin. </li></ol>

<ol><li>Bruck, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+applications+of+polymeric+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Prog.+Technol%22%5BJournal%5D)">Medical applications of polymeric materials.</a> Med. Prog. Technol. 9 (1), 1-16 (1982).</li>
<li>Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign+body+reaction+to+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Foreign body reaction to biomaterials.</a> Semin. Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).</li>
<li>Levy, J. H., Tanaka, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+response+to+cardiopulmonary+bypass%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Inflammatory response to cardiopulmonary bypass.</a> Ann. Thorac. Surg. 75, S715-S720 (2003).</li>
<li>Sperling, C., Maitz, M. F., Talkenberger, S., Gouzy, M. F., Groth, T., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+blood+reactivity+to+hydroxylated+and+non-hydroxylated+polymer+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vitro blood reactivity to hydroxylated and non-hydroxylated polymer surfaces.</a> Biomaterials. 28, 3617-3625 (2007).</li>
<li>Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+hemocompatibility+of+self-assembled+monolayers+displaying+various+functional+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups.</a> Biomaterials. 26, 6547-6457 (2005).</li>
<li>Vasita, R., Shanmugam, I. K., Katt, D. S. Improved biomaterials for tissue engineering applications: surface modification of polymers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVasita%2C+R+%22Curr.+Top.+Med.+Chem%22">Curr. Top. Med. Chem</a>. 8, 341-353 (2008).</li>
<li>Subramanian, S., Parthasarathy, R., Sen, S., Boder, E. T., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-+and+cell+type-specific+interactions+between+CD47+and+human+SIRPalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Species- and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPalpha.</a> Blood. 107 (6), 2548-2556 (2006).</li>
<li>Tsai, R. K., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+%27self%27+engulfment+through+deactivation+of+myosin-II+at+the+phagocytic+synapse+between+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of 'self' engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells.</a> J Cell Biol. 180 (5), 989-1003 (2008).</li>
<li>Berg, T. K., vander Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+%27self%27+recognition%3A+a+role+for+CD47-SIRPalpha+interactions+in+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation.</a> Trends Immunol. 29 (5), 203-206 (2008).</li>
<li>Oldenborg, P. A., Zheleznyak, A., Fang, Y. F., Lagenaur, C. F., Gresham, H. D., Lindberg, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CD47+as+a+marker+of+self+on+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of CD47 as a marker of self on red blood cells.</a> Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).</li>
<li>Stachelek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+CD47+modified+polymer+surfaces+on+inflammatory+cell+attachment+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation.</a> Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2001).</li>
<li>Finley, M. J., Rauva, L., Alferiev, I. S., Weisel, J. W., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+adhesion+and+activation+of+platelets+and+neutrophils+with+CD47+functionalized+blood+contacting+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces.</a> Biomaterials. 33, 5803-5811 (2012).</li>
<li>Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+signaling+mechanisms+associated+with+CD47+modified+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces.</a> Biomaterials. 34, 8640-8649 (2013).</li>
<li>Ravetch, J. V., Lanier, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+inhibitory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Immune inhibitory receptors.</a> Science. 290, 84-89 (2000).</li>
<li>Chandler, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+thrombotic+coagulation+of+blood%3A+a+method+for+producing+a+thrombus%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">In vitro thrombotic coagulation of blood: a method for producing a thrombus.</a> Lab Invest. 7, 110-114 (1958).</li>
<li>Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bubble-induced+aggregation+of+platelets%3A+effects+of+gas+species%2C+proteins%2C+and+decompression%5BTitle%5D)+AND+%22Undersea+Hyperb+Med%22%5BJournal%5D)">Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression.</a> Undersea Hyperb Med. 20 (2), 101-119 (1993).</li>
<li>Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+and+diagnostic+value+of+leukocyte+and+platlet+accumulations+around+%E2%80%9Cair+bubbles%E2%80%9D+in+blood+after+venous+air+embolism%5BTitle%5D)+AND+%22Intl+J+of+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">Genesis and diagnostic value of leukocyte and platlet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism.</a> Intl J of Legal Med. 111 (1), 22-26 (1998).</li>
<li>Miller, R., Fainerman, V. B., Wüstneck, R., Krägel, J., Trukhin, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+initial+period+of+protein+adsorption+by+dynamic+surface+tension+measurements+using+different+drop+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques.</a> Colloids and Surfaces A. 131 (1-3), 225-230 (1998).</li>
<li>Oeveren, W. V., Tielliu, I. F., de Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+modified+chandler%2C+roller+pump%2C+and+ball+valve+circulation+models+for+in+vitro+testing+in+high+blood+flow+conditions%3A+application+in+thrombogenicity+testing+of+different+materials+for+vascular+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biomater%22%5BJournal%5D)">Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications.</a> Int J Biomater. 2012, (2012).</li>
</ol>

Bu yayında rapor Araştırma National, ödül sayısı T32 HL007915 (JBS ve RJL) kapsamında, ödül sayısı R21 EB015612 (SJS) ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü bünyesinde Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik, Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen Sağlığı Enstitüsü.

(Şekil 1 &#39;de özetlenen veriler) foto-aktifleştirme kimyası PDT-BzPh eki ve daha sonra UV ışınlaması kolaylaştırmak için yeterli hidrokarbonlara hemen hemen herhangi bir polimer yüzeyinin değişimine olanak sağlar PDT BzPh fotoğrafı dışı bırakacaktır. Reaktif tiyol grupları ile polimerik yüzey fonksiyonalize ilgi test edilebilir bir molekül, bir dizi daha sonra eklenmesine izin verir. Bizim özel çalışmalarda biz rekombinant CD47 11-13 seçti. Bu iki fonksiyonlu çapraz bağlayıcı SMCC ile <sup...

Örneğin kardiyopulmoner baypas ve böbrek diyalizi gibi pek çok klinik uygulamalar ise, polimerik kan kanalların kullanılmasını gerektirir ve genellikle işlem sonrası komplikasyonlara 1 ile ilişkilidir. Kan ile perfüze edilmiş olduğunda, bu polimerler, kan proteinleri ve trombositler, monosit / makrofaj yapışma emdirme ile sonuçlanır, yabancı cisim reaksiyonu (FBR) kural dışı, ve işlem sonrası komplikasyonlara ve katkı yapan tüm bu pro-enflamatuar sitokinlerin salınması / veya aygıt hatası 2,3. Böylece, bu sorunu çözmek için stratejiler biomateryaller önemli bir araştırma ve devam eden alan kalır. Müfettişler biyoaktif veya biyoinert molekülleri 4-6 kan temas yüzeyleri değiştirerek bu sorunu çözmek için çalıştılar. Laboratuvarımızda Araştırma FbR hafifletmek ve bu malzemelerin etkinliğini artırmak için bir strateji olarak polimerik biyomalzeme rekombinant CD47 (recCD47) ekleyerek odaklanmıştır. CD47 bir yerde ifade transmembr olduğuhücreleri 7-10 ve gösterileri ifade üzerine bağışıklık kaçırma bilinen bir rol kazandıran &quot;öz&quot; durumu ile ane protein polimerik yüzeyler 11-13 eklendiği takdirde biyouyumluluk veren de söz veriyorum. Sinyal-düzenleyici proteini alfa (SIRPα), CD47 için ortak kökenli alıcı, ve zar-ötesi proteinlerin ailesi-ihtiva-eden immüno reseptör tirosin bazlı inhibisyon motifi (İTİM) üyesi, miyeloid kökenli 14 hücreleri üzerinde ifade edilir. Daha önce CD47, SIRPα aracılı hücre sinyal iletimi yoluyla, in vitro, ex vivo olarak, poliüretan (PU) ve polivinil klorür (PVC) için bağışıklık tepkilerini aşağı regüle eder ve in vivo modellerde 11-13 olduğunu göstermiştir. Yapılan incelemelerde Orta kimyasal olarak reaktif tiyol gruplar kovalent olarak bir çok fonksiyonlu bir polimer (PDT Bz ile reaksiyona sokulması suretiyle borunun polimerik boru eklenmiş olduğu, burada tarif edilen bir nispeten yeni bir foto-aktifleştirme kimyası, bir2-piridilditiyo (PDT) oluşan) Ph, fotoreaktif benzofenon (BzPh) ve bir karboksi-değiştirilmiş polialilamin 11-13. Tris kovalent ekteki PDT gruplarının indirgenmesi (2-karboksietil) fosfin hidroklorür (TCEP); 11 sonradan olarak bir yüzey tiollenmiş terapotık kısımlar ile reaksiyona verir. Bu tarifnamede daha önce ayrıntılı 12,13, ayrıca bir C-terminali poli-lisin 12,13 kuyruk ilavesiyle modifiye recCD47, Sülfosukinimidil-4-[N -maleimidomethyl] sikloheksan-1-karboksilat ile reaksiyona sokulur (sülfo-SMCC) 1 saat boyunca ve boru 11 arasında bir recCD47 monosulfide bağ oluşumuna müsaade eden, tiol-reaktif gruplar oluşturmak için. CD47 fonksiyonalize yüzeylerinin anti-enflamatuar kapasitesi orjinal trombotik pıhtılaşma 15 bir in vitro modeli olarak, 1958 de tarif edilmiştir bütün insan kanı ile Chandler döngü aygıtı kullanılarak ex viv o test edilmiştir. Aparat bir dayanırkapalı bir boru sisteminin kısmen hava ve boru 15 yoluyla kan dolaşımı için bir döner motor ile doldurulur. Bu deneysel modelde, modifiye edilmiş ve modifiye edilmemiş yüzeyleri üzerine kan maruz kalma etkisi ve aynı zamanda kan hücrelerinin fizyolojisi üzerine, bu yüzey modifikasyon etkisini incelemek için bir fırsat sağlar. recCD47 Bu aktifleştirme kimyası kullanılarak polimer çeşitli yüzeyler eklenmiş olabilir, ve anti-enflamatuar kapasitesi polimer yüzeyleri 11,12 üzerinden kan perfüzyonunun taklit eden klinik olarak anlamlı bir eks vivo modeli kullanılarak değerlendirilebilir. Aparat insan kanı maruz kaldığında, değiştirilmemiş polimerlere kıyasla recCD47 modifiye klinik sınıf kan kanalları önemli ölçüde daha az trombosit ve inflamatuar hücre eki göstermektedir. Bu modifikasyon işleminin bir adım-adım bir açıklaması aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

<table><tbody><tr><td>%16 Paraformaldehit (PFA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>58906</td><td>Dikkat! Çeker ocakta kullanım</td></tr><tr><td>%25 Glutaraldehit</td><td>VWR</td><td>AAA17876-AP&nbsp;</td><td>Dikkat! Çeker ocakta kullanım</td></tr><tr><td>2-piriditiyo, benzofenon (PDT-BzPH)</td> <td>Laboratuvarda sentezlendi</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A3059-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sitrat</td><td>Sigma</td><td>S5770-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Dijital Kamera</td><td>Leica</td><td>DC500</td><td>Üretim dışı</td></tr><tr><td>Dimetilformamid (DMF)</td> <td>Sigma</td><td>270547-100ML</td><td>Dikkat! Çeker ocakta kullanım</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (DPBS)</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>TE300</td><td></td></tr><tr><td>Buzul Asetik Asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td>Dikkat! Çeker ocakta kullanım</td></tr><tr><td>İnsan CD47 (B6H12) &ndash; FITC Antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-12730</td><td></td></tr><tr><td>Osmiyum Tetroksit</td><td>Acros Organics</td><td>197450050</td><td>Dikkat! Çeker ocakta kullanım</td></tr><tr><td>Potasyum Bikarbonat (KHCO3)</td><td>Sigma</td><td>237205-100G</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat Monobazik (KH2PO4)</td><td>Sigma</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>PVC Boru (Kardiyovasküler Prosedür Kiti)</td><td>Terumo Kardiyovasküler Sistemler</td><td>60050</td><td>Çoğu klinik sınıf tüp işe yarayacaktır</td></tr><tr><td>Tarama elektronu Mikroskop</td><td>JEOL</td><td>JSM-T330A</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür (NaCl)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka Okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Spectramax Gemini EM ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>Sigma</td><td>M6035-10MG</td><td>Neme Duyarlı!</td></tr><tr><td>tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP-HCl)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Fisher Scientific</td><td>H-1200</td><td>ile Vectashield</td><td>Işığa duyarlı!</td></tr><tr><td>Zeba Spin Tuz Giderme Sütunları &ndash; 7 K MWCO</td><td>Thermo Scientific</td><td>89891</td><td></td></tr></tbody></table>

kullanımı ex vivo chandler döngü aparatı modifiye polimer kan kondüit biyouyumuna de¤erlendirilir

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Sentetik yüzey gövdesine içeri getirildiği zaman, yabancı cisim reaksiyon meydana gelir. Bu işlem sonrası komplikasyonlara yol açan, kan proteinleri adsorpsiyon ve trombositlerin arkaya takılmasının ve aktivasyonu, monosit / makrofaj yapışma, ve inflamatuar hücre sinyal olayları ile karakterize edilir. Chandler Döngü Aparatı araştırmacılar kan geniş hacimli polimerik kanallar üzerinde perfüze zaman meydana gelen moleküler ve hücresel etkileşimleri çalışmak için izin veren deneysel bir sistemdir. Bu amaçla, bu cihaz, çeşitli polimer yüzey modifikasyonları, anti-enflamatuar özellikleri tahmin edilmesine izin veren bir ex vivo bir modeli olarak kullanılmıştır. Laboratuvarımız kovalent rekombinant CD47 ile aktifleştirme kimyası ile modifiye kan kanallar, polimerik yüzeylere biyouyumluluk kazandıran göstermiştir. Polimerik yüzeylere CD47 ekleme polimerik kan kanalların etkinliğini teşvik etmek etkili bir araç olabilir. HerEin CD47 değiştirilebilir ve kontrol kanallarına kan etkileşimleri incelemek için klinik olarak anlamlı bir polimer, kan ve boru, bir ex vivo deney modeli olarak Chandler özenin kullanımının, rekombinant CD47 eklemek için kullanılan foto-aktifleştirme kimyası ayrıntılı bir yöntemdir.

SMCC ile tiyol-reaktif recCD47 poli-lisin ile birlikte PDT BzPh ve TCEP kullanımı yoluyla tiol-reaktif polimer yüzeyleri oluşturma polimerik yüzeylere recCD47 eklenmesine izin verir. Modifikasyon işlemi Şekil 1 şematik olarak özetlenmiştir. Bu modifikasyon işleminin rahatlık, bu protein varsayarak, örneğin amin içeren bir lisin ve yeterli kimyasal yönden reaktif gruplar ile modifiye edilebilir, bir çok farklı protein ve bir çok farklı polimerik yüzeylere uygulanabilir olmasıdır , polimer yeteri kadar me...

Kanın polimerik kan kanallarına maruz kalması, klinik komplikasyonlarda rol oynayan yabancı cisim reaksiyonunu başlatır. Burada, bu kanallardan kan perfüzyonunu taklit eden deneysel bir araç olan Chandler Döngü Aparatı açıklanmaktadır. Rekombinant CD47'nin eklenmesi, bu kanallar üzerindeki yabancı cisim reaksiyonunun kanıtlarının azalmasına neden olur.

Kullanımı Ex vivo Chandler Döngü Aparatı Modifiye Polimer Kan Kondüit biyouyumuna De¤erlendirilir

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kan bolluğunun Chandler Loop modelini kullanarak rekombinant CD 47 ile modifiye edilmiş polimerlerin biyouyumluluğunu değerlendirmektir. Bu, önce polimerlerin rekombinant CD 47 ile modifiye edilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak fotoaktivasyon kimyası kullanılarak, modifiye polimerler, implante edilmiş materyaller üzerinde kan perfüzyonunu taklit etmek için Chandler Loop'ta insan kanına maruz bırakılır.Daha sonra, bağlı hücreler, biyouyumluluğun bir ölçüsü olarak yapışan hücrelerin sayısını saymak için sabitlenir ve boyanır. Sonuçlar, rekombinant CD 47'nin, modifiye edilmemiş polimerlere kıyasla rekombinant CD 47 modifiye polimerlere önemli ölçüde daha az hücrenin yapıştığı gözlemine dayanarak, polimerlerin biyouyumluluğunu desteklediğini ve yabancı cisim reddini azalttığını göstermektedir. Bu yöntem, implante edilmiş tıbbi cihazların reddedilmesinin nasıl önleneceği gibi biyomalzemeler alanındaki temel soruları yanıtlayabilir.Bu tekniğin etkileri, implante edilebilir cihaz arızasının önlenmesine doğru uzanır, çünkü rekombinant CD 47, biyouyumluluğu teşvik etmede ve yabancı cisim tepkisini önlemede umut vaat etmektedir Tiyol reaktif polimerik yüz

the-use-ex-vivo-chandler-loop-apparatus-to-assess-biocompatibility

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Kan ile temas eden otolog hücre ve test biyouyumluluk biyomalzemeler tohumlama titanyum için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, cerrahi implantasyon dakika içinde domuz venae kava numaralı seribaşı endotel progenitör hücrelerin ve titanyum tüpler, kullanır. Bu teknik, diğer birçok implante biyomedikal cihazlar için uyarlanabilir.

Otolog Endotelyal progenitör Hücre-Yayımlama Teknoloji ve Büyük Hayvan Modeli Kardiyovasküler Cihazlar için Biyouyumluluk Testleri

Mikrovasküler ölçekli kanallar (&lt;30 um) ile bir mikroakışkan cihazın bütün iç yüzeyi boyunca kültürün 3B, endotel hücre mono tabakasında için bir yöntem tarif edilmiştir.

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Fotolitografi tarafından kazınmış ve PDMS imal Mikroakışkan akışı odaları EC disfonksiyonu ve inflamasyon ile ilişkili fonksiyonel sonuçlarını araştırmak için uygulanır. Temsili bir deneyde, diferansiyel kayma gerilmesi yeteneği sitokin aktive AK monolayers için monositik hücre adezyon modüle gösterilmiştir.

On-Chip Endotel İnflamatuar fenotipleme

Fizyolojik Akış Koşullarında Sirkülasyon Hücre Kemokin-yönettiği Ekstravazasyon Eğitim Bir Roman Üç boyutlu Akış Odası Cihazı

Burada, biz araştırmacı bir fare dolaşım sistemine endotel kaynaklı yapışma molekülleri ile kaplanmış bir odayı bağlayarak lökosit işe dinamikleri ex vivo değerlendirmek için izin veren bir protokol mevcut. Göreceli biyolojik şartlar altında lökosit değerlendirme sağlar, bu yöntem önemli avantajlar sunar.

Bir Flow Koşullarında lökosit-endotel Etkileşimleri değerlendirilmesi Ex vivo Autoperfused Microflow Odası Deneyi

Biz bütün, anticoagulated kan çalışma ve koagülasyon analizini sağlayan bir vitro modeli mevcut. Anticoagulation sistemi sağlıklı endotel hücreleri doğal anticoagulation etkisi bağlıdır ve endotel hücre aktivasyonu pıhtılaşma içinde sonuçlanır.

Endotel hücreleri kullanarak 3D hücre kültürü ve sigara anticoagulated tam kan antikoagülan ve anti-enflamatuar özellikleri değerlendirilmesi

Bakteriyel bağlılık doku grefti incelenmesi sağlar bir in-house tasarlanmış vitro akışı odası modeli açıklar.

Vitro modeli doku grefti bakteriyel bağlılık çalışmaya paralel-plaka perfüzyon sistemi

Bu protokol, lazer kesim nörovasküler implantlar kullanılarak kanla temas eden cihazların kapsamlı bir hemouyumluluk değerlendirmesini açıklamaktadır. Taze, heparinize insan kanı ile bir akış döngüsü modeli kan akışını taklit etmek için uygulanır. Perfüzyon sonrası çeşitli hematolojik belirteçler analiz edilir ve test edilen cihazların hemokompatibilite değerlendirmesi için kan alındıktan sonra doğrudan elde edilen değerlerle karşılaştırılır.

İnsan Kan Akışını Taklit Eden Akış Döngüsü Modelinde Kanla Temas Eden İmplantların Hemokomuuyum Testi

Burada sunulan bir standart in vitro hemodinamik döngü modeli için bir protokoldür. Bu model perfüzyon tüpleri veya vasküler stentlerin hemouyumluluğunun ISO (International Organization for Standardization) standardı 10993-4'e uygun olarak test edilmesine olanak sağlar.

Vasküler Tıbbi Cihazların Hemositokomisyonla uyumluluğunu ve Konak Hücre Aktivasyonunu Araştırmak için Bir In Vitro Hemodinamik Döngü Modeli

Bu protokolün amacı, kesme stresi ve döngüsel esnemenin birleşmesini sağlayan bir biyoreaktör kullanarak, malzeme güdümlü doku yenilenmesini araştırmak için tübüler elektrospun iskelelerinde insan makrofajları ve miyofibroblastların dinamik bir ortak kültürünü yürütmektir.

Akış ve Esneme Altında Biyomalzemelerin Enflamatuar ve Rejeneratif Kapasitesini Değerlendirmek için Çok İşaretli Bir Biyoreaktör

Bu protokol, çeşitli potansiyel uygulamalara izin veren bir sağkalım prosedürü olarak kateterizasyon ve 3D anjiyografi kullanılarak venöz uyum ve uzayabilirliğin in vivo olarak ölçülmesine izin verir.

İnferior Vena Kava Uyumunun ve Genişletilebilirliğinin İn Vivo Küçükbaş Hayvan Modelinde 3D Anjiyografi Kullanılarak Ölçülmesi

Keşfedin, Chandler Döngü modeliyle rekombinant CD47 modifiyeli polimerlerin biyouyumunu değerlendirin. Bu yöntem, yabancı cisim reaksiyonunu azaltarak implant edilebilir tıbbi cihazların reddini önlemeye yardımcı olur.

Kullanımı Ex vivo Chandler Döngü Aparatı Modifiye Polimer Kan Kondüit biyouyumuna De¤erlendirilir

Daha fazla video keşfet