Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

Bu prosedürün genel amacı, belirli bir proteom içindeki protein, protein etkileşimlerini diğer teknolojilerle mümkün olmayan paralel tarafsız bir şekilde tanımlamaktır. Bu, bir mikroskop lamının yüzeyinde bir koordinat düzleminde biriktirilen, yüksek oranda saflaştırılmış, tam uzunlukta fonksiyonel bir protein kütüphanesi ile ilgilenilen proteinin ilk hibritleştirilmesi ve epitop etiketli hale getirilmesiyle gerçekleştirilir. Protein, dizi üzerindeki ilgili hedef proteinlerinin her biri ile dengeye ulaştığında, bağlanmamış fraksiyon yıkanır ve protein etkileşimleri, standart bir mikrodizi tarayıcı kullanılarak bir floresan parçasına konjuge edilmiş epitopa bir monoklonal antikor ile tespit edilir.

Elde edilen görüntüler, bağlı protein ve floresan sinyaline göre her bir özelliğin yoğunluğu ile ilgili bilgilerle iç içe geçirilir. Bu bilgi, dizideki her bir özellik için yoğunluk değerlerinin bir listesini oluşturmak için mikrodizi analiz yazılımının yardımıyla tahmin edilir. Protein-protein etkileşim çifti ile ilgili bilgiler, özelliğe özgü verileri puanlamak ve ilgilenilen protein ile mikrodizi üzerindeki proteinler arasındaki protein protein etkileşimlerini belirlemek için aşağı akış biyoinformatik analiz yazılımına aktarılabilir.

Ham sinyal yoğunluğu verileri, tahliller arası ve tahlil içi varyasyonu hesaba katmak için iki veya daha fazla protein mikrodizisi üzerinde derlenir ve veriler, etkileşimlerin her birini puanlamak için normalleştirilir. Elde edilen çıktı, protein protein etkileşimlerinin daha fazla sorgulanmasına rehberlik etmek için kullanılabilecek etkileşimli proteinlerin bir hedef listesini oluşturur. İn vivo Fonksiyonel protein mikrodizisi, 15 yıldan uzun bir süre önce Michael Snyder'ın laboratuvarında geliştirildi.

O zamandan beri, çok yönlülüğü ve biyokimyasal proteomik tahlilleri nedeniyle bu teknolojinin birçok başarılı uygulaması olmuştur. Bu teknik, protein etkileşimlerinin ve modüler sinyal ağlarının yanı sıra alternatif bağlantı ve daha önce bilinen sinyalizasyon kaskadlarının incelenmesini kolaylaştırır V beş füzyon kinaz problarını kültürlemek ve saflaştırmak için, V beş füzyon protein plakası, sentetik tam urasil,% 2 dekstroz agar üzerindeki maya içeren taze çizgili maya suşu Y 2 58 kullanın ve donmuş kültürden üç gün boyunca 30 santigrat derecede büyür. Başlangıç kültürlerini tek bir koloniden aşılayın ve gece boyunca sentetik tam urasilde büyütün.

30 santigrat derecede sallanan bir platform veya tekerlek üzerinde% 2 dekstroz. Ertesi sabah, 400 mililitre sentetik tam urasil aşılayın. 600 nanometrede nihai optik yoğunluk veya 0.1 OD 600 elde etmek için yeterli başlangıç kültürüne sahip %2 rafinoz kültürü.

Aşıları 0.6'lık bir OD 600'e büyütün, daha sonra yeterli miktarda üç x maya özütü ekleyerek V beş kinaz füzyon yapı ekspresyonunu indükleyin. İndüksiyon ortamını üç kat veya %2'lik bir son galaktoz konsantrasyonu ile seyreltmek için% 6 galaktoz ile desteklenmiş Pep tonu, çalkalama platformunda altı saat boyunca 30 santigrat derecede hücreleri indükleyin. Uygun havalandırmayı sağlamak için iki litrelik bir erlenmeyer şişesi kullanın.

Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1000 kez G'de 400 mililitre hücre süspansiyonunu döndürerek hücreleri hasat edin. Hücreleri bir kez 50 mililitre buz gibi soğuk PBS tamponu ile yıkayın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Peleti tekrar buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin veya bir PBS tamponunda yıkayın ve lizis için iki mililitrelik geçmeli kapak tüplerine aktarın.

Hücreleri dört santigrat derecede bir dakika boyunca 20.000 kez G'de döndürdükten sonra, tamponu bir pipetle çıkarın ve tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Hücreleri 0.5 milimetre zirkonya boncukları ile bire bir hacimde hücre peletinden boncuklara PBS lizizine, tampona yerleştirin. Daha sonra, dört santigrat derecede iki dakikalık aralıklarla bir çalkalama platformu kullanarak karışımı üç kez girdaplayın.

Lizatı 20.000 kez, G'yi bir masa üstü mikro füje dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Arıtılmış lizatı yaklaşık 100 mikrolitre önceden yıkanmış nikel afinite reçinesi içeren bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede iki saat boyunca bir nutat üzerinde inkübe edin. Histamini yakalamak için, altı x etiketli V, beş füzyon proteini, süpernatantın çıkarılmasını takiben 1000 kez G ve dört santigrat derece sıcaklıkta beş dakika boyunca bir masa üstü santrifüj kullanarak reçineyi peletleyin.

Reçineyi mutatör üzerinde dört santigrat derecede 10 dakika boyunca yıkama tamponu ile yıkayın. Taze yıkama tamponu ile yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Proteinleri iki adet 100 mikrolitrelik hacimde 200 milimolar ole ile elteleyin.

Numunelerin %30'luk nihai konsantrasyonuna gliserol ekleyin ve tahlilde kullanılana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Etkileşimleri tespit etmek için. V beş floro dört konjuge antikoru probda mililitre başına 260 nanograma seyreltin, tamponlayın ve çalkalayarak iyice karıştırın.

Daha sonra V beş füzyon proteini Probunu mililitre başına beş ila 500 mikrogram arasında bir konsantrasyon aralığında seyreltin. Daha sonra, protein mikrodizilerini dondurucudan çıkarın ve kullanmadan hemen önce buzdolabında dört santigrat dereceye getirin. Engelleme tamponunu doğrudan protein mikrodizilerini içeren sürgü tutucuya ekleyin ve sızıntıyı önlemek için üst kısmı paraform ile örtün.

Dört santigrat derecede bir sahnede 50 RP'de sallayarak bir saat boyunca engelleme tamponundaki dizileri engelleyin. Bloklamadan sonra, dizileri dört santigrat dereceye kadar döşenmiş nemlendirilmiş bir odaya aktarın ve doğrudan dizi yüzeyine 90 mikrolitre seyreltilmiş prob ekleyin. Dizileri yükseltilmiş bir kaldırıcı kızağı ile kaplayın ve nemlendirilmiş odada dört santigrat derecede bir buçuk saat boyunca sallamadan inkübe edin İnkübasyonun ardından, slaytı, slaytı tamamen sarmak için yeterli miktarda önceden soğutulmuş prob tamponu içeren 50 mililitrelik bir konik tüpe ekleyin, bu da kaldırıcı kaymasının protein mikrodizisinden nazikçe kaymasına izin verir.

Dizileri üç konik tüpte her biri bir dakika boyunca üç kez yıkayın. Yıkamayı tamamladıktan hemen sonra antikor solüsyonunu doğrudan diziye uygulayın ve silinmiş kaldırıcı kayma ile kaplayın. Daha önce olduğu gibi, dizileri nemlendirilmiş odada dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Daha önce olduğu gibi aynı yıkama adımını gerçekleştirin ve 15 mililitrelik bir konik tüpte 800 kez G'de bir masa üstü santrifüjde beş dakika döndürün. Oda sıcaklığında, diziyi 647 nanometrede taramadan önce dizileri karanlıkta 30 dakika boyunca bir kayar tutucuda havayla kurutun. Bu deneyde, TDA bir V beşin bağlanma aktivitesi araştırılmıştır.

Yaklaşık 4.200 tam uzunlukta GST füzyon proteini ile çift olarak tespit edilen maya proteini mikrodizileri, boş vektör kontrolü veya TDA bir V beş prob ile inkübe edildi. İç paneller, her iki dizideki aynı bölgeyi karşılaştırır. Özellikle dikkat edilmesi gereken, daha önce yayınlanmış bir çalışmada ilginç bir şekilde TDA'nın fosforile edilmiş bir hedefi olarak da tanımlanan RIM 11'dir.

Hedefler belirlendikten sonra, in vivo olarak biyokimyasal ve fonksiyonel aktivite açısından test edilebilirler. Bu videoyu izliyorsanız, daha fazla in vivo doğrulama ve sorgulama için aday protein protein etkileşimlerini tanımlamanın bir yolu olarak fonksiyonel protein mikrodizilerinin nasıl kullanılacağını daha iyi anlamalısınız.