Name: Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Öğrenin, protein-protein etkileşimlerini yüksek verimli fonksiyonel protein mikrodizileri kullanarak tanımlama yöntemini. Bu teknik, binlerce etkileşimi paralel olarak tarayarak biyokimyasal ve proteomik araştırmaları hızlandırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma NIH'den bir hibe ile desteklenmiştir. Şekil 1'de gösterilen tahliller Dr. Joseph Fasolo tarafından gerçekleştirilmiştir. Yararlı yorumları için Dr. Rui Chen'e teşekkür ederiz.

1. Probe Hazırlık <ol><li> Kültür ve aşağıdaki gibi diğer proteinler ile etkileşimini incelemek için kullanılmıştır V5 füzyon kinaz probları saflaştırılması: <ol><li> Taze çizgili maya suşu Y258 kullanın (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) (GATEWAY vektör pYES-DEST52 ifade edilen) V5-füzyon proteini içeren. Mikrodiziler üzerinde prob olarak izole edilmiş proteini kullanın. Sentetik tam-urasil (Sc-Ura) /% 2 dekstroz / Agar maya Plate ve dondurulmuş kültürünün (-80 ° C gliserol stoku) 3 gün boyunca 30 ° C&#39;de büyütülmüştür. </li><li> Tek bir koloniden başlatıcı kültürleri (5.20 mi) aşılamak ve 30 ° C &#39;de platformun (220-250 rpm) veya tekerlek çalkalama SC-Ura /% 2 dekstroz içinde bir gece boyunca büyür. </li><li> Ertesi sabah, bir nihai OD 0.1 600 yeterli starter kültür ile Sc-Ura /% 2 rafinoz kültürünün 400 ml aşılamak. </li><li> 0.6 600 V5-kinaz fu galaktoz indüksiyon ardından OD inokulantlar büyütünyon şekilde galaktoz nihai konsantrasyonu,% 2, 3 kat endüksiyon ortamı seyreltilmesi için yeterli eklenerek,% 6 galaktoz ile takviye edilmiş 3x Maya Özü / Pepton (YEP) içindeki bir çözeltisi ilave edilerek ifade yapısı. </li><li> Bir çalkalama platformu üzerinde 6 saat boyunca 30 ° C&#39;de hücre neden. Uygun havalandırma sağlamak için 2 L Erlenmeyer şişesi kullanın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de hücre süspansiyonu 400 ml eğirme bir JA-10 (ya da eşdeğeri) bir rotor kullanılarak hasat hücreleri. </li><li> Buz, 50 ml soğuk PBS tamponu ve 50 ml konik tüp transferi ile bir kez hücreler yıkanır. Liziz tüpleri kapaklı ek ml 2 liziz ve transferi için kullanılan (deterjanlar veya diğer katkı maddeleri hariç), buz gibi soğuk PBS tamponu içinde yeniden pelet yıkayın. </li><li> Bir pelet ve bir pipet uzaklıkta tamponu, 4 ° C&#39;de 1 dakika boyunca 20,000 xg&#39;de hücreleri dönerler. </li><li> Buz üzerinde tüpler yerleştirin ve parçalama adımla devam edin. </li><li> Lyse hücreleri (250-350 ul pelet) 0 ile1: 1 .5 mm zirkonyum boncukları hücre peleti, taneler, ve fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 hacim 4 ° C &#39;de 2 dakika aralıklarla tampon ve vorteks ajitasyon platformunu 3 kez kullanılarak karışımın lizis. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca masa üstü mikrofüj içinde 20,000 x g&#39;de santrifüjleyin lizat. </li><li> Pipet polikarbonat yüksek hızlı santrifüj tüpüne süpernatan ve 4 ° C&#39;de 150,000 x g&#39;de 30 dakika boyunca ulracentrufugation berrak hale getirilmelidir. </li><li> Histidin yakalamak için 4 ° C&#39;de 2 saat süreyle nutator önceden yıkanmış Ni2 + afinite reçinesi (~ 100 ul) ihtiva eden bir tüpe açıklık lizat aktarın ve inkübe (His) 6X V5-füzyon proteinini etiketli. </li><li> Yıkama Tamponu ile 4 ° C &#39;de 10 dakika süre ile, reçineyi üç defa yıkanır. 4 ° C&#39;de 1000 x g&#39;de 5 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj kullanılarak reçine pelet ve süpernatan aspire. Her yıkama için taze yıkama tamponu ekleyin ve yıkama esnasında tüpü ajitasyon için Nutator döndürür. </li><li> Yıkama ste sonraps tamamlandı, elüsyon için yeni bir G-25 kolonuna yıkanır reçineyi uygulayın. </li><li> 9 fraksiyonların toplam 50 mm&#39;lik artışlarla 500 mM imidazol, 100 mM imidazol ile başlayan aşamalı bir şekilde elüsyon tamponu 25 ul uygulanır. </li><li> Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel kullanılarak toplanan fraksiyonları deneyi (SDS-PAGE) ve deneyde kullanım için en fazla zenginleştirilmiş bölüm (ler) i tespit ve -80 ° C &#39;de% 30 ve saklamak için gliserol ekleyin Coomassie boyaması, kullanılıncaya kadar deneyi. </li></ol></li></ol> 2. Diziler Probing NOT: tahlili başlamadan önce antikor çözeltisi hazırlamak için bu bölümün aşamasını 2.6 bakınız. <ol><li> Etkileşimlerini tespit etmek için, numune tamponu içinde 260 ng / ml&#39;ye kadar V5-florofor konjuge antikor (örneğin, AlexaFluor 647) sulandırılır ve çalkalama ile iyice karıştırın. NOT: kullanımı ve nutat üzerine tüp yerleştirmek için 30 dakika kala bu antikor çözüm hazırlayında tekerlek tam karıştırma ve antikor homojen bir süspansiyon sağlamak. </li><li> 5-500 ug / ml&#39;lik bir konsantrasyon aralığı üzerinde V5-füzyon proteini probu ile seyreltilir. Not: Prob tamponu kullanılarak, her bir protein-protein etkileşimi deneyi için optimize edilmiştir. Optimizasyon tampon soruşturma daha sondalar ekleyerek içerir. Tipik olarak 10 ug / ml başlangıç ​​noktası olarak kullanılır ve sinyal gücüne göre uygun şekilde ayarlanır. </li><li> Dondurucu (-20 ° C), elde edilen protein mikrodizileri çıkarın ve kullanımdan hemen önce buzdolabında 4 ° C&#39;ye getir. </li><li> Sızmasını önlemek için parafilm ile üst protein micorarrays içeren slayt sahibine doğrudan engelleme tampon ekleyin ve kapsamaktadır. 4 ° C &#39;de bir sahne üzerinde 50 rpm&#39;de çalkalanarak 1 saat boyunca bloke edici tampon içinde dizileri bloke eder. </li><li> Bloke edildikten sonra, 4 ° C&#39;ye soğutulmuş, nemlendirilmiş bir odacıkta diziler transferi, doğrudan dizi yüzeye seyreltilmiş prob 90 ul ekle. Arr Yerleşimi1.5 saat boyunca 4 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir haznede lekelenmiştir yükseltilmiş bir kaldırma kayma ays ve statik inkübe (bir çalkalama). </li><li> Üç 50 ml konik tüpler prob tamponunda 1 dakika her diziler 3 kere yıkayın. Tamamen slayt zarf yeterli önceden soğutulmuş prob tampon içeren konik tüplere slayt ekleyin. Kaldırıcı kayma yavaşça protein mikroarray (bu dizi yüzeyine zarar görmesine neden olabilir gibi onu zorlamayın) kapalı slayt izin verin. </li><li> Hemen önce olduğu gibi yükseltilmiş kaldırıcı kayma yıkama (adım 2.5) ve bindirme tamamladıktan sonra diziye doğrudan antikor çözümü uygulayın. Nemlendirilmiş bir odada 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca inkübe edin dizileri. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca masa üstü santrifüjü içinde 800 xg&#39;de 50 ml konik bir tüp içinde, aynı yıkama (prob tampon maddesi içinde 3 kez 1 dakika) daha önce olduğu gibi adımı, ve spin gerçekleştirin. 647 nm dizi taramadan önce 30 dakika süreyle karanlıkta bir slayt tutucu dizileri Hava kurutun. </li></ol>

<ol><li>Fasolo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+protein+kinase+interactions+identified+by+protein+microarrays+reveal+novel+connections+between+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes.</a> Genes. 25, 767-778 (2011).</li>
<li>Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProCAT%3A+a+data+analysis+approach+for+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays.</a> Genome biology. 7, R110(2006).</li>
<li>Breitkreutz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+protein+kinase+and+phosphatase+interaction+network+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast.</a> Science. 328, 1043-1046 (2010).</li>
<li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415, 141-147 (2002).</li>
<li>Jeong, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+monospecific+monoclonal+antibodies+using+a+human+proteome+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li>
<li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293, 2101-2105 (2001).</li>
<li>Ptacek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+phosphorylation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein phosphorylation in yeast.</a> Nature. 438, 679-684 (2005).</li>
<li>Haab, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+arrays+in+cancer+research.+Molecular+%26+cellular+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).</li>
<li>Kopf, E., Zharhary, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+arrays--an+emerging+tool+in+cancer+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).</li>
<li>Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays%3A+novel+developments+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays: novel developments and applications.</a> Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).</li>
<li>Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+microarray+surfaces+and+arraying+parameters+for+autoantibody+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling.</a> Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).</li>
<li>Gelperin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).</li>
<li>Fasolo, J., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays.</a> Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).</li>
<li>Im, H., Snyder, M., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIm%2C+H+%22Current+protocols+in+protein+science%22">Current protocols in protein science</a>. Coligan, J. E. 27, Unit 27 24(2013).</li>
<li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Protokol başlangıçta in vivo 1&#39;de yeni kinaz etkileşim ağlarının tanımlanmasında elde edilen maya protein kinazların farklı ve ilgili ailelerdeki bağlanma aktivitesini karşılaştırmak için 85 benzersiz bir maya protein kinaz-V5 füzyon proteinleri kullanılarak gerçekleştirildi kullanarak verilmiştir. Gelişmekte olan bir proteomik profilleme teknolojisi olarak, Yüksek Çıkan (SDP) peptid kütüphaneleri ve ökaryotik ve prokaryotik model organizmaların 8,17 dayanmıştır protein mikrodiziler ku...

Protein biyokimya ve in vivo bağlanma faaliyeti küresel analizlerini gerçekleştirmek için gerek protein-protein etkileşimlerini (PPIs) ve bütün proteomlarda 1,3-8 arasında post-translasyonel modifikasyonlar profil için yeni yöntemlerin geliştirilmesine yol açmıştır. Protein mikrodizileri antikorları 10,11 ihtiva 4-6,8,9 tam uzunlukta fonksiyonel proteinleri kullanılarak fonksiyonel bir protein mikrodizilerinin veya analitik protein mikrodizilerinin olarak imal edilir. Bunlar 12 analiz, geniş kapsamlı biyokimyasal iletmek için gereken deney koşulları çeşitli kolaylaştırmak için yüzey kimyaları çeşitli mikroskop lamları üzerine dizilmiş, proteinlerin yüksek yoğunluklu içeren tasarlanmıştır. Bu tür diğerleri 13 arasında afinite eki için His-etiketli proteinler ve glutatyon takmak için nikel şelatlı slaytlar olarak lizin veya afinite eki yöntemleri ile kimyasal bağlanması için nitroselüloz ve aldehit yüzey kimyaları. </p&gt; protein-protein etkileşimleri tespit etmek için fonksiyonel protein mikrodizilerinin kullanımı yüksek kaliteli, fonksiyonel bir protein kitaplığına 14 erişim gerektirir. S. cerevisiae yüksek verimli kromatografik saflaştırma teknikleri protein takılı yapılar yüksek kopya afinitesi eşleştirme yoluyla bu tür bir kütüphane üretilmesi için müsait olan. Maya genomunun büyük bir çoğunluğu dizilenmiştir ve neredeyse tüm proteom saflaştırma için yüksek kopya plazmid eksprese edilebilir ve biyokimyasal 12 analiz eder. Proteinler elde edilir ve 384 oyuklu formatta dizilmiş sonra, bunlar, hızlı paralel çok parametre biyokimyasal analizler ve biyoinformatik sorgulama 8,14-16 sağlayan bir mikroskop lamı üzerine basılır. Protein mikrodizileri diğer birçok uygulamalar arasında proteinler, lipidler, küçük moleküller, ve nükleik asitler ile enzimatik deney ve etkileşimleri için kullanılmıştır. proteomun yüzeyi üzerinde proteinlerin erişilebilirlikdiziler de dahil olmak üzere, analitik tespiti farklı immün afinite onları müsait hale plazmon rezonansı, floresans ve pek çok başka teknik yüzeyler. Ayrıca, in vivo yapmak zor olabilir deneysel koşul ince kontrol sağlar. Bu protokolün amacı, protein-protein etkileşimleri tespit etmek için fonksiyonel protein mikrodizilerinin uygun kullanımını göstermektir. Bu uygulama, ilgi konusu bir yüksek ölçüde saflaştırılmış analiti (protein) kullanılarak protein bağlanma faaliyetleri, yüksek verimli, paralel biyokimyasal analiz sağlar. Bir C-terminali (ucu karboksi) ilgi V5-füzyon yem proteini, protein saflaştırma için optimize edilmiş bir maya suşunda bir yüksek kopya plazmid elde edilir etiketli. C-terminali etiketleme tam boyda bir protein çevrildi sağlar. Bu çalışmada kullanılan protein His6X etiketi ile nikel afinite reçinesi kullanılarak saflaştırılır Tda1-V5 füzyon protein kinaz vardır. Tda1-V5 füzyon konstrüksiyont tahlilinde kullanım için en fazla zenginleştirilmiş fraksiyonu elüt edilmesi için bir imidazol gradyanı kullanılarak, seri elüsyon yoluyla saflaştırılır.

<table><tbody><tr><td>Petri Kapları</td><td>VWR</td><td>NC-10747</td><td>veya karşılaştırılabilir</td></tr><tr><td>Bacto maya özü</td><td>Difco</td><td>0217-17</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>Difco</td><td>0118-17</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroz</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Rafinoz</td><td>Sigma</td><td>R0514</td><td></td></tr><tr><td>Galaktoz</td><td>Sigma</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>Sc-Ura bırakma ortamı</td><td>MP Bio</td><td>114410622</td><td></td></tr><tr><td>Küçük Kültür tüpleri</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Büyük Erlenmeyer Şişesi</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj JA-10 rotorlu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpleri (500 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon tüpü (50 ml)VWR</td><td>/Fisher</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tabletler</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep Tüpleri (2 ml vidalı kapaklı tüp)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastPrep Machine</td><td>MP Biyomedikal</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>Zirkon Boncuklar</td><td>BioSpec</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol (pH = 7.4)</td> <td>Sigma</td><td>I5513&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>Komple İnhibitör Kokteyli (EDTA İçermez)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataz inhibitör kokteyli 1</td><td>sigma</td><td>P2850</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ara-20</td><td>Sigma</td><td>P1379&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A1852&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalama Kuvözü (30 &° C; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Nikel Afinite Reçine</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>R901-01</td><td></td></tr><tr><td>G25 sütun</td><td>GE yaşam bilimleri</td><td>27-5325-01 & nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Jel (NuPage)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue Stain</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal V5 Antikor</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>R960-25</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 Takip edilen monoklonal V5 Antikor</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>451098</td><td></td></tr><tr><td>Protein Mikrodizileri Kit</td><td>Life Technologies</td><td>PAH0525013</td><td></td></tr><tr><td>Genepix Tarayıcı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaldırıcı Fişleri</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/</td></tr> <tr><td>Lizis Tamponu:% 0.1 Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl < alt > 2< / alt >, 500 mM NaCl, 50 mM imidazol (pH 7.4), Komple proteaz inhibitörü kokteyli & ndash; EDTA içermeyen, Fosfataz inhibitörü Kokteyl 1, 1 mM PMSF&nbsp; (kullanmadan hemen önce ekleyin)</td><td></td><td></td><td>İstenilen hacimde lizis çözeltisi elde etmek için reaktifleri 1x PBS'ye (0.01 M fosfat tamponu, 0.0027 M potasyum klorür, 0.137 M sodyum klorür; pH 7.4) ekleyin</td></tr><tr><td>Blokaj Tamponu: %1 sığır serum albümini (BSA), %0.1 Tween-20</td><td></td><td></td><td>İstenilen hacimde bloke edici tampon elde etmek için reaktifleri 1x PBS'ye ekleyin</td></tr><tr><td>Prob Tamponu: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, %0.05 Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 &; M ATP (kinazlar için), %1 BSA</td><td></td><td></td><td>İstenilen hacimde prob tamponu elde etmek için reaktifi 1x PBS'ye ekleyin</td></tr><tr><td>Yıkama Tamponu: %0.1 Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazol (pH 7.4),2 mM MgCl<alt>2</alt></td><td></td><td></td><td>İstenilen hacimde prob tamponu elde etmek için reaktifi 1x PBS'ye ekleyin</td></tr><tr><td>Elüsyon Tamponu:% 0.1 Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl 2 , 500 mM NaCl, 50 &ndash; 500 mM imidazol (pH 7.4), Tam proteaz inhibitörü kokteyli &ndash; EDTA içermeyen, Fosfataz inhibitörü Kokteyl 1, 1 mM PMSF (kullanımdan hemen önce ekleyin)</td><td></td><td></td> <td>Başlamadan önce, imidazolün konsantrasyon gradyanını (50 & 500 mM) not etmek ve her konsantrasyon için ayrı tüpler oluşturmak önemlidir (aralığın 50 mM'lik artışlar kullanılarak oluşturulması tavsiye edilir). İstenilen hacimde prob tamponu elde etmek için reaktifi 1x PBS'ye ekleyin</td></tr><tr><td>3x YEP +% 6 galaktoz: 30 g maya ekstraktı ve& nbsp; 60 g peptonu 700 ml H2O ve otoklavda çözün. 300 ml filtre ile sterilize edilmiş %20 galaktoz (ağırlıkça/hacim)</td><td></td><td></td><td>&nbsp; Galaktoz otoklavlanmamalıdır</td></tr></tbody></table>

yüksek yoğunluklu fonksiyonel protein mikrodizileri probing protein-protein etkileşimleri algılama

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

~ 4200 rekombinant maya proteinleri içeren yüksek yoğunluklu fonksiyonel bir protein mikrodizileri okuması için V5-epitop etiketi ihtiva eden bir afinite saflaştınldı maya kinaz füzyon proteini kullanılarak kinaz, protein-protein etkileşimleri için incelenir. Saflaştırılmış kinaz bir kinaz-V5 füzyon GAL uyarımlı promotör altında yapıyı içeren bir plazmid yüksek kopya protein üretimi için optimize edilmiş bir maya suşu kültürü ile elde edilir. maya,% 2 galaktoz ile endüksiyon ile, ardından 6 saat boyunca nötr bir karbon kaynağı ile kısıtlayıcı ortamda yetiştirilir. Daha sonra, kültür hasat edilir ve kinaz deneyinde kullanılmak için yüksek ölçüde saflaştırılmış protein kinaz elde etmek üzere standart afinite kromatografik teknikleri kullanılarak saflaştırılır. Saflaştırılmış kinaz deneyi için uygun bir aralığı, kinaz tamponu ile seyreltilir ve protein mikro-dizileri, protein önce mikroarray ile hibridizasyon için bloke edilir. Hibritlemeden sonra, diziler monoklonal V5 antib ile sondalandıODY kinaz-V5 proteiniyle bağlanmış proteinleri belirlemek için. Son olarak, diziler, standart bir mikrodizi tarayıcısı kullanılarak tarandı ve veriler, in vivo aşağı doğru doğrulama için protein etkileşimleri belirlenen yüksek bir güven belirlemek için alt bilişim analiz 1,2 ekstre edilir.

Protein-protein etkileşimi aktivitesi Tda1-V5 protein kinaz füzyon yaklaşık 4,200 özgü S. ihtiva eden bir maya fonksiyonel bir protein mikrodizi karşı bir yem protein olarak inşa değerlendirmek için standart bir çipli okuyucu kullanılarak gözlenmiştir cerevisiae GST-füzyon proteinleri. GenePix yazılımı ile ayrıntılı sorgulama değişen şiddetlerde olayları bağlayıcı bir sürü gösterdi. afinite hedefine (V5-kinaz) bağlı bir monoklonal V5-Florofor konjuge antikor türetilen sinyalin kademeli yoğunluğu elde g...

Neredeyse tüm S. içeren protein mikrodiziler kullanarak cerevisiae proteom paralel protein-protein etkileşimleri, binlerce hızlı tarafsız sorgulama için incelenir. Bu yöntem, protein-küçük molekül, translasyon sonrası modifikasyon ve yüksek verimlilik Diğer tahliller için kullanılabilecektir.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Bu prosedürün genel amacı, belirli bir proteom içindeki protein, protein etkileşimlerini diğer teknolojilerle mümkün olmayan paralel tarafsız bir şekilde tanımlamaktır. Bu, bir mikroskop lamının yüzeyinde bir koordinat düzleminde biriktirilen, yüksek oranda saflaştırılmış, tam uzunlukta fonksiyonel bir protein kütüphanesi ile ilgilenilen proteinin ilk hibritleştirilmesi ve epitop etiketli hale getirilmesiyle gerçekleştirilir. Protein, dizi üzerindeki ilgili hedef proteinlerinin her biri ile dengeye ulaştığında, bağlanmamış fraksiyon yıkanır ve protein etkileşimleri, standart bir mikrodizi tarayıcı kullanılarak bir floresan parçasına konjuge edilmiş epitopa bir monoklonal antikor ile tespit edilir.Elde edilen görüntüler, bağlı protein ve floresan sinyaline göre her bir özelliğin yoğunluğu ile ilgili bilgilerle iç içe geçirilir. Bu bilgi, dizideki her bir özellik için yoğunluk değerlerinin bir listesini oluşturmak için mikrodizi analiz yazılımının yardımıyla tahmin edilir. Protein-protein etkileşim çifti ile ilgili bilgiler, özelliğe özgü verileri puanlamak ve ilgilenilen protein ile mikrodizi üzerindeki proteinler arasındaki protein protein etkileşimlerini belirlemek için aşağı akış

probing-high-density-functional-protein-microarrays-to-detect-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video kullanımı ile mikro-desenli yüzeyler, protein-protein etkileşimleri sonraki analizi ile deneyler gösterir. Bu yaklaşım, canlı hücreler protein etkileşimleri tespit etmek imkanı sunar ve kantitatif bilgileri ayıklamak imkanı ile yüksek verimlilik özellikleri bir araya getiriyor.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Bu çalışmada, özel proteinlerin glikozilasyon profil kullanılabilir lektin saptama yöntemi ile çoklanır yüksek verim antikoru mikroarray için geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, yeni, güvenilir reaktif özellikleri ve önemli ölçüde daha önceki prosedüre göre zaman, maliyet ve laboratuar ekipmanları gereksinimlerini azaltır.

Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

Bu videoda, hücre içi protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için biyotinile hücreye nüfuz eden peptitlerin kullanıldığı bir teknik gösterilmektedir. Hücreye nüfuz eden peptitler, konjuge peptitin bir hücreye girmesini ve spesifik olarak etkileşen proteinlerine bağlanmasını kolaylaştırır. Biotin, avidin'e bağlandıktan sonra, etkileşen proteinlerin kompleksinin bir hücre lizatından saflaştırılmasına izin verir.

Protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için biyotinile hücreye nüfuz eden peptit probu

Protein etkileşimleri: SILAC immunopresipitasyon deneyler yeni proteini keşfetmek için güçlü bir araç temsil eder. Sağlayarak kontrol ve test örnekleri, gerçek etkileşim hem de protein bolluğu doğru nispi miktar kolaylıkla deneysel kirletici ayırt edilebilir ve düşük afiniteli etkileşimler daha az sıkı tampon koşullarında kullanımı yoluyla korunur.

SILAC-immunoprecipitation Kantitatif PROTEOMİK kullanma Memeli Hücrelerde Protein Etkileşim Ortakların Kimlik

Peptit dizisi taraması, protein-protein etkileşim bölgelerini tanımlamak için yüksek verimli bir testtir. Bu, bir hedef proteinin çoklu etkileşimlerinin haritalanmasına izin verir ve bir proteini hedef alan inhibitörler için bölgeleri belirlemek için bir yöntem olarak hizmet edebilir. Burada peptit dizilerini taramak ve analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Proteinler birbirleri ile etkileşim halindedir ve bu etkileşimler fonksiyonlarını büyük ölçüde belirler. Protein etkileşim ortakları, dihidrofolat redüktaz protein fragmanı tamamlama testine (DHFR-PCA) dayalı bir maya uygunluk testi kullanılarak in vivo olarak yüksek verimli olarak tanımlanabilir.

Yaşayan Hücrelerde Protein-fragmanı tamamlama Assay (PCA) ile genom Protein-protein etkileşimi Eleme

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Burada, içinde yüksek üretilen iş ekran ekstraselüler protein microarrays kimliği roman reseptör-ligand etkileşimleri için bir iletişim kuralına mevcut. Ayrıca protein-microbead kompleksleri kullanarak geçici protein-protein etkileşimlerinin algılama geliştirmek için bir yöntem açıklar.

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Cognate J-etki proteinleri hsp70 şaperon ile protein katlama bozulması arasında değişen biyolojik süreçler sayısız yardımcı olmak için işbirliği. Burada, bakteriyel, maya ve insan hücrelerinde geçici olarak oluşan bu şaperon makinelerinin izlenmesine olanak sağlayan bir in situ yakınlık ligasyon tetkikini tanımlıyoruz.

Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde

Burada, kimyasal problar ve kütle spektrometrisi kullanarak doğal hücrelerden ve dokulardan hastalığa özgü protein-protein etkileşimlerinin yakalanmasını ve tanımlanmasını sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Ortaya çıkan etkileşim veri kümeleri, dinamik ağ işlev bozukluklarını ve hastalıkla bağlantılı yol değişikliklerini ortaya çıkarmak için özel bir web tabanlı platform aracılığıyla analiz edilir.

Hastalıkta İşlevsel Olmayan Protein-Protein Etkileşimlerinin Haritalanması

Öğrenin, protein-protein etkileşimlerini yüksek verimli fonksiyonel protein mikrodizileri kullanarak tanımlama yöntemini. Bu teknik, binlerce etkileşimi paralel olarak tarayarak biyokimyasal ve proteomik araştırmaları hızlandırır.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

Daha fazla video keşfet