Kolloidal Probe Nanoscopy kullanarak parçacık-parçacık Etkileşimleri Nicel ve Nitel Sınav

Bu prosedürün genel amacı, sıvı bazlı bir kolloidal sistemdeki parçacıklar arasında mevcut olan nano ölçekli etkileşimler hakkında nicel bilgi elde etmektir. Bu, önce tek bir parçacığı bir uç atomik kuvvet mikroskobu konsoluna bağlayarak fonksiyonel bir kolloidal prob hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım, probu atomik kuvvet mikroskobuna monte etmek ve kolloidal parçacık substratı ile sıvı bir hücre hazırlamaktır.

Daha sonra, kolloidal probun yay sabiti ve hassasiyeti, mikroskop yazılımı kullanılarak termal olarak kalibre edilir. Son adım, kolloidal probu kullanmak ve kalibrasyon için sıvı içindeki kolloidal parça parçacık substratı ile etkileşimleri ölçmektir. Sıvı içinde bir MICA® substratı kullanılarak prob hassasiyetinin doğrudan ölçümü de sonuçta kolloidal prob yapılır.

Mikroskopi, incelenen sıvı kolloidal sistemin pıhtılaşma kinetiğinden ve fiziksel kararsızlığından sorumlu olabilecek parçacıklar arası kuvvetleri ölçmek için kullanılabilir. Bu yöntem, basınçlı sayaç dozu inhalerleri, farmasötik, intravenöz formülasyonlar, biyolojik sistemler ve diğer bazı sistemlerde bulunanlar gibi çeşitli sıvı kolloidal sistemlerin fiziksel stabilitesi ve pıhtılaşma kinetiğinden sorumlu temel parametrelerin belirlenmesine ve ölçülmesine yardımcı olabilir. Bu yöntem, bu iki katının ölçek dışı kimyasal ve fiziksel etkileşimleri hakkında çok derin bir içgörü sağlayabilir.

Bu bilgi, farmasötik formülasyonların stabilitesini tahmin etmek için kullanılabilir, ancak aynı zamanda parçacıkların veya farklı katıların hücrelere veya bakterilere afinitesini araştırmak için çok farklı biyolojik sistemlere de uygulanabilir. Kolloidal probu bir atomik kuvvet mikroskobu ucu, daha az konsol kullanarak hazırlayarak başlayın, konsolu burada görüldüğü gibi 45 derecelik bir açı tutucuya sabitleyin. Tutucu, konsolu yataydan 45 derece yukarıda destekler.

Bir sonraki adım, bunu yapmak için epoksiyi mikroskop lamına yerleştirmektir. Epsiyonu hazırladıktan sonra, lamın üzerine ince bir tabaka sürmek için temiz bir spatula kullanın. Geçici bir yapıştırıcı kullanarak, sürgünün karşı tarafını mikroskop lensi muhafazasına kaymak üzere tasarlanmış özel bir tutucuya takın.

Sürgü ve tutucu tertibatı ile mikroskoba geri dönün ve tamamlandığında tutucuyu lens muhafazasına kaydırın. Epoksili slayt, numune platformundaki konsolun üzerinde olmalıdır. Her şey yerindeyken, konsolu mikroskopla gözlemleyin ve platforma ve konsola epoksi slayta yaklaşın.

Konsol az miktarda epoksi aldığında, epoksi yerindeyken konsolu geri çekin. Konsolun tepesine iki ila beş mikronluk bir lipit parçacığı eklemek için aynı tekniği kullanın. Şimdi atomik kuvvet mikroskobu substratını hazırlayın.

35 milimetre yuvarlak bir kapak kızağı ve termoplastik bir montaj yapıştırıcısı kullanın. Kapak kızağını sıcaklık probu ile donatılmış bir sıcak plaka üzerinde ısıtın. Sıcak plaka yaklaşık 120 santigrat derece olduğunda, termoplastik yapıştırıcıyı uygulayın, sıcak plakayı kapatın ve bekleyin ve kapak kayması 40 santigrat dereceye kadar soğumaya başlar.

Bu noktada, kapak kaymasının tozunu az miktarda kolloidal parçacık ile alın. Kapak astarı oda sıcaklığına soğuduğunda bir tutucuya aktarın ve üzerine pipetleyerek yıkayın. Burada az miktarda sıvı ortam, floro PENTAN veya HPFP başına iki H üç H.

Bağlanmamış parçacıkları çıkarmak için bunu birkaç kez yapın. Bir sonraki adım, atomik kuvvet mikroskobunda veya bunun için bir FM'de kullanılmak üzere substratı monte etmektir, sıvı bir hücrenin alt yarısını kullanın, hücrenin alt yarısındaki kolloidal parçacıklarla kapak kızağını monte edin. Sızıntıyı önlemek için O-ringin düzgün şekilde oturduğundan emin olun.

Atomik kuvvet mikroskobunda sızıntılara karşı önlem alın. Mikroskop aşamasını şeffaf bir hidrofobik tabaka ile koruyun. Ardından sıvı hücreyi sahneye yerleştirin.

Kolloidal probu tarama kafasına taktıktan sonra, bunu A FM'ye monte edin. A FM ve enstrüman yazılımını başlatın ve konsol ucunu odak noktasına getirmek ve lazeri hizalamak için tarama kafası ayar düğmelerini kullanın. Lazeri hizalamak için lazer yoğunluğunu izleyin ve değerini en üst düzeye çıkarın. Sistemin havada dengelenmesine izin verin ve ardından sapmayı sıfıra veya biraz negatif bir değere getirmek için sapma ayar düğmesini kullanın.

Ardından, yazılımın ana panel penceresinden termal panele gidin. Kolloidal probun hassasiyetini bulmak için Ters optik kol hassasiyetini hesapla'yı seçin ve ardından termal verileri yakalayın. Belirgin bir tepe noktası göründüğünde, veri yakalamayı durdurun.

Ana tepe noktasını yakınlaştırmak için tıklayın, ardından sığdırmayı başlat'ı seçin. Uygun termal verilerin ardından bir hassasiyet değeri hesaplanacaktır. Kolloidal probun yay sabitini belirlemek için benzer bir prosedür izleyin.

Hassasiyet ve yay sabiti bulunduktan sonra, ortamı sıvı hücreye eklemenin zamanı gelmiştir. Konsol çevresinde kabarcık olmadığından emin olurken yavaşça iki mililitre eklemek için en az iki mililitre HPFP içeren bir şırınga kullanın. Ortamı ekledikten sonra, kırılma indisindeki bir değişikliği hesaba katmak için lazeri yeniden hizalayın.

Sapma değerinin HPFP'de beş ila 10 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Ardından tekrar sıfıra ayarlayın. Ana panelde taramaya hazır olduğunuzda, ilk tarama boyutunu 20 mikron olarak ayarlayın.

Bir hertz'e kadar tarama hızı, 90 dereceye kadar tarama açısı ve 0,2 volta ayarlayın. Örneğe yaklaşın ve tarayın. İlgilenilen bir parçacık bulunduğunda, parçacığı alt tabaka üzerinde konumlandırmak veya ana özelliklerinin yüksekliklerini bilmek için yeterli bir görüntü elde etmek üzere alt tabaka taraması ile genişletilmiş prob etkileşimlerini önlemek için hemen üzerine yakınlaştırın.

Ardından yazılımdaki kuvvet paneline geçin, kırmızı konum çubuğunu en yüksek konuma getirin. Kuvvet mesafesini beş mikron olarak ayarlayın. Tarama hızı 0,1 hertz'e ve tetikleme kanalı yok.

Tek bir kuvvet ölçümü yapın ve probun elde edilen grafikten alt tabakaya temas etmediğinden emin olun. Grafik penceresine sağ tıklayın ve sanal sapma çizgisini hesapla'yı seçin. Bu, dikey sapmayı otomatik olarak hesaplayacak ve güncelleyecektir.

Şimdi tetik kanalını saptırmak için değiştirin ve tetik noktasını 20 nanometreye ayarlayın. Kuvvet mesafesini bir mikron olarak ayarlayın. Tarama hızını, bu parçacıkla ilişkili kuvvetlere uygun olarak saniyede 200 nanometreye ayarlayın.

Ardından, ölçümün tamamlanmasının ardından iki ila üç tek kuvvet ölçümünden ilkini gerçekleştirin. Kuvvet paneline gidin ve incele'ye tıklayın. Bir ana kuvvet panelini açmak için, en son kuvvet ölçümünü vurgulayın ve yalnızca eksen başlığı altında işaretli olduğunu kontrol edin.

Ayrıca, x ekseni giriş alanını ayırma mesafesine değiştirin. Ardından grafik yap'a tıklayın. Ana kuvvet panelindeki parametreler sekmesine gidin ve grafiğin temas bölgesi tamamen dikey olana kadar ters optik kol hassasiyetinin değerini ayarlayın.

Masterforce paneline geri dönen değere dikkat edin. Kuvvet sekmesini ve kalibrasyon alt sekmesini açın. Ardından, sapma ters optik kol hassasiyeti için alana ters optik kol hassasiyetinin ters değerini girin.

Ayarlanan parametrelerle değerin önemli ölçüde değişmediğinden emin olmak için kuvvet ölçümünü ve hassasiyet ayarını iki veya üç kez tekrarlayın, sıvı orta seviyesini ve sapmanın stabilitesini kontrol edin. Kuvvet eğrilerinin veya kuvvet haritalarının ölçümleriyle devam edin. Ölçümler tamamlandıktan sonra, probun gerçek hassasiyetini belirleyin.

Sıvı hücreyi substratla birlikte çıkarın ve sıvı hücre ile değiştirin. MICA® veya başka bir sert yüzeyle, MICA'yı aynı sıvı ortama daldırın. Kuvvet eğrisinin uzun bir temas bölgesine sahip olması için nispeten büyük bir sapma kullanarak kolloidal prob ile bir kuvvet ölçümü yaparak devam edin.

Yazılım, temas bölgesinin eğimini kullanarak hassasiyeti belirler. Prob ile elde edilen eğrilerin analizi sırasında yazılımın hesapladığı hassasiyeti kullanın. Bir parçacık substratının bu topografik görüntüsü, floro pentan başına iki H, üç H'de bir kolloidal prob kullanılarak elde edildi.

Görüntü, keskinleştirilmiş bir konik uçla elde edilenlerden daha az tanımlanmıştır. Ancak amaç, parçacıklar arası etkileşimleri değerlendirmek için bir substrat parçacığı bulmaktır. Taramalar, floro başına iki H, üç H'de lipid bazlı parçacıklarla tek bir parçacık kuvveti eşlemesinin yüzeyine daha fazla odaklanabilir.

Pentan, hem numune yüksekliğinin topografik haritalarını hem de her bir kuvvet eğrisinin maksimum kutup kuvvetini ileten bir yapışma haritası sağlayabilir. Her iki ham veri grafiği türü de üç boyutlu gösterimlerde görüntülenebilir. Bunların üst üste bindirilmesi, topografyanın bir fonksiyonu olarak yapışma kuvvetlerinin dağılımının üç boyutlu bir gösterimini üretir.

Bekleme kuvveti ölçümleri, temas mekaniğinin ve temas uzunluğunun yapışma kuvvetleri üzerindeki etkisinin incelenmesine izin verir. Katı lipid parçacıkları kullanıldı ve ölçümler, yapışma kuvvetlerinin zamanın bir fonksiyonu olarak arttığını gösteriyor. Girinti bekletme özelliğini kullanarak, yapıştırıcı bu prosedürü denerken sapma beklemesini kullanarak platoyu zorlar.

En doğru sonuçların elde edilmesini sağlamak için ölçüme başlamadan önce sıvı ortamın dengelenmesi önemlidir.