İzole Mitokondri Akış Sitometrisi ile Dış Zar Proteinleri imüno

Bu prosedürün genel amacı, ER mitokondriyal membranı üzerindeki ilgili proteinleri seçtiğiniz bir antikorla immün olarak etiketlemek ve mitokondriyal fonksiyonla eş zamanlı olarak analiz etmektir. Bu, önce beyin, omurilik veya karaciğer gibi ilgilenilen dokunun bir sıçandan toplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, mitokondriyi dokudan, bu durumda omurilikten izole etmektir.

Omurilik bir dansla homojenize edilir. Homojenizatör ve diğer organeller ve hücre günü artıkları, ham bir mitokondriyal damak elde edilene kadar bir dizi santrifüjleme adımından geçirilir: merkezi sinir dokusunun önemli bir kirleticisi olan miyelin, mitokondriyi bir kez daha %12 opti prep ve santrifüj çözeltisi ile karıştırarak uzaklaştırılır. Daha sonra, izole edilmiş mitokondri, tercih edilen bir birincil antikor ile etiketlenir, ardından bir Fluor'a konjuge edilmiş ikincil bir antikor gelir.

Son adım, mitokondriyal kimliği veya daha doğrusu fonksiyonel parametreleri doğrulamak için floresan boyalar eklemektir. Sonuç olarak, akış sitometrisi, normal fizyoloji veya hastalık boyunca mitokondriyal alto zarlarının nispi bolluğunu göstermek için kullanılır. Bu tekniğin mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, binlerce bireysel mitokondrinin yüksek verimine ve hızlı kantitasyonuna izin vermesidir.

Bu çalışmada kullanılan hayvanlar, Kanada Hayvan Bakım Havası Konseyi tarafından belirtilen ulusal standartları takip eden C-R-C-H-U-M kurumsal Komitesi tarafından onaylanan bir protokole sıkı sıkıya bağlı olarak tedavi edildi. Bu işleme başlamak için, bir sıçandan toplanan bütün sağlam bir omuriliği, beş hacim homojenizasyon tamponu içeren beş mililitrelik bir cam homojenizatöre yerleştirin. Cam homojenizatörü buzun üzerine yerleştirin ve daha büyük doku parçaları kalmayana kadar dokuyu elle homojenize edin, bu da yaklaşık sekiz vuruş sürecektir.

Homojenatı iki veya üç mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 1, 300 kez G'de 10 dakika boyunca dört santigrat derece boyunca santrifüjleyin, ardından S süpernatantını beş mililitrelik bir ultrasantrifüj tüpüne boşaltın. Pelete 750 mikrolitre homojenizasyon tamponu ekleyin ve peleti yavaşça yeniden süspanse edin. Ardından süspansiyonu santrifüjleyin ve peleti yeniden süspanse edin.

Küçük döküntüleri temizlemek için iki kez daha, tüm süpernatantları aynı beş mililitrelik ultrasantrifüj tüpüne çekin ve ardından tüpleri bir ultrasantrifüj rotoruna yerleştirin. Sallanan kovalarla donatılmış, tüpleri 15 dakika dört santigrat derece boyunca 17.000 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjleme tamamlandığında, sitozolik fraksiyon ilgi çekiyorsa, süpernatanı daha sonraki işlemler için saklayın.

Daha sonra, 50 milimolar potasyum klorür santrifüj içeren dört mililitre homojenizasyon tamponunda ham mitokondriyal fraksiyon olan peleti tekrar askıya alın. Sallanan bir kova rotorunda dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 17.000 kez G'de yeniden süspanse edilmiş pelet, daha sonra supinatı atın ve peleti, tam olarak 800 mikrolitre yeniden askıya alınmış peletin tam olarak 800 mikrolitresinde yeni bir beş mililitrelik ultrasantrifüj tüpünde 800 mikrolitre homojenizasyon tamponunda nazikçe yeniden süspanse edin. Daha sonra, %12 iod Dal'lık bir nihai konsantrasyon oluşturmak için yeniden askıya alınmış peletin 800 mikrolitresine 200 mikrolitre iod dal pipetleyin.

Tüpün içeriğini bir P 1000 pipet ile nazikçe ama iyice karıştırın ve daha sonra sallanan bir kova rotorunda dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 17.000 kez G'de santrifüjleyin, tüpün üst kısmındaki miyelin tabakasını aspire edin ve palet gevşek olabileceğinden sırtı dikkatlice atın. Resus, peleti dört mililitre homojenizasyon tamponunda süspanse eder. Ardından, kazancınızı sallanan bir kova rotorunda dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 17.000 kez G'de santrifüjleyin.

Supinate'ı atın ve yeniden canlandırın. Peleti dört mililitre homojenizasyon tamponunda askıya alın. Daha sonra santrifüjlemeyi tekrarlayın ve sırtüstü ajan reus'u çıkarın.

Son peleti 100 ila 200 mikrolitre homojenizasyon tamponunda bükün ve 1,7 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Biyonik asit tahlili veya BCA gibi standart bir protein kantitasyon tahlili kullanarak her numunedeki protein miktarını belirleyin. Numuneleri kantitasyon için hazırlarken, mitokondrinin yeterli çözünmesini sağlamak için numuneleri ve standart eğriyi %2 sodyum sülfat ile seyreltin.

Test edilecek her boyama karışımı için, izole edilmiş mitokondriyi 25 mikrogram pipetleyin 1.7 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpe yerleştirin. Her deneye lekelenmemiş bir numunenin yanı sıra test edilen her antikor için uygun bir izotip kontrolü eklediğinizden emin olun, her numuneyi bir tezgah üstü mikro santrifüjde dört santigrat derecede iki dakika boyunca 17.000 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra supinatı çıkarın ve izole edilmiş mitokondriyi 50 mikrolitre mitokondri tamponunda yeniden süspanse edin.

% 10 yağ asidi içermeyen BSA ile desteklenmiş, çözeltiyi dört santigrat derecede 15 dakika inkübe edin ve daha sonra mililitre çözelti başına 20 mikrogram birincil antikor ekleyin. İzole edilmiş mitokondriyi birincil antikor ile dört santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin, bağlanmamış antikoru yıkayın, her bir numuneyi santrifüjleyin ve sırtüstü natanı atın. Daha sonra, peleti 200 mikrolitre mitokondri tamponunda nazikçe yeniden süspanse edin ve ardından santrifüjleme adımını tekrarlayın, sırtüstü analantı atın ve peleti 50 mikrolitre mitokondri tamponunda yeniden süspanse edin.

Her mililitre numune için 0.5 mikrogram ikincil antikor ekleyin. Daha sonra numuneleri ışıktan koruyarak dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, her bir numuneyi santrifüjleyin ve bağlanmamış ikincil antikoru içeren supinatı atın. Reese.

Peleti 200 mikrolitre mitokondri tamponunda askıya alın ve numuneyi santrifüjleyin. Yine. Sonra supinate ve Reese'i çıkarın. Gözlenen olayların aslında mitokondri olduğundan emin olmak için peleti 500 mikrolitre mitokondri tamponunda askıya alın.

Numuneyi karanlıkta 15 dakika boyunca Vitrojen'den MIT izleyici yeşili gibi mitokondriye özgü bir floresan boya ile boyayın. Diğer fonksiyonel parametreleri araştırmak için daha fazla boyama gerekmiyorsa, etiketli numuneyi bir akış sitometresine yüklemeye uygun bir tüpe aktarın. Numuneleri buz üzerinde tutun ve izole edilmiş mitokondrinin sağlam bir transmembran potansiyeline sahip olduğunu doğrulamak için bir akış sitometresine ilerleyin, mitokondriyi 100 nanomolar tetraetil çubuk domin metil ester ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca karanlıkta boyayın.

Metil ester, izole edilmiş mitokondriyi 100 mikromolar karbonil siyanür m kloro fenol HydroOne varlığında 100 nanomolar tetraetil çubuk domin metil ester ile boyar. Bu kimyasal bir mitokondriyal ayrıştırıcıdır ve izole edilen mitokondrinin süperoksit ürettiğini doğrulamak için mitokondriyi depolarize eder, mitokondriyi mitokondriyal süperoksit üretimi için bir kontrol olarak oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika boyunca Vitrojen'den kırmızı çoraplar gibi uygun bir süperoksit indikatörü ile boyar. İzole edilmiş mitokondride 10 mikromolar antimisin varlığında boya ile kalın.

Bir antimisin A, solunum zincirinin üçüncü kompleksinin bir inhibitörüdür ve edinim başlamadan önce mitokondriyal süperoksit üretimini artıracaktır. Cihazı, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi kurun. Daha sonra tüplere hafifçe vurarak numuneleri karıştırın, ancak girdap yapmayın.

Geçit sırasında ilk olayları düşük bir basınçta toplamaya başlayın. Toplam nüfusu kontrol ettiğinizden emin olun. Ardından, histogramların voltajlarını buna göre ayarlayın.

Boyanmamış numunenin zirvesi genellikle ikinci on yıla karşılık gelir. Daha sonra kapılar kurulduktan ve numuneler işlendikten sonra, basıncı yüksek akışlı sitometriye geçirin. Omurilik preparatlarının analizi, olayların% 94'ünün mitokondri spesifik boya için pozitif olduğunu belirledi.

Bu deneyde, mitokondri pozitif olayların% 30'u, mitokondrinin dış zarının füzyonunda rol oynayan bir protein olan MIT füzyon ikisine özgü bir antikor ile etiketlendi. Tetraetil rumin metil ester kullanılarak mitokondriyal transmembran potansiyelinin analizi, izole edilmiş mitokondrinin %95'inin bozulmamış bir transmembran potansiyeline sahip olduğunu buldu. Bu boyamanın spesifik olduğu gösterilmiştir, çünkü bir mitokondriyal unko varlığında yapıldığında boyamada önemli bir azalma görülmüştür, fonksiyonel mitokondrinin, zar geçirgen bir boya kullanılarak ölçüldüğü gibi bazal miktarda SUP oksit ürettiği bulunmuştur.

Bu, SUP oksit ile floresan P reaksiyonu haline gelir. Mitokondrinin antimisin a ile muamelesi, ustalaştıktan sonra süperoksit üretiminde yaklaşık% 10'luk bir artışa neden olur. Bu teknik, uygun şekilde yapılırsa altı ila yedi saat içinde yapılabilir.