Name: İzole Mitokondri Akış Sitometrisi ile Dış Zar Proteinleri imüno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Öğrenin, izole mitokondri akış sitometrisi ile sıçan omurilik dokusundan dış zar proteinlerini immünoboyama yöntemiyle tespit edin. Bu teknik, mitokondriyal fonksiyon ve protein analizini eşzamanlı olarak sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz sitometresi akış erişimi için Laurie Destroismaisons ve üstün teknik destek için Sarah PEYRARD ve Dr.Alexandre Prat teşekkür ederiz. Biz de hazırlıkları miyelin kaldırılması ile ilgili yaptığı katkılarından dolayı Dr Timothy Miller kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık Araştırması (CIHR) Nöromusküler Araştırma Ortaklığı, Yenilik için Kanada Vakfı, Kanada ALS Derneği, ALS Araştırma Frick Vakfı, CHUM Vakfı ve Fonds de la Recherche en Santé du Québec (CVV) olan Kanada Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Hem CVV ve NA olan Araştırma Âlimler Fonds de la Recherche en Santé du Québec ve CIHR Yeni Müfettişler. SP Kanada ALS Derneği&#39;nin Tim Noël Öğrencilik tarafından desteklenmektedir.

Bu çalışmada kullanılan hayvanların Kanada tarafından belirtildiği gibi ulusal standartlar aşağıdaki Hayvanları Koruma Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) Kurumsal Komitesi tarafından onaylanmış bir protokol (N08001CVsr) sıkı göre tedavi edildi Hayvan Bakım Konseyi (ccac). Bu protokolü (Tablo 1) gerçekleştirmek için gerekli tüm reaktifleri hazırlayın. Ekipman, malzeme ve tedarikçi ile ilgili diğer tüm detayları Malzeme Listesi bulunabilir. <img alt="Tablo 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51887/51887table1.jpg" width="500"> Tablo 1. Tampon bileşimler. Sıçan Omurilik 1. Koleksiyonu <ol><li> Derinden% 4 isofloran ile sıçan (Sprague Dawley) uyuşturan. Th sıkıştığı üzerine refleksi eksikliği ile anestezi doğrulayıne forepaw. Giyotin ile dekapitasyon yoluyla sıçan öldürülür. Ötenazi Bu yöntem omuriliği deforme olabilir başkaları üzerinde tercih edilir. </li><li> Omurga ortaya çıkarmak için arka cilt kesin. Sadece leğen kemiği üzerinde kemik makası ile omuriliğe kesin. Vertebral kolonun açılmasını gözünüzde canlandırın. </li><li> Vertebral kolona, ​​Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile doldurulmuş bir 200 ul pipet ucu (alev biraz üzerinde eriyen yoluyla bağlanmış) ile, bir 10 ml şırınga yerleştirin. </li><li> Pistonun basınç orta tatbik edilmek sureti ile omurilik yıkayın. </li><li> Herhangi bir kan, omurilik mevcut ise, bir sonraki aşamaya geçmeden önce PBS ile yıkayın. NOT: Bu yöntem aynı zamanda beyin ve karaciğer için valide edilmiştir. Bu dokular dahil olmak üzere, durumunda, yarısı kurban sıçandan beyin ve omurilik ağırlıkça eşit bir karaciğer parçası toplar. Diğer tüm adımlar aynıdır kalır. </li></ol> Omurilik Mit 2. izolasyonuochondria (Vande Velde ve ark uyarlanmıştır. 4) <ol><li> 5 hacim (~ 3.25 mi) Homojenleştirme tamponu (HB) ile 5 ml'lik bir cam homojenizatör içinde, bütün dokunulmamış omurilik yeri ve toplayın. İzole mitokondri optimal kurtarma için, buz veya soğuk odada tüm adımları uygulayın. Doku hiçbir büyük parça kalmayıncaya kadar, elle yaklaşık sekiz vuruşları doku homojenize. İki (2 mi) ve üç (1.7 mi) mikrosantrifüj tüplerinde Homojenat yerleştirin. Bir tezgah üstü mikrosantrfuj, 4 ° C'de 10 dakika 1,300 x g santrifüj. </li><li> 5 ml'lik bir ultrasantrifüjdeki tüpüne süpernatant ve yer kurtarın. Pelet içeren mikrosantrifüj tüp 750 ul (~ 0.5 hacimler) HB ekleyin ve hafifçe pelletini. Tekrar santrifüj ve yeniden süspansiyona iki kez daha yineleyin. Havuz yukarıdaki ile aynı 5 ml'lik bir ultra santrifüj tüpüne tüm üst sıvıları (S1a ve S1 B). Bu adım, küçük enkaz kaldırmak için hizmet vermektedir. </li><li> Santrifüj S1 sallanan bir kova çürüklüğü ile donatılmış bir ultrasantrifüjdeki kullanılarak toplandıya da 4 ° C'de 15 dakika boyunca 17,000 x g'de santrifüjleyin. </li><li> Sitosolik parçacık, (Western blot analizi için örneğin) ilgi ise daha sonraki işlemler için bir süpernatan (S2) muhafaza edilmelidir. 4 mi HB + 50 mM KCI pelet (P2) ham mitokondriyal fraksiyonu, yeniden süspanse edin. Bir sallanan kepçeli rotor içinde 4 ° C'de 15 dakika 17,000 x g santrifüj. Süpernatantı atın ve yavaşça 800 ul HB pelet (P3) tekrar süspansiyon. Not: Mitokondri herhangi bir özel olmayan mitokondriyal ilişkili kirleri çıkarmak HB ile + 50 mM KCI ile yıkanmıştır. </li><li> Yeni 5 ml'lik bir ultra santrifüj tüp içinde, süspansiyon haline getirilen tanelere, (P3) tam olarak 800 ul ekleyin. </li><li> Bu tüp, böylece% 12 iyodiksanol bir nihai konsantrasyonu yaratırken, iyodiksanol (yoğunluk gradyan ortamı) 200 ul ilave edin. Yavaşça ancak iyice P1000 ile pipetleme yoluyla tüpün içindekiler karıştırılır. İlk iyodiksanol eklenmesi ve daha sonra tekrar askıda topak (P3) iyice karışmasını kolaylaştırmak için tercih edilir. Bir Ult yılında santrifüj4 ° C'de 15 dakika boyunca 17,000 x g'de bir sallanan kepçeli rotor ile donatılmıştır racentrifuge. </li><li> Not: Karaciğer miyelin içermeyen ve sadece karaciğer işlenirken, bu nedenle, bu adım gerekli değildir. Karaciğer MSS mitokondri ile eş zamanlı olarak, işlenmekte olan, ancak eşit tüm dokularını tedavi etmek için önerilmektedir. </li><li> Tüpün üst miyelin tabakasını aspire ve dikkatli bir şekilde çıkarın ve süpernatantı atın. Pelet gevşek olabilir. 4 ml HB pelletini. Tekrar santrifüj 4 ° C'de 10 dakika boyunca 17,000 x g'de. Süpernatantı atın ve 4 ml HB pelletini. Santrifüj tekrarlayın ve süpernatant kaldırmak. </li><li> 100-200 ul HB nihai pelet (P7) tekrar ve bir 1.7 ml mikrosantrifüj tüp transfer. Bu örnek izole mitokondri içerir. </li><li> Protein miktar tayini geçin. Mitokondri pahalı ne yeterli çözülmesini sağlamak için örnekler ve% 2 sodyum dodesil sülfat (SDS) standart eğri seyreltinng protein ölçümü. </li></ol> Akış Sitometrinin için İzole Mitokondri 3. ile immün <ol><li> Her boyama karışımı test edilebilmesi için, pipet 1,7 ml mikrosantrifüj tüp içine izole mitokondri 25 mcg. Her deneyde bir boyanmamış örnek sayılabilir; ve her bir antikor için, uygun izotip kontrolü için bir örnek eklemeyi unutmayın. </li><li> Bir tezgah üstü mikrosantrifüj 4 ° C'de 2 dakika boyunca 17,000 x g'de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı ve 4 ° C (bloke etme adımı) 'de 15 dakika boyunca% 10-yağ asitsiz BSA ile takviye edilmiş 50 ul mitokondri tamponu (Tampon E) olarak izole mitokondri tekrar süspansiyon. Not: etiketleme sırasında, 4 ° C'de bir buzdolabı içinde inkubasyon gerçekleştirmek. </li><li> Tüpüne birincil antikor (tavşan anti-Mfn2, ml başına 20 ug) ilave edildi ve 4 ° C'de 30 dakika inkübe edilir. NOT: titrasyonu ile ampirik olarak her antikor optimal konsantrasyonunu belirleyin. Nedeniyle konsantrasyon ve / veya p değişkenliğeurity, aynı üreticinin aynı antikorun farklı partiler, farklı sonuçlara yol açabilir; Dolayısıyla antikor titrasyonu her yeni lot için gereklidir. </li><li> Bağlanmamış birinci antikorları yıkayın: Santrifüj 17,000 x g'de 2 dakika süre ile 4 ° C 'de. Süpernatantı ve yavaşça 200 ul M Tampon pelletini. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 17,000 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı ve 50 ul M Tampon pelletini. </li><li> Tüpüne ikincil antikoru (Eşek anti-tavşan IgG Fikoeritrin (PE), ml başına 0.5 ug) ilave edilir ve ışıksız bir ortamda 4 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe örnekleri. </li><li> Bağlanmamış ikinci antikorları yıkayın: Santrifüj 17,000 x g'de 2 dakika süre ile 4 ° C 'de. Süpernatantı ve 200 ul M Tampon pelletini. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 17,000 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı ve 500 ul M Tampon pelletini. </li><li> Olaylar aslında mitokondri içinde emin olmak için, bir ile leke izole mitokondriışıksız bir ortamda oda sıcaklığında 15 dakika boyunca mitokondri özel floresan boya. Diğer fonksiyonel parametreler (mitokondriyal transmembran potansiyeli veya süperoksit üretimi) boyama isteniyorsa, değilse, edinimi için 5. adıma 4. adıma geçin. NOT: Bu ikincil antikor emisyon spektrumu fonksiyonel boyaların olduğu ile uyumlu olduğunu doğrulamak için önemlidir. (: Örnek 650 nm / Em 660 nm APC), örneğin, tetrametilrodamin metil ester (TMRM) FITC ve zar potansiyeline benzer spektral özelliklere sahip ticari bir boya ile mitokondriyal saflık doğrulanması durumunda, uygun bir ikincil antikor alofikosiyanin olacaktır. Tazminatlar kontrolleri ekleyin, yani bir örnek immunolabeled veya uygulanabilir olduğunda tek bir floroforla ile boyandı. </li><li> Sitometresiyle yükleme akışı için uygun bir tüp aktarın. (. Küçük örneklem büyüklüğü bir mikro tüp ml'lik bir tüp akış sitometresini 3 içine yerleştirilir kolaylaştırmak için) buz üzerinde örnekleri tutun ve hemen devamedinimi için akış sitometresi. </li></ol> 4. Assaying Mitokondriyal Transmemebran Potansiyeli ve Sitometrisi ile Mitokondriyal süperoksit Üretimi <ol><li> Izole edilmiş mitokondri ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 15 dakika boyunca aşama 3.8 ile 100 nM TMRM (Örnek 548 nm / Em 574 nm): 5 ile lekeleme ile bir dokunulmamış zar potansiyeline sahip olduğundan emin olun. Örnekler ve popülasyonlar, TMRM (1-30 nM) 'nin alt / olmayan söndürme konsantrasyonlarının kullanımı arasındaki zar potansiyeli Karşılaştırma için, 6 daha uygun olabilir. <ol><li> TMRM boyama, 100 uM karbonil siyanit m-kloro fenil hidrazin (CCCP) varlığında 100 nM TMRM boyanan izole mitokondri, mitokondri depolarize bir mitokondriyal uncoupler için bir kontrol olarak. Boyanın daha düşük konsantrasyonlar kullanıldığı takdirde mitokondri depolarize için gerekli CCCP konsantrasyonu daha az olabilir. </li></ol></li><li> İzole mitokondri st tarafından mitokondriyal süperoksit üretmek doğrulayınışıksız bir ortamda oda sıcaklığında 15 dakika boyunca, aynı zamanda adım 3.8 değerinde, uygun bir mitokondriyal süperoksit gösterge 7, geri kalan. <ol><li> Mitokondriyal süperoksit üretimi, 10 uM Antimycin A, mitokondriyal süperoksit üretimini artıracak solunum zinciri kompleksi III bir inhibitörün mevcudiyetinde boya ile leke izole mitokondri için bir kontrol olarak. </li></ol></li></ol> Sitometrisi ile kondriyayı İzole immunolabeled 5. Toplama ve Analiz <ol><li> Enstrüman kurmak: doğrusal geçiş gerilimleri izole mitokondri ve set gerilimlerin analizi kolaylaştırmak için log modu için (FSC: 450; SSC: 250). Olaylar FSC-A (alan) modu yanı sıra FSC-W (genişlik) ve FSC-H (yükseklik) toplanan emin olun, ikilileri (dışlamak mümkün yani, aynı zamanda dedektör geçen iki olay, ) analizi sonrası veri toplama. Olayların Set sayısı 100,000 ile tahsil edilecek. Tazminat kontrolleri EdinmeVarsa. </li><li> Veri toplama: veri toplama önce numune vorteks kaçının. Bunun yerine hafifçe tüp dokunarak karıştırın. Başlangıçta gating sırasında düşük bir basınçta olay toplamak. Toplam nüfus Kapısı. , Buna göre histogramlarının gerilimler ayarlayın genellikle boyanmamış numunenin tepe ikinci on (10 2) karşılık gelir. Kapılar kurulmuş, ve örnekler işleniyor sonra, basıncı yüksek geçirilebilir. </li><li> Analiz: FSC-W FSC karşı komplo tarafından ikilileri gözünüzde canlandırın. Singletlerini ve ikilileri tanımlayın. Singletlerin üzerinde Kapısı. Mitokondriyal-selektif boya ile pozitif boyandı olaylar kapılayarak mitokondriyal nüfusu seçin. </li><li> Izotop kontrolden plan etiketleme belirleyin. Izotip kontrol örneği kullanarak, Mfn2 antikor için pozitif popülasyon mitokondriyal etiketleme yüzdesini belirlemek. </li></ol>

<ol><li>Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics in neurodegeneration.</a> Trends Cell Biol. 23, 64-71 (2013).</li>
<li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).</li>
<li>Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+intracellular+organelle+function+using+fluorescent+probes%3A+from+animalcules+to+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots.</a> Circ Res. 95, 239-252 (2004).</li>
<li>Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).</li>
<li>Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+five+dimensions%3A+time-dependent+membrane+potentials+in+individual+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria.</a> Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50, 98-115 (2011).</li>
<li>Xu, X., Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+determination+of+superoxide+release+at+both+sides+of+the+mitochondrial+inner+membrane+by+capillary+electrophoretic+analysis+of+the+oxidation+products+of+triphenylphosphonium+hydroethidine%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine.</a> Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).</li>
<li>Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+function+and+regulation+of+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">New insights into the function and regulation of mitochondrial fission.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).</li>
<li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456, 605-610 (2008).</li>
<li>Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+mitochondrial+heterogeneity+tell+us+about+mitochondrial+dynamics+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy.</a> Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).</li>
<li>Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H. Jr, Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+damage+revealed+by+immunoselection+for+ALS-linked+misfolded+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1.</a> Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).</li>
<li>Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dynamin-related+protein+1%2C+a+mediator+of+mitochondrial+fission%2C+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis.</a> Dev Cell. 1, 515-525 (2001).</li>
<li>West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li>
<li>Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalhães, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+pH+monitored+by+a+new+engineered+green+fluorescent+protein+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant.</a> J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).</li>
<li>Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).</li>
<li>Tantama, M., Martinez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4, 2550(2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu mitokondri normal fizyoloji ve hastalık hem de kilit oyuncular olduğu giderek açıktır. Imünoblotting, belli bir durumda mitokondri içinde veya mitokondriyal yüzeyinde tüm nüfusun ortalama bu yöntem raporlar bulundu hangi proteinlerdir çıkarabilirler. Bu yöntem mitokondriyal alt popülasyonlarının veya altkümelerin göreceli bolluk hakkında bilgi elde edemez. O olmuştur iken daha önce tüm mitokondri eşit, alan giderek bir hücre içinde bu mitokondri kabulüdür oluşturulan morfolojisi ve / veya fonksiyon 10 açıs...

Mitokondri, yüksek enerji talebinin sitelerine taşınan ve fizyolojik uyaranlara 1 hızla yanıt olan, fizyon ve füzyon birden fazla tur geçmesi son derece dinamik organellerdir. Giderek farklı dokularda olduğu mitokondri kabul edildiğinden, hatta farklı hücre bölmeleri, yeni yöntemler bu farklı mitokondriyal alt kümelerini tanımlamak için gerekli olan, farklı fonksiyonel profilleri var. Mikroskopi bireysel mitokondri görselleştirilebilir sağlayan bir aracı ve bağışıklık 2 ile belirlenebilir veya mitokondrilerde bir proteinin varlığını içerir. Bununla birlikte, bu yöntem ile kantitatif analiz, emek yoğun ve ölümsüzleştirilmiş veya primer hücre çizgileri kullanılarak deneyler için daha uygundur. Dokusundan türetilen bireysel mitokondri çalışması çok daha zordur ve çok yöntem ile aynı zamanda mitokondriyal değerlendirmeleri mevcuttur alt gruplarının kolay tanımlama için izin vermezmitokondriyal fonksiyon 3 tirme. Bu engel, akış sitometrisi ile kemirgen dokulardan izole edildi ve daha sonra analiz mitokondri immunolabel için yeni bir metot gidermek amacıyla geliştirilmiştir. Bu, hızlı bir şekilde saptanması ve mikroskobik inceleme ile karşılaştırıldığında mitokondriyal dış membran, lokalize proteinler ölçülmesini sağlar, daha az emek yoğun ve tek bir numunede bulunan mitokondri binlerce analiz edilmesini sağlar. Bu deney, mitokondri de yapısal olarak mevcut olduğu düşünülmektedir mitokondriyal dış zar proteinlerinin &#39;nin ve nispi miktarını izlemek için uygulanabilir, mitokondriyal yüzeyine proteinler işe ya da patolojik koşulların mitokondrilere mislocalized proteinlerin tespiti. Ayrıca, geleneksel floresan gösterge boyaların kuruluş farklı mitokondriyal mitokondriyal fonksiyonun bazı yönlerinin aynı anda değerlendirilmesini sağlarsubpopülasyonunun.

<table><tbody><tr><td>Sıçanlar:</td><td>Charles Nehri</td><td>Suş kodu 400</td><td>Yetişkin (9 haftadan 18 haftaya kadar) erkek veya dişi sıçanlar izolasyon protokolü için kullanılabilir. Sıçanların ağırlığı cinsiyete ve yaşa bağlıdır (erkekler 300 ila 500 g arasında ve dişiler 200 ila 350 g arasında) tipik olarak kullanılır.</td></tr><tr><td>Dounce homojenizatör</td><td>Kontes Glass Co.&nbsp;</td><td>885450-0022</td><td>Duall 22</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Termo Bilimsel</td><td></td><td>Sorvall Legend Micro 17 R</td></tr><tr><td>Ultra Şeffaf Ultrasantrifüj tüpleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td>Şeffaf, ince duvarlı&nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Ultrasantrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Sorvall WX UltraSeries</td></tr><tr><td>AH-650 rotor ve kovaları&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-prep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114542</td><td>İodiksanol, yoğunluk gradyan ortamı</td></tr><tr><td>Yağ asidi içermez Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma</td><td>A8806</td><td>Mitokondri için yağ asidi içermez</td></tr><tr><td>Sodyum süksinat dibazik hekzahidrat&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9637</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-Mitofusin2 antikoru</td><td>Sigma</td><td>M6319</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan IgG</td><td>Jackson İmmün Araştırmaları&nbsp;</td><td>011-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tavşan IgG PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4739-81</td><td></td></tr><tr><td>Mikro titre tüpü</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9391</td><td>Akış sitometrisi ile numune alımı için;</td></tr><tr><td>MitoTrackerGreen (MTG)</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td>100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm</td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T668</td><td>100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm</td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Red</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td>5 & mikro; M: Ex 540 nm/Em 600 nm</td></tr><tr><td>Antimisin A</td><td>Sigma</td><td>A8874</td><td></td></tr><tr><td>LSR II akış sitometresi</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Yazılımı</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>TreeStar Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Analiz için kullanılan yazılım</td></tr><tr><td>BCA protein test kiti&nbsp; &nbsp;</td><td>Pierce/Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Bradford testi, yüksek SDS konsantrasyonları ile uyumlu olmadığı için önerilmez</td></tr></tbody></table>

İzole mitokondri akış sitometrisi ile dış zar proteinleri imüno

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Yöntem algılamak ve hayvansal dokular mitokondriyal fizyolojisi ve patofizyolojisi çalışma için hayati olan mitokondriyal dış membran proteini bileşenleri izlemek için. Bu protokol kemirgen dokusundan izole mitokondri immunolabeled ve flow sitometri ile analiz edilir bir yöntem açıklanır. Mitokondri kemirgen omurilik izole edildi ve miyelin, sinir dokusundan hazırlanan mitokondriyal parçaların büyük bir kirletici maddeyi bertaraf edilmesi için hızlı bir zenginleştirme adımına tabi tutulurlar. İzole mitokondri daha sonra tercih edilen bir antikoru ve bir floresan konjuge sekonder antikor ile etiketlenir. Akış sitometrisi ile analiz, algılama ve imüno-işaretli protein miktarının ölçülmesi ile takip mitokondriyal belirli bir boya ile boyanması ile mitokondriyal preparatların saflığı göreli doğrular. Bu teknik, numune başına mitokondri yüzbinlerce analizine izin veren, hızlı ölçülebilir ve yüksek verimli olduğunu. Bu yeni p değerlendirmek için geçerlidirNormal fizyolojik şartlar altında mitokondrial yüzeyinde roteinler gibi patoloji sırasında bu organele mislocalized olabilir proteinleri. Önemli olarak, bu yöntem, alt-popülasyonlarının mitokondriyal bazı etkinlikler rapor floresan göstergesi boyalar ile birleştirilebilir ve merkezi sinir sistemi (beyin ve omurilik) yanı sıra karaciğer, mitokondri için mümkün olduğunu edilebilir.

Sıçan omurilik türetilen mitokondri Mitofusin2 (Mfn2), mitokondri 8 dış membran füzyon rol oynayan bir protein hedefli bir antikor ile imüno edilebilir. Bir Mfn2 spesifik antikor ve bir floresan konjuge sekonder antikor ile izole edilmesini ve ardından etiketleme, mitokondri akış sitometrisi (Şekil 1) tarafından işlenir. Veri toplama sonra, numuneler ilk olarak, bir nokta arsa (Şekil 2A) ilgili toplanan tüm olayları görselleştirerek, analiz yazılımı akış sitometri ile analiz ...

Burada açıklanan tespit ve akış sitometrisi ile analiz kemirgen doku ve izole mitokondri immün ile mitokondriyal dış membran proteinleri ölçmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, mitokondriyal alt popülasyonlarının fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için genişletilebilir.

İzole Mitokondri Akış Sitometrisi ile Dış Zar Proteinleri imüno

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Bu prosedürün genel amacı, ER mitokondriyal membranı üzerindeki ilgili proteinleri seçtiğiniz bir antikorla immün olarak etiketlemek ve mitokondriyal fonksiyonla eş zamanlı olarak analiz etmektir. Bu, önce beyin, omurilik veya karaciğer gibi ilgilenilen dokunun bir sıçandan toplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, mitokondriyi dokudan, bu durumda omurilikten izole etmektir.Omurilik bir dansla homojenize edilir. Homojenizatör ve diğer organeller ve hücre günü artıkları, ham bir mitokondriyal damak elde edilene kadar bir dizi santrifüjleme adımından geçirilir: merkezi sinir dokusunun önemli bir kirleticisi olan miyelin, mitokondriyi bir kez daha %12 opti prep ve santrifüj çözeltisi ile karıştırarak uzaklaştırılır. Daha sonra, izole edilmiş mitokondri, tercih edilen bir birincil antikor ile etiketlenir, ardından bir Fluor'a konjuge edilmiş ikincil bir antikor gelir.Son adım, mitokondriyal kimliği veya daha doğrusu fonksiyonel parametreleri doğrulamak için floresan boyalar eklemektir. Sonuç olarak, akış sitometrisi, normal fizyoloji veya hastalık boyunca mitokondriyal alto zarlarının nispi bolluğunu göstermek için kullanılır. Bu tekniğin mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre en bü

immunodetection-outer-membrane-proteins-flow-cytometry-isolated

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, nöronal hücrelerin mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri, mitokondriyal DNA ile ilişkili protein ve mitokondriyal dış zar proteini için antikorlarla etiketlenmesini ve ardından seviyelerini ölçmek için akış sitometrisini göstermektedir.

Nöronlarda Çoklu Mitokondriyal Parametrelerin Flow Sitometri Kullanılarak Ölçülmesi

Örnekler arasındaki mitokondriyal membran potansiyelinin karşılaştırılması, hücresel durum hakkında değerli bilgiler verir. Mitokondriyi izole etmek ve floresan kullanarak inhibitörlere ve ayrıştırıcılara yanıtı değerlendirmek için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır. Bu protokolün yöntemi ve faydası, bir hücre kültürü ve hücresel stresin hayvan modeli kullanılarak gösterilmiştir.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Burada, hipoksi/reoxygenation veya koruyucu bir ajan olmadan maruz sonra hücreleri mitokondrial membran potansiyelini değerlendirmek için Dizayn Merkezi-1 boya kullanan bir iletişim kuralı mevcut.

Kardiyak miyositler mitokondrial membran potansiyeli hipoksi/Reoxygenation sonra ölçmek için akış sitometresi tabanlı tahlil

Mitophagy, mitokondri, seçici bozulması mitokondrial homeostazı karıştığı ve çeşitli insan hastalıklarda deregüle. Ancak, mitophagy etkinliğini ölçmek için uygun deneysel yöntemleri çok sınırlıdır. Burada, biz hassas bir tahlil akış sitometresi kullanarak mitophagy etkinliğini ölçmek için sağlar.

Hassas ölçüm Mitophagy floresan muhabir akış sitometresi kullanarak pH bağımlı mt-Keima tarafından

Bu makalede mitokondri veya canlı hücrelerde organellerin ölçmek için güçlü bir yöntem gösterilmektedir. Primer hücre kullanarak doku örnekleri, hasat gibi karma hücre nüfus bu organelleri miktar lysosome veya mitokondri özel boyalar yüzey işaretleyicileri karşı fluorescently konjuge antikorlar ile kombinasyonu sağlar çok renkli akış sitometresi.

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

Bu makalede, her iki S. cerevisiae ve HEK293T hücrelerinde protein kendinden montajı ölçmek için fret tabanlı akış sitometri Protokolü açıklanır.

Algılama ve ölçme protein Self-montaj In vivo tarafından akış sitometri

Xenobiotic "effluks" pompalar son derece hematopoetik kök ve progenitör hücreleri (hspcs) ve neden ekstrüzyon TMRM, bir mitokondriyal membran potansiyel floresan boya aktif. Burada, bir "effluks" pompa inhibitörü verapamil varlığında TMRM tarafından hspcs 'de mitokondriyal membran potansiyelini doğru ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Efflux pompaları Inhibisyonu Ile hematopoetik kök ve progenitor hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin akış Cytometrik değerlendirilmesi doğruluğu iyileştirilmesi

Proteom ölçeğinde protein keşfi ve nicelleştirmesi ile uyumlu yüksek kaliteli mitokondri izolasyonu için iki aşamalı bir protokol sunuyoruz. Protokolümüz genetik mühendisliği gerektirmez ve bu nedenle herhangi bir birincil hücre ve dokudan mitokondri incelemek için uygundur.

Gelişmiş protein keşfi ve nicelleştirme için mitokondrinin iki aşamalı etiketsiz izolasyonu

Mitokondriyal temas bölgeleri, mitokondriyal iç ve dış zar proteinleri ile etkileşime giren protein kompleksleridir. Bu bölgeler, mitokondriyal membranlar arasındaki ve dolayısıyla sitozol ile mitokondriyal matris arasındaki iletişim için gereklidir. Burada, bu spesifik protein sınıfına uygun adayları belirlemek için bir yöntem açıklıyoruz.

Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Burada lipidik mesophases membran proteinlerinin kristalizasyon denemeleri elle kurmak için Caffrey Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu uygulanan prosedür açıklanmıştır.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

Öğrenin, izole mitokondri akış sitometrisi ile sıçan omurilik dokusundan dış zar proteinlerini immünoboyama yöntemiyle tespit edin. Bu teknik, mitokondriyal fonksiyon ve protein analizini eşzamanlı olarak sağlar.

İzole Mitokondri Akış Sitometrisi ile Dış Zar Proteinleri imüno

Daha fazla video keşfet