Name: Transgenik Üretimi Hydra: Mikroenjeksiyon yolu ile embriyo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Öğrenin Hydra embriyolarına mikroenjeksiyon yoluyla transgenik hat üretimini. Bu yöntem, gen fonksiyonu ve gelişimsel süreçleri incelemek için kararlı transgenik hatlar oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma RESCEJ için HL için G. Harold &amp; Leila Y. Mathers Ödülü ve bir NIH hibe (R24 GM080527) tarafından NRSA Doktora Sonrası Araştırmacı (NIH F32GM9037222) idi desteklenen ve şu anda Ulusal bir mentored Araştırmacı Geliştirme Ödülü tarafından desteklenmektedir Yaşlanma Enstitüsü (K01AG04435). Biz yorumları için teşekkür etmek istiyorum.

Plazmit DNA, iğneler ve enjeksiyon Züccaciye 1. Hazırlık <ol><li> Yüksek Hızlı Maxi Midi Kiti kullanılarak plazmit DNA&#39;nın hazırlanması ve mi etanol çökeltmesi / 2.5 mg DNA konsantre edilir. DNA pelleti, nükleaz içermeyen, deiyonize su içinde çözündürülmelidir. -20 ° C de 10-20 ul alikolar içinde DNA saklayın. (Mevcut vektörlerin listesi için Ek Tablo 1&#39;e bakınız) </li><li> 100 x 15 mm Petri kabı embriyolar tutulması için bir oluk oluşturmak için agaroz kullanılarak bir enjeksiyon çanak yapın. <ol><li> Bir açıda, 100 x 15 mm Petri kabı içine, bir 75 x 50 cam mikroskop slayt yerleştirin. Agaroz Petri kabı içine 24 Nem ortamında erimiş% 2 arasında, yaklaşık 50 ml dökün. Alternatif olarak, ilk çanak içine agaroz dökün ve üstüne bir &quot;Mikroenjeksiyon balık Kalıp&quot; yüzer. </li><li> Agaroz katılaşmış sonra, cam slayt veya kalıp çıkarın. Bir cam slayt, kullanılmış ise, bir traş makinesi ile fazla bla agaroz kesilmişde bir duvar oluşturur. Çanak içine Hydra orta dökün ve hemen kullanmaya veya gerekli olana kadar 4 ° C sıcaklıkta saklayın. Not: kullanımlar arasında 4 ° C&#39;de saklandığında Enjeksiyon yemekleri tekrar edilebilir. </li></ol></li><li> 75, çekme, 525 ısı hız 100, zaman onlar böyle bir Petri kabındaki kil dar bir şerit içine basarak 50. Mağaza iğneler: aşağıdaki koşullar kullanılarak mikropipet çektirmenin bir filamanın borosilikat cam kılcal damarlardan iğne çekin tabağın tabanına paralel tutulur. </li><li> , Enjeksiyon çözeltisinin hazırlanması% 10 fenol kırmızısı, 2 ul 2.5 mg / ml plazma DNA solüsyonuna 3 ul birleştirmek için. Vorteks ve solüsyon kısa bir süre sonra iğne tıkanmasına neden olabilecek parçacıkların ayrılması için bir mikrosantrifüj içinde en yüksek hızda 10 dakika için dönmeye. </li><li> Bir mikroskop altında küçük bir açıklık oluşturmak için forseps ile iğneyi ucundan birkaç milimetre klibi. Not: açık olan uygun boyutta bir esneklik vardırBasınç bu farklılaşmanın Adım 3.3 &#39;de de ayarlanabilir ing. </li><li> Bu uç aşağı dikey bir pozisyonda iğne tutma şekilde Petri tabağına yerleştirin. İğnenin arka ucuna sıvı pipetleme enjeksiyon çözeltisi, yaklaşık 0.5 ul iğne yerleştirin. Kılcal iğnenin ucu içine çözeltinin çekmeye izin verir. </li></ol> Enjeksiyon için Embriyolar 2. Hazırlık <ol><li> Bir günlük bazda yumurta üreten poliplerin Hydra AEP gerginlik kültürünü tarayın. Bu polipler toplayın ve ayrı bir kültür çanak bunları bir kenara koyun. Yumurta oluşumu ilerlemesini izlemek için gün boyunca bu poliplerinde birkaç saatte gözlemleyin. Yumurta ektoderm kırmaya ve geri ektodermal hücrelerin bir halka üzerinde oturup onlar enjeksiyon 25 için hazır. Döllenme için izin vermek için enjeksiyon için en az 1 saat boyunca testisler sahip olan birden fazla Hydra bir tabak, bu poliplerin yerleştirin. Hydra &lt;/ Em&gt; erkekler herhangi bir özel manipülasyon olmadan sperm yayınlayacak. </li><li> Kadın, yaklaşık 400 mikron çapında 25 veya 1- 8 hücreli aşamada embriyo için vardır tam oluşmuş yumurta ile AEP koloni bulunursa, ayrıca enjeksiyon için bu toplamak. Hemen yarma başladı embriyolar enjekte. Not: Bu tam oluşmuş yumurta ve tek hücreli zigot arasındaki farkı söylemek mümkün değildir, dolayısıyla bu enjeksiyon öncesinde erkek ile inkübe edilmelidir. </li><li> Enjeksiyondan önce, bir # 15 bıçak ile bir neşter kullanılarak embriyo altında ve üstünde ebeveyn dokusunun en çıkarmak. Ekli vücut sütunun küçük bir parça, sadece embriyo bırakın gerekirse forseps ile embriyo işlemek için kullanılacak. Not: yeniden uzağa embriyo disseke ve kadın Hydra kolonisinde kalmasını sağlamak için kaydedilmesi gerekir doku. </li><li> Pasteur pipeti kullanarak, bunları duvarına paralel düzenlenmesi, enjeksiyon çanak embriyoları taşımakagaroz yalak. </li></ol> Plasmid DNA 3. Mikroenjeksiyon <ol><li> Bir demir plaka üzerinde oturur bir manyetik stand mikropüskürtücüden monte edin. Bir joystick micromanipulator üzerinde, iğne tutan mikropüskürtücünün parçası enjeksiyon tutucu, montaj. Manyetik bir stand ile, demir plaka joystick manipülatör monte edin. Inceleyici bir mikroskobun sağ tarafındaki tüm bu kurulum yerleştirin ve bu gözlem alanında görülebilir, böylece enjeksiyon tutucu yerleştirin. </li><li> Agaroz oluğun dikey duvar sola olduğu gibi dönük mikroskop altında embriyoları ile, enjeksiyon çanak yerleştirin. Enjeksiyon tutucu içine iğne takın ve çanak Hydra ortama iğne ucu indirin. </li><li> Mineral yağ iğne ve enjeksiyon çözeltisinin bir akışı üst doldurana kadar yavaşça Hydr içine iğne çıkan görülmektedir saat yönünde şırınganın düğmeyi çevirinbir ortamdır. Akışı çok güçlü ise, saat yönünün düğmeyi çevirerek basıncını düşürebilir. Rutin olarak (iğne 1.5 adım kırpılan nasıl yani,), iğne açıklık boyutuna bağlıdır uygun bir basınç elde etmek için bu işlemini gerçekleştirmek. Not: akışı çok güçlü ise, embriyo enjeksiyon hayatta olmaz. </li><li> Mikroskop aracılığıyla görüntülerken, ilk embriyo alanının merkezinde olacak şekilde enjeksiyon çanağı. O embriyoyu değecek şekilde iğneyi hareket ettirin. Iğne ile embriyo delmek için mikromanipülatör kullanın. Not: Agaroz teknenin dikey duvar iğne tarafından kenara itilmesini embriyo devam edecektir. </li><li> Enjeksiyon çözüm embriyo 1 veya 2 saniye akmasına ve sonra hızlı bir şekilde iğneyi çıkarmak için izin verin. Embriyo birden fazla hücre varsa, her bir hücre enjekte edilir. Iğne ucu ile bir sonraki hücreyi hizalamak için embriyo yeniden yönlendirmek için forseps kullanır. </li><li> İlk Embry sonrao sonraki embriyo enjeksiyon pozisyonda olacak şekilde çanağı ve prosedürü tekrar enjekte edilir; Tüm embriyolar enjekte edilene kadar devam eder. </li></ol> 4. ekimi ve Embriyolar Kuluçka <ol><li> Testisleri var birkaç Hydra ile bir çanak içine enjekte edilen embriyoların tüm taşıyın (bu tüm embriyolar döllenmiş olmasını sağlamak için). Onlar embriyojenezinin devam ederken, bir 18 ° C inkübatör embriyolar kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Kütikül aşama ulaşıldığında, Hidra ortam ile doldurulmuş bir 24-çukurlu plaka tek bir kuyusuna enjekte her embriyo hareket. </li><li> 18 ° C&#39;de karanlıkta 2 hafta içinde enjekte edilen embriyolar inkübe edin. </li><li> 2 haftalık kuluçka döneminden sonra, mikroskop altında her embriyo enjekte edin. Manikür-embriyo ebeveyn doku küçük bir parça kopmuş ve ebeveyn doku rejenere olduğu herhangi bir olgu unutmayın. O mi değil mi ki hemen bu rejenere polip çıkarmakYeni bir yavru için staken. </li><li> RT&#39;de bir akvaryum ışığı altında enjekte edilen embriyoların çanağı hareket. Her gün plakaları kontrol ve yavru toplamak. Hydra poliplerin tipik pembe renk yedikleri Artemia geliyor çünkü yeni yavru beyaz olacaktır. </li><li> Transgen ekspresyonunu tespit etmek için flöresanlı bir mikroskop altında yavru dikkate alınmalıdır. </li></ol>

<ol><li>Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Hydra+allow+in+vivo+tracking+of+individual+stem+cells+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).</li>
<li>Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Hydra.</a> Curr Biol. 20, 964-965 (2010).</li>
<li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+epithelial+cell+cycling+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern of epithelial cell cycling in hydra.</a> Dev Biol. 148, 602-611 (1991).</li>
<li>Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+pathways+of+ectodermal+epithelial+cells+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra.</a> Differentiation. 35, 181-189 (1987).</li>
<li>Khalturin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+stem+cells+in+Hydra+reveal+an+early+evolutionary+origin+for+key+elements+controlling+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation.</a> Dev Biol. 309, 32-44 (2007).</li>
<li>Bosch, T., David, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+of+Hydra+magnipapillata+can+differentiate+into+somatic+cells+and+germ+line+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells.</a> Dev Biol. 121, 182-191 (1987).</li>
<li>David, C. N., Murphy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+interstitial+stem+cells+in+hydra+by+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning.</a> Dev Biol. 58, 372-383 (1977).</li>
<li>Chapman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+genome+of+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamic genome of Hydra.</a> Nature. 464, 592-596 (2010).</li>
<li>Boehm, A. M., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+multipotent+interstitial+stem+cells+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Zoology+%28Jena%29%22%5BJournal%5D)">Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra.</a> Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).</li>
<li>Glauber, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+molecule+screen+identifies+a+novel+compound+that+induces+a+homeotic+transformation+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra.</a> Development. 140, 4788-4796 (2013).</li>
<li>Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+complexity+in+the+basal+metazoan+Hydra+is+maintained+by+both+stem+cell+based+mechanisms+and+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation.</a> Dev Biol. 313, 13-24 (2008).</li>
<li>Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+epithelial+cell+shape+in+response+to+upstream+signals%3A+a+whole-organism+study+using+transgenic+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Zoology+%28Jena%29%22%5BJournal%5D)">Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra.</a> Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).</li>
<li>Hemmrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+the+three+stem+cell+lineages+in+Hydra+and+the+emergence+of+stem+cell+function+at+the+base+of+multicellularity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity.</a> Mol Biol Evol. , (2012).</li>
<li>Juliano, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIWI+proteins+and+PIWI-interacting+RNAs+function+in+Hydra+somatic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).</li>
<li>Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cells+and+sex+determination+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cells and sex determination in Hydra.</a> Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).</li>
<li>Milde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+taxonomically+restricted+genes+in+a+phylum-restricted+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type.</a> Genome Biol. 10, 8(2009).</li>
<li>Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulatory+and+repressive+inputs+localize+Hydra+Wnt3+to+the+head+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).</li>
<li>Gee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-catenin+plays+a+central+role+in+setting+up+the+head+organizer+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra.</a> Dev Biol. 340, 116-124 (2010).</li>
<li>Fraune, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+an+early+branching+metazoan%2C+bacterial+colonization+of+the+embryo+is+controlled+by+maternal+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).</li>
<li>Bridge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+and+stress+responses+in+the+cnidarian+Hydra+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris.</a> PLoS One. 5, e11686(2010).</li>
<li>Boehm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+is+a+critical+regulator+of+stem+cell+maintenance+in+immortal+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).</li>
<li>Franzenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyD88-deficient+Hydra+reveal+an+ancient+function+of+TLR+signaling+in+sensing+bacterial+colonizers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).</li>
<li>Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+a+horizontally+transferred+gene+into+an+operon+during+cnidarian+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution.</a> PLoS One. 7, e31643(2012).</li>
<li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 4 29-34 (1983).</li>
<li>Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+development+in+Hydra+involves+selection+from+competent+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells.</a> Dev Biol. 224, 326-338 (2000).</li>
<li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 8 53-62 (1983).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

Hydra rutin üretir asexually, ancak üreten garnetleri başlamak için çevresel uyaranlara gerektirir. Bu uyaranlar çoğu Hydra türler için iyi tanımlanmış değildir ve zorlanma zorlanma farklı olabilir. Cinsel olmak Hydra uyarılması için bir laboratuvar ortamında zor olabilir çünkü, transgenik Hydra üretimi için önemli bir engel düzenli olarak embriyolar elde etmektir. AEP 25 suşu, ancak, laboratuarda kolayca gamet üretir ve bu defa transgenik line&#39;lar yapmak için kullanılm...

Hydra rejenerasyon, desen oluşumunu incelemek ve yaklaşık 250 yıl 2 kök hücre için kullanılır olmuştur Hydra üç hücre soylarının oluşan basit vücut planı vardır:. Ektodermal epitel, endodermal epitel ve interstisyum. Boru şeklindeki gövde, tek bir hücre tabakası, her biri ve ektodermal endodermal epitel soylar tarafından oluşturulur. Vücut sütunundaki epitel hücrelerinin mitotik tüm bulunmaktadır. Epitel hücreleri ekstremitelerde 3 yerdeğiştiren zaman, aboral sonunda ağız ucuna veya ayak (bazal disk) de baş (ağız ve dokunaçlarının), bunlar, hücre döngüsünün G2 fazında hücre kaderine 4 değiştirin. Interstisyel soyunun hücreleri, epitel hücreleri arasındaki boşlukları içinde bulunur. Bu soy vücut sütun 5 ektodermal epitel tabakasında bulunan multipotent kök hücreler tarafından desteklenmektedir. Interstisyel kök hücreler üç somatik cel doğuranl türleri (sinirler, bezi hücreleri ve nematocytes) ve germ hücreleri 6,7. Filumuna Sölenteralar bir üyesi olarak, tüm bilaterians için kardeş grup, Hydra çok hücreli hayvanlar arasında paylaşılan temel biyolojik süreçlere ışık tutabilir. Yakın zamana kadar, bu çabalar gen fonksiyonu pertürbasyon güvenilir yöntemlerin eksikliği tarafından engellenir edildi. Ancak, transgenik metodoloji 1 gelişmesiyle birlikte, biz şimdi böyle kök hücre fonksiyonu, yenilenme ve desenlendirme gibi çok hücreli hayvanların, ortak temel mekanizmalarının daha iyi anlayabilmek için Hydra tam olarak yararlanmak mümkün. Transjenik hatlar Hydra yavru önemli bir frekans rasgele entegrasyon ve kimerik ifadesi ile embriyoların, plazmid DNA enjeksiyonu ile belirlenir. Belirli bir soy üniforma ifade ile bir çizgi eşeysiz çoğalması ile kurulabilir. Klonal Transg yaymak için yeteneğienic Hydra hatları sadece cinsel üreme tarafından yayılan olabilir hayvan modellerinin çoğunluğu, bir avantajdır. Buna ek olarak, transgenik hücreler nedeniyle hayvanın şeffaflık ve endojen floresan proteinleri 8 söz konusu olmaması nedeniyle in vivo kolayca izlenebilir. İlk transgenik Hydra hatları yana yedi yıl içinde bu tür çizgiler, çeşitli uygulamalar için kullanılmıştır, 1 yapılmıştır. Farklı hücre tipleri floresan proteinlerin sentezlenmesi mümkün, hücre hareketini takip hücre şekli değişiklikleri gözlemlemek ve vahşi tip koşullarda ve kimyasal pertürbasyondan 1,5,9-12 sonra her iki hücre kaderlerini izlemek için yaptı. Buna ek olarak, çeşitli soy farklı floresan protein sentezlenmesinin spesifik hücre popülasyonlarının FACS izolasyonu sağlar. Bu teknik, kök hücre spesifik mRNA ve seri spesifik küçük RNA 13,14 dizilenmesi için kullanılmıştır. Yükselticisi iseİki Hydra aktin genlerinden biri en yaygın olarak kullanılan bir kaç hücre tipi özel hızlandırıcılar tanımlanmış ve transgenik Hydra 9,11,15,16 GFP sentezlenmesini tahrik etmek için kullanılmaktadır. Gelecekte, hücre türüne özgü promoterler herhangi bir hücre tipi gözlem ve toplanmasını sağlayacak. Buna ek olarak, transgenik bir yaklaşım başarılı Wnt3 promoterinin 17 cis-hareket eden düzenleyici öğeleri tanımlamak için kullanılmıştır. Hydra transgenik yöntemlerinin geliştirilmesi ektopik ekspresyonu aşırı ifadesi ve devirme ile genlerin fonksiyonunu test etmek için güçlü bir yaklaşım sağlamaktadır. Transgenik hayvanlar fonksiyonu ve hücresel lokalizasyonunu 18-20 hem de incelemek için floresan-etiketli proteinleri eksprese eden yapılmıştır. Buna ek olarak, bir GFP transgenin 3&#39;UTR saç tokası RNA ekspresyonunun hedef genlerin 21,22 demonte yol açar. Bu yaklaşımların GFP tanımlamak için gereklive transgenik hattın oluşturulması sırasında transgenik doku izleyebilirsiniz. Bununla birlikte, bazı durumlarda GFP molekülü etiketli protein işlevine müdahale olasıdır. Yeni bir çalışma Nem genler operon konfigürasyonda düzenlenebilir gösterir, yani, daha sonra, polisistronik transkriptleri, trans-eklenmiş lider sıra ile ayrılmış ve ayrı ayrı 23 çevrildiği, yapılır. Bir protein veya bir operon ve aşağı doğru pozisyonda bir floresan protein geninin üst akış konumunda bir saç tokası RNA kodlayan bir geni yerleştirilerek, bir protein veya bir RNA firkete kodlayan geni etiketlemek zorunda olmayan transgenik doku izleyebilir. Bu yöntem, gen 14 demonte elde etmek için olan bir operasyon DsRed2 konfigürasyonunda bir saç tokası RNA ifade etmek için kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>AEP Hydra Strain</td><td></td><td></td><td>E-posta: celina.juliano@yale.edu'da Celina Juliano veya Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp</td></tr><tr><td>Yüksek Hızlı Maxi Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri Kapları</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>75 x 50 mm Cam Mikroskop Slayt</td><td>Sigma</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon Balık Kalıbı</td><td>IBI Bilimsel</td><td>FM-600</td><td></td></tr><tr><td>Filament Sutter Aletli Borosilikat Cam</td><td></td><td>BF100-50-10</td><td>OD: 1.0 mm, İç Çap: 0.50 mm, 10 cm uzunluk</td></tr><tr><td>Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Aleti</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Kırmızı</td><td>Sigma</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Kuyumcu Forseps, Durmont #5</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Neşter Bıçağı #15</td><td>Fisher</td><td>50-822-421</td><td></td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma</td><td>M8410-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjektör</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik Stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Demir Plaka</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Joystick Mikromanipülatör</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr></tbody></table>

transgenik Üretimi hydra: mikroenjeksiyon yolu ile embriyo

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Tüm iki taraflıların kardeş grubu olan Cnidaria filumunun bir üyesi olarak Hydra, çok hücreli hayvanlar arasında paylaşılan temel biyolojik süreçlere ışık tutabilir. Hydra, rejenerasyon, model oluşumu ve kök hücrelerin incelenmesi için bir model olarak kullanılır. Bununla birlikte, araştırma çabaları, moleküler işlevi incelemek için gen bozulmaları için güvenilir bir yöntemin olmaması nedeniyle engellenmiştir. Transgenik yöntemlerin geliştirilmesi, Hydra biyolojisi1 çalışmasını yeniden canlandırdı. Transgenik Hidra, canlı hücrelerin izlenmesine, biyokimyasal analiz için saf hücre popülasyonları elde etmek üzere sıralamaya, gen fonksiyonunun knockdown ve aşırı ekspresyon ile manipüle edilmesine ve promotör fonksiyonunun analizine izin verir. Erken evre embriyolara enjekte edilen plazmid DNA, gelişimin erken dönemlerinde rastgele genoma entegre olur. Bu, üç soydan birinde veya daha fazlasında (ektodermal epitelyal, endodermal epitel veya interstisyel) doku yamalarında transgenleri eksprese eden yavrularla sonuçlanır. Transgenik dokuya sahip bir yavru elde etmenin başarı oranı %10 ile %20 arasındadır. Transgenik kuluçkanın eşeysiz yayılımı, belirli bir soyda düzgün bir transgenik hat oluşturmak için kullanılır. Transgenik Hydra oluşturmak şaşırtıcı derecede basit ve sağlamdır ve burada düşük maliyetle kolayca uygulanabilecek bir protokolü açıklıyoruz.

Transgenik Hydra hatları kurulması Artemia nauplii'ye her 2-3 gün transgenik yavru besleyin. Yavru bazen yumurtadan çıktıktan sonra bir veya iki gün boyunca yemek yok. Bazı yeni yavrular hayatta olmaz, böylece yemek ve asla. Yavru ektodermal (Şekil 1A), ya transgenik veya endodermal epitel doku ise, hayvan, tomurcuk ve en transjenik doku (Şekil 1B, C) ​​bulunmaktadır tomurcukları toplamak için izin verir. Bir transgen doğru, ektodermal <strong...

Kararlı transgenik Hydra, plazmid DNA'nın embriyolara mikroenjeksiyonu ve ardından rastgele genomik entegrasyon ve tek tip bir çizgi oluşturmak için eşeysiz çoğaltma ile yapılır. Transgenik Hydra, hücre hareketlerini izlemek, genleri aşırı eksprese etmek, promotör işlevini incelemek veya RNAi kullanarak gen ekspresyonunu yıkmak için kullanılır.

Transgenik Üretimi Hydra: Mikroenjeksiyon yolu ile embriyo

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Bu prosedürün genel amacı, transgenik hatlar üretmek için plazma DNA'sını hidra embriyolarına mikro enjekte etmektir. Bu, önce bir plazma DNA çözeltisinin hazırlanması ve bir enjeksiyon iğnesine yüklenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, plazma DNA çözeltisi, bir ila sekiz hücre aşaması arasında hidra embriyolarına enjekte edilir.Daha sonra hidra embriyolarının gelişmesine ve yumurtadan çıkmasına izin verilir ve transgenik dokuya sahip yavrular seçilir. Son adım, orijinal transgenik hayvanın eşeysiz tomurcuklanmasıyla tek tip bir transgenik hat üretmektir. Sonuç olarak, hidradaki transgenik ekspresyonu görselleştirmek için floresan mikroskobu kullanılır.Bu yöntem, düşük maliyetle transgenik hidro hatlar yapmak isteyen araştırmacılar için tasarlanmıştır, böylece hem mevcut hidro araştırmacılar için hem de bu modeli kullanmaya başlamak isteyenler için bu kullanışlı teknolojinin daha geniş bir uygulamasına izin vermiştir. Transgenik hidra, doku dinamiklerini, nakavt ve aşırı ekspresyon ile protein lokalizasyonu gen fonksiyonunu ve ayrıca promotör fonksiyonunu incelemek için kullanılır. Metin protokolüne göre plazma DNA'sını hazırladıktan sonra, önce 75'e 50 cam mikroskobu yerleştirerek bir enjeksiyon kabı hazırlayın.100 x 15 milimetrelik bir Petri kabına bir açıyla kaydırın, 50 mililitre hidra ortamında %2 agros çözün. Soğumaya bırakın. Daha sonra Petri kabına dökün Agros katılaştıktan sonra, cam sürgüyü çıkarın ve tıraş bıçağıyla fazla agrosları bir duvar oluşturacak şekilde kesin.Daha sonra hemen hidra ortamını tabağa dökün ve hemen kullanın veya ihtiyaç duyulana kadar dört santigrat derecede saklayın. Enjeksiyon çözeltisini hazırlamak için, mililitre başına 2.5 miligram üç mikrolitre plazma DNA çözeltisini iki mikrolitre% 10 fenol kırmızı çözeltisi ile birleştirin. Çözeltiyi kısa bir süre vorteksleyin ve ardından bir diseksiyon mikroskobu altında iğneyi tıkayabilecek parçacıkları çıkarmak için bir mikro santrifüjde maksimum hızda 10 dakika döndürün.Küçük bir açıklık oluşturmak için iğneyi uçtan birkaç milimetre kesmek için forseps kullanın. İğneyi içeren Petri kabını, iğne ucu aşağı bakacak şekilde dikey konumda olacak şekilde yönlendirin. Daha sonra iğnenin arka ucuna yaklaşık 0,5 mikrolitre enjeksiyon solüsyonu pipetleyin.Embriyoları enjeksiyona hazırlamak için, yumurta üreten polipler için bir EP suş kültürü olan bir hidrayı tarayarak başlayın. Bu polipleri toplayın ve ayrı bir kültür kabına aktarın. Yumurta oluşumunun ilerlemesini izlemek için bu polipleri gün içinde birkaç saatte bir gözlemleyin.Yumurtalar ektodermden geçtiğinde ve geri çekilmiş dermal hücrelerden oluşan bir halka üzerine oturduğunda, enjeksiyona hazırdırlar, enjeksiyona hazır yumurtaları olan polipleri, enjeksiyondan en az bir saat önce testisleri olan birkaç hidra içeren bir tabağa yerleştirin ve dişiler tam olarak oluşmuş yumurtalara veya bir ila sekiz hücre evresi embriyosuna sahip bir EP kolonisinde bulunursa döllenmeye izin verir. Ayrıca bunları enjeksiyondan önce enjeksiyon için toplayın. Ayrılmaya başlayan embriyoların üstündeki ve altındaki ebeveyn dokusunun çoğunu çıkarmak için 15 numaralı bıçaklı bir neşter kullanın ve onları ebeveynin vücut kolonunun sadece küçük bir parçası bağlı olarak bırakın.Disseke edilen dokuyu Hydra ortamında saklayın çünkü yenilenir ve dişilerin hidra kolonisinde kalmasını sağlar. Parçalanan embriyoları bir enjeksiyon kabına aktarmak için bir mera pipeti kullanın ve bunları agros oluğunun duvarına paralel olarak düzenleyin. Demir bir plaka üzerine oturan manyetik bir stand üzerine monte edilmiş mikro enjektörü hazırlamak için.İğneyi bir joystick mikrom manipülatörü üzerinde tutan mikro enjektörün bir parçası olan enjeksiyon tutucuyu monte edin. Manyetik bir stand kullanarak joystick manipülatörünü demir plakaya monte edin. Ardından tüm kurulumu bir diseksiyon mikroskobunun sağ tarafına yerleştirin ve enjeksiyon tutucuyu gözlem alanında görünecek şekilde konumlandırın.Embriyolu enjeksiyon kabını, agros oluğunun dikey duvarı sola doğru olacak şekilde yönlendirilmiş diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. İğneyi enjeksiyon tutucusuna yerleştirin ve iğnenin ucunu tabaktaki hidra ortamına indirin. Daha sonra, şırınganın topuzunu, mineral yağ iğnenin üst kısmını doldurana ve iğneden hidra ortamına çıkan sabit bir enjeksiyon çözeltisi akışı gözlenene kadar saat yönünde yavaşça çevirin.Akış çok güçlüyse, düğmeyi saat yönünün tersine çevirerek basıncı düşürün. Bir embriyoyu görüş alanında ortalayın ve iğneyi embriyoya değecek şekilde hareket ettirin. Daha sonra embriyoyu iğne ile delmek için mikrom manipülatörünü kullanın ve iğneyi hızlı bir şekilde çıkarmadan önce enjeksiyon çözeltisinin bir veya iki saniye embriyoya akmasına izin verin.Embriyonun birden fazla hücresi varsa, her hücreyi ayrı ayrı enjekte edin. Tüm embriyolar enjekte edilene kadar devam edin. Tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, testisleri olan bir EP polipleri olan birkaç Hydra içeren bir tabağa aktarın ve embriyogenez geçirmeye devam ederken onları 18 santigrat derecede inkübe edin.Embriyolar kütikül aşamasına ulaştığında, her bir embriyoyu hidra ortamı ile doldurulmuş 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna taşıyın ve karanlıkta 18 santigrat derecede iki hafta boyunca inkübe edin. Daha sonra bir diseksiyon mikroskobu altında, her embriyoyu küçük ebeveyn dokusu parçasından ayrılma ve bu dokunun yenilenmesi açısından kontrol edin. Varsa, yeni bir yavru ile karıştırılmaması için hemen çıkarın.Her embriyoyu kontrol ettikten sonra, çanağı oda sıcaklığında bir akvaryum ışığının altına taşıyın. Plakaları her gün kontrol edin ve yavruları toplayın. Yeni yavrular henüz yemek yemedikleri için beyaz renkte olacaktır.Transgen ekspresyonu için bunları bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin. Her iki ila üç günde bir transgenik yavruları beslemek için art napoli kullanın. Elektrodermal veya endodermal epitel dokusunda transgenik olan yavrular tomurcuk ürettiğinde, transgen ekspresyonu açısından değerlendirilirler.Burada gösterilen, bir Ds kırmızısının kimerik ekspresyonu, bir aktin promotörü kontrolü altında iki transgen ve bir ektodermal epitel hücresi yaması olan bir yavrudur. Hayvan tarafından sürekli tomurcuklanma, sonunda elektrodermal veya endodermal epitel soyunda transgenin tek tip ekspresyonu ile bir çizgi üretebilir. Burada görüldüğü gibi, orijinal yavru şimdi iki yeni tomurcuk üretiyor.Bir yıldızla etiketlenmiş tomurcuk, transgenik dokuya sahip değildir ve transgenin varlığı dışında, genetik olarak transgenik çizgiyle aynı olan bir kontrol çizgisi için kurucu hayvan olarak kullanılmıştır. Bu hayvan, orijinal yavrudan üretilen transgenik dokuya sahip ilk tomurcuktur. Biyolojik fonksiyon üzerinde hiçbir etkisi olmayan transgenlerin kullanıldığı bu deneyler sayesinde, epitelyal transgenik doku ile yumurtadan çıkan hidranın yaklaşık% 30'undan tek tip epitel hücre hatları oluşturuldu.Burada görüldüğü gibi düzgün bir elektrodermal hat, bir endodermal hattan %33 ila %50 daha sık kurulur. Bu nedenle, bu videoyu izledikten sonra, bu modelle yapabileceğiniz fonksiyonel çalışmaların repertuarına katkıda bulunacak olan transgenik hidro hatların nasıl yapıldığını iyi anlamalısınız.

generation-of-transgenic-hydra-by-embryo-microinjection

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, Nijole Jasinskiene Dang humması için vektörler transgenik Aedes aegypti sivrisinek, üretmek için kullanılan yöntem gösteriyor. Doğru, mikroenjeksiyon iğneler hazırlanması embriyolar dessicating ve mikroenjeksiyon teknikleri gösterilmektedir.

Transgenik Sivrisinekler Edinme A. aegypti Embriyolar Mikroenjeksiyon

Dış ifade beyin gelişiminde microRNA rolünü izah etmek için bir tekniktir. Ancak, ovo elektroporasyon kullanarak belirli alanları hedefleyen zordur. Burada, biz verimli bir şekilde seçici electroporate ventral ve dorsal orta beyin bölgeleri göstermek.

Ventral Chick orta beyin içinde MikroRNA ovo İfade

Preneoplastik hücre ilerlemesi ve doğuştan gelen bağışıklık hücre etkileşim erken olayları incelenmesi anlamak ve kanser tedavisinde çok önemlidir. Burada şartlı epitel hücre dönüşümleri ve HRAS G12V zebra balığı larvası deri hücreleri ile doğuştan gelen bağışıklık hücre etkileşiminin daha sonra canlı görüntüleme uyarılması için bir yöntem tarif eder.

Larva Zebra balığı Skin bir İndüklenebilir Gal4 / UAS İfade Sisteminin Kullanılması doğuştan gelen bağışıklık ve preneoplastik Hücre Etkileşimleri Canlı Görüntüleme

farklı genetik kökenden bireysel WT retina atalarıdır Canlı izleme nöron sırasında hücre özerk olmayan sinyalizasyon katkısı değerlendirilmesi için izin verir. Burada, embriyo transplantasyonu yoluyla ve in vivo time-lapse konfokal görüntüleme gen demonte, kimera nesil bir arada bu amaçla kullanılmıştır.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

Mikroenjeksiyon Nasonia vitripennis embriyo kalıtsal genom değişiklikler oluşturmak için temel bir yöntemdir. Burada açıklanan mikroenjeksiyon ve büyük ölçüde bu organizma gelecekteki genom manipülasyon kolaylaştıracaktır Nasonia vitripennis embriyo nakli için detaylı bir işlemdir.

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

Preassembled Cas9 kullanan karmaşık Ribonükleoprotein (RNP) kesin, verimli genom düzenleme için güçlü bir yöntemdir. Burada, biz yararını hücreleri ve organizmalar, geniş aralığında birincil insan hücreleri ve her iki klasik de dahil olmak üzere ve model organizmalar gelişmekte olan vurgulayın.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Burada iletişim kuralları için toplama ve microinjecting precellular Batı Mısır rootworm embriyo germline dönüştürme ve CRISPR/Cas9-genom düzenleme gibi fonksiyonel genomik deneyleri yapmak amacıyla mevcut.

Western Mısır Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon Germline dönüştürme veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme

Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Böcek ösosyalliğinin birçok özelliği, koloni içi iletişime ve işbölümüne dayanır. Karınca embriyolarındaki anahtar düzenleyici genlerin mikroenjeksiyon ve CRISPR aracılı mutagenez yoluyla genetik manipülasyonu, ösosyal böceklerde özgecil davranışın doğası hakkında fikir verir.

Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları

Bu protokolde, E7.5'teki fare amniyotik boşluğunun lentivirüs ile nasıl enjekte edileceğini açıklıyoruz, bu da tüm sinir plakasının düzgün bir şekilde transdüksiyonuna yol açarak, hayatta kalma veya embriyonik gelişim üzerinde minimum zararlı etkiye sahiptir.

Embriyonik Gün 7.5'te In Utero Nano-Enjeksiyon (NEPTÜN) ile Murin Nöral Plaka Hedefleme

Bu makale, Drosophila'daki phiC31 integraz aracılı transgenezi örnek olarak almakta ve transgenik sinekler oluşturmak için çok önemli bir adım olan embriyo mikroenjeksiyonu için optimize edilmiş bir protokol sunmaktadır.

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Öğrenin Hydra embriyolarına mikroenjeksiyon yoluyla transgenik hat üretimini. Bu yöntem, gen fonksiyonu ve gelişimsel süreçleri incelemek için kararlı transgenik hatlar oluşturur.

Transgenik Üretimi Hydra: Mikroenjeksiyon yolu ile embriyo

Daha fazla video keşfet