Name: Lusiferaz ifade eden rekombinant virüsler yüksek verimlilik Titrasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Öğrenin, lusiferaz ifade eden rekombinant virüslerin yüksek verimlilik titrasyonunu. Bu yöntem, hücre canlılığını değerlendirerek çok sayıda örneği hızla işlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Vanessa Garcia, Kraliçe II. Elizabeth Ontario Bilim ve Teknoloji Yüksek Lisans Bursu ve Cory Batenchuk Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi bursu tarafından finanse edilmektedir.

1. Numune Hazırlama <ol><li> 96-yuvalı plakalar içine titrasyon ve transferi için lusiferaz sentezleyen virüsün (bir örnek olarak VSVΔ51-Fluc) içeren numuneler elde edilir. Alternatif olarak, doğrudan, 96 oyuklu doku kültür plakaları ve kullanım yüzer enfeksiyonların gerçekleştirin. </li><li> Standart eğriler dahil işlenmemiş iki sütun bırakın. Daha sonraki bir tarihte -80 ° C ve titrede deney (40 saat post-enfeksiyon) veya mağaza sonunda 96-yuvalı plakalar, titresi doğrudan yapılan deneyler için. </li></ol> Virüs titrasyonu için, permisif ve Hücreler 2. Hazırlık <ol><li> 24 saat önce hassas olarak ölçülmesi için,% 10 fetal inek serumu ihtiva eden Dulbecco&#39;nun Modifiye edilmiş Eagle ortamında 2.5 x 10 5 hücre / ml (DMEM) (FBS), 30 mM HEPES konsantrasyonunda Vero hücrelerinin bir süspansiyon hazırlamak, ve% 1 penisilin / kültürlendi. NOT: Bu protokol Vero hücreleri kullanır rağmen, VSV enfeksiyon için uygun herhangi bir müsamahakar hücre hattı olabilir bde kullanılabilmektedir. </li><li> Bir mikro-dağıtıcı kullanılarak 96 oyuklu beyaz bir katı, düz tabanlı plakalar içerisinde 2.5 x 10 4 hücreleri (100 ul) Tohum. <ol><li> Plaka başına hücre süspansiyonu 12 ml artı astar boyunca 5 ml hazırlayın. </li><li> Steril 50 ml su ile yıkama, borunun temizleyin mikro dağıtıcı kaseti. </li><li> Hücre süspansiyonu ile mikroplaka dağıtıcı çizgileri doldurmak ve hücre 5 ml süspansiyon akışı sağlar. </li><li> Beyaz bir duvarlı 96-çukurlu bir levhanın her çukuruna 100 ul dağıtmak bir program seçin. Koyun, ve ek plakalar için gerektiği gibi tekrarlayınız. Opak dipli beyaz duvarlı plakalar hücre sağlığı ve yoğunluk doğrulanması için kullanıldığında aynı zamanda, bir 96-açık görüş düz tabanlı plaka içinde bir kuyu kaç tohum. </li><li> geri orijinal kabın içine bitmiş, floş hücreler. Borular yoluyla ılık steril 50 ml su, ardından% 70 etanol, 50 ml çalıştırarak kaseti temizleyin. </li><li> Emin kaset ve tüp ap olunpropriately kullanımları arasındaki temizlenmelidir. </li></ol></li><li> Nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 24 saat boyunca inkübe hücreleri. </li></ol> Viral Standart Eğrisi 3. hazırlanması <ol><li> 10 8 pfu / ml, 10 7 pfu / ml serum içermeyen DMEM içinde VSVΔ51-Fluc bir standart eğri hazırlamak, aşağıdaki şekilde, Vero hücreleri üzerine transfer edildikten sonra, ml başına plak oluşturucu birim (pfu), nihai konsantrasyon olduğu 10 6 pfu / ml, 10 5 pfu / mi, 10 4 pfu / ml, 10 3 pfu / mi, 10 2 pfu / ml ve 10 1 pfu / ml olmuştur. Vero hücrelerinin plaka artı ekstra% 10 başına her bir konsantrasyonu 50 ul hazırlayın. Not: lusiferaz virüs stokunun titresi kesin miktar sağlayacak bir standart eğri hazırlamak için klasik bir şekilde 10 değerlendirilecek gerekir. Aksi takdirde, miktar ölçümü keyfi ayarlayarak, viral titresi kesin titre bilgi olmaksızın elde edilebilir göreseyreltme adımlar. Örneğin, standart eğrinin birinci seyreltme 10 8, viral birimleri ve 10 7 ve böylece için aşağıdaki 1/10 seyreltme için ayarlanmış olabilir. Bu bağlamda, kesin olmayacağı gibi kesin miktar önceden belirlenmiş bir örneğe göre daha kat değişiklik olarak ifade değerleri gerekmektedir. </li></ol> Permisif hücreler üzerine Örnek süpernatanlarından 4. Transferi <ol><li> Tekli tabakaları, en azından% 95 birleştiğinde olduğunu teyit etmek üzere, bir ışık mikroskobu altında berrak tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde kaplama Vero hücreleri kontrol ediniz. </li><li> Beyaz duvarlı plakalarda tohumlanmıştır Vero hücreleri üzerine örnek süpernatan 25 ul aktarın. Standart eğrileri için belirlenen 2 sütun halinde süpernatanlarm havale etmeyin. Not: Bu, bir kanal 96, sıvı işleyici kullanarak tek bir plaka üzerinde tüm oyuklara için eş zamanlı olarak yapılabilir. </li><li> 8 veya 12 kanallı bir çok kanallı pipet kullanılarak, in Vero hücrelerinde edilmesi için Adım 3&#39;te hazırlanan standart eğrinin her bir seyreltinin 25 ul2 belirlenen sütun. </li><li> Oda sıcaklığında 430 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje plakalar. </li><li> Nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 5 saat boyunca inkübe edin. </li></ol> Hücre canlılığı 5. Değerlendirme <ol><li> Not: açık, 96 oyuklu plakalar içinde yapılan enfeksiyon deneylerden elde edilen yüzer başlayarak zaman, örnek canlılık gibi resazurin gibi bir hücre canlılığı işaret eden bir boya ile miktar tayini önce değerlendirilebilir. </li><li> Virüs ve hücreleri içeren örneklerin, 96 oyuklu plakanın her oyuğundaki hacminin% 10&#39;una eşit bir miktarda resazurin ekleyin. Cell-only sırasıyla% 100 ve% 0 canlılığı değerlerini belirlemek için medya sadece kontrol yanı sıra kontrol içerir. </li><li> 2-4 saat (hücre tipine ve boya ticari olarak temin edilebilir ya da yeniden oluşturulan toz konsantrasyonuna bağlı olarak değişir inkübasyon süresi) sonra, okuma ve bir floresan plaka okuyucu kullanarak (530-560 uyarma, 590 emisyon) kullanarak sinyali kaydedilir. Rapor hücre viabilix% 100 formülüne Nispi metabolik aktivite = - (- negatif kontrol sinyali) / (Hücre tek sinyali kontrol negatif kontrol sinyali) (Test Örnek sinyali) &#39;e uygun bir numune için ty </li></ol> Luciferase Yüzey 6. hazırlanması <ol><li> 30 dakika 5 saat inkübasyonun sonunda önce, steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 2 mg / ml bir solüsyon elde etmek için, lusiferin hazırlar. Plaka başına 2.5 ml artı bir ilave 2 ml hazırlayın. Işıktan çözüm koruyun. Not: lusiferin da günün erken hazırlandı ve kullanılana kadar 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 7. Okuma Biyoparlaklık <ol><li> 5 saatlik bir bekletme süresinden sonra, beyaz bir katı plakalar içinde Vero hücreleri her çukuruna luciferase 25 ul ekle. Elle veya luminometreye entegre otomatik bir dağıtıcı ile lusiferin ekleyin. Not: sadece tek ve bitiş noktasına sahip bir aletin kullanılması, bir lusiferaz uyumlu bir parçalama tampon tamponundan eklenmesini gerektirebilir okurfer tutarlılığını artırmak için lusiferin tabakayı eklemeden önce. </li><li> Aşağıdaki parametrelerle plakaları okuyun: <ol><li> 5 saniye çalkalayın. </li><li> 30 saniye bekleyin. </li><li> Uygun bir sabit hassasiyet / poz değeriyle luminescence okuyun. Seçeneği enstrüman üzerinde varsa, çok noktalı doğruluğunu geliştirmek için (örneğin, 3 x 3 matrisi) okur kullanın. </li></ol></li><li> Kayıt ve sayısal biyolüminesens yoğunluğunu kaydedin. </li><li> Otomatik dağıtıcı eklemek için kullanılır ise lusiferin lusiferin ve başbakan ılık steril su ile hatları temizlemek. </li></ol> 8. Veri Analizi <ol><li> Doğru sonuçlar için, standart eğrileri bir Tepesi denklem oluşturmak için non-lineer regresyon çözmek. Viral ekspresyon birimden titre örnekleri için bu denklem uygulanır. Bazı virüsler veya durumlar, doğrusal bir ilişki ile standart eğri üretebilir; Bu durumda lineer bir denklem çözmek. </li></ol>

<ol><li>Grigorov, B., Rabilloud, J., Lawrence, P., Gerlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+titration+of+measles+and+other+viruses%3A+optimization+with+determination+of+replication+cycle+length%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid titration of measles and other viruses: optimization with determination of replication cycle length.</a> PLoS One. 6 (e24135), (2011).</li>
<li>Lizee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li>
<li>McSharry, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uses+of+flow+cytometry+in+virology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Uses of flow cytometry in virology.</a> Clin Microbiol Rev. 7, 576-604 (1994).</li>
<li>Watcharatanyatip, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispecies+detection+of+antibodies+to+influenza+A+viruses+by+a+double-antigen+sandwich+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Multispecies detection of antibodies to influenza A viruses by a double-antigen sandwich ELISA.</a> J Virol Methods. 163, 238-243 (2010).</li>
<li>Dawson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Direct+Quantification+of+Viruses+in+Solution+Using+the+ViroCyt+Virus+Counter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Rapid, Direct Quantification of Viruses in Solution Using the ViroCyt Virus Counter.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 23 (S10), (2012).</li>
<li>Snyder, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+and+RT-PCR%3A+true+or+false%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV and RT-PCR: true or false.</a> Mol Ther. 1, 389-390 (2000).</li>
<li>Diallo, J. S., Roy, D., Abdelbary, H., De Silva, N., Bell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+infection+of+live+tissue+with+oncolytic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses.</a> J Vis Exp. 52, (2011).</li>
<li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells.</a> Appl Microbiol. 16, 588-594 (1968).</li>
<li>Green, M., Loewenstein, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adenoviruses%3A+propagation%2C+purification%2C+quantification%2C+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Human adenoviruses: propagation, purification, quantification, and storage.</a> Curr Protoc Microbiol. 14 (14C 11), (2006).</li>
<li>Diallo, J. S., Vaha-Koskela, M., Le Boeuf, F., Bell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation%2C+purification%2C+and+in+vivo+testing+of+oncolytic+vesicular+stomatitis+virus+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Propagation, purification, and in vivo testing of oncolytic vesicular stomatitis virus strains.</a> Methods Mol Biol. 797, 127-140 (2012).</li>
<li>Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ebola+virus+expressing+luciferase+allows+for+rapid+and+quantitative+testing+of+antivirals%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals.</a> Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).</li>
<li>Diallo, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+pharmacoviral+approach+identifies+novel+oncolytic+virus+sensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers.</a> Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada açıklanan lusiferaz bazlı bir kolaylığı, hız, en az ekipman gerekir, ve nispeten düşük maliyetle de dahil olmak üzere, diğer mevcut yöntemlere göre bir çok avantaj sağlamaktadır. Bu kadar önemli bir katkı, bir seri seyreltme adım kaçınma olduğunu. Bununla birlikte bu protokolün seri seyreltme esaslı türevler, kesinlikle mümkün olan ve son zamanlarda, yüksek verimli bir anti-viral Ekran 11-lusiferaz sentezleyen Ebola titrelerini ölçmek için kullanıldı. Doğal olarak daha fazla zaman alıcı ve daha pahalı olsa da gerektiğinde, bu tür uyarlamalar viral ölçümü için daha fazla dinamik aralık sağlayabilir. , Yüksek verimli taramalara bağlamında, viral titreleri değerlendirmek için özellikle uygun olmasına ek olarak, bizim tek aşamalı bir lusiferaz dayanılarak viral ölçme yöntemi virüs çoğaltma durumunda, enfeksiyonlu viryon doğru tahminlerini oluşturur. Bundan başka, aynı deneyden sitotoksisite verileri ile birlikte bir parlaklık okumaları daha eldehedef hücreler üzerinde deney koşullarının etkisinin tam resmi, onkolitik virüs ve ilaç ekranlarının bağlamında özellikle kullanışlıdır. Burada gösterilen örnek kopyalayan Negatif tek iplikli RNA virüsü kullanır; Bununla birlikte, bu protokol birkaç küçük ayarlamalar ile protokol virüs çoğalmasını ve replike edici olmayan bir dizi şekilde ayarlanabilir. Bu, Vaccinia, HSV ve AAV (bakınız Şekil 5) gibi maddeler, DNA virüslerini içerir. Örneğin vaccinia virüsü gibi hücre içi virüs ile enfekte numuneler önce, miktar (örneğin, en az bir dondurma-çözme çevrimi) için bir virüs bırakma adımı gerektirir. Diğer virüsler için bu tekniği uygulandığında, lüminometre ile plakaların okuma viral süpernatan veya lizat transfer kuluçka süresinin optimize edilmesi gereklidir. Bu parametre izin veren hücre hattında virüsün replikasyon döngüsü ve p gücü esas bağlı olacaktırromoter lusiferaz ekspresyonunu tahrik. Bu en iyi duruma getirme aşamasında tam bir standart eğri kullanılarak yapılır. Bunu yapmak için, bir hazırlanan standart eğri çeşitli çoğaltır ile uygun müsamahakâr hücre hattı bulaştırmak ve post-devret işaret her bir farklı bir zamanda çoğaltmak okumak gerekir. İdeal olarak, bir kuluçka zaman noktası beklenen örnek titre aralığı kapsayan LOG (RLU), ve log (titre) arasında doğrusal bir ilişki yol açar seçilir. VSVΔ51-Fluc için, bu tipik olarak 4 ila 10 pfu / mL -10 7 pfu / ml, 5 saat inkübasyon süresi için. Düşük veya yüksek titreleri numunelerden beklenen varsa, biri sadece sırasıyla artırmak veya kuluçka süresini azaltabilir. Alternatif olarak, örnekler, ELISA için tipik olarak yapıldığı gibi daha aralığına düşecek şekilde seyreltilebilir. Yukarıda belirtildiği gibi, bu yöntem de en adımların otomatik edilebilir ilaç kütüphaneleri kullanılarak yüksek verimli ilaç ekranlar gerçekleştirmek için uygundur. Hücreler e kaplı olabilirfficiently otomatik bir mikro dağıtıcısı kullanılarak ilaç kütüphane 96 kanallı bir sıvı tutucu yolu ile eklenebilir, virüs bir mikro-dağıtıcı kullanılarak ilave edilebilir ve plakalar, bir otomatik luminometre kullanılarak okundu. Teorik olarak, bu da 384-kuyucuklu bir veya daha küçük formatlarda adapte edilebilir; Bununla birlikte, bu amaçla sınırlama kaplama olabilir hücre sayısı, verilen daha az hücre (titre) ilişki için kullanılacak günlük (RLU) arasında doğrusal olarak dar bir aralığı sebep olur. Son olarak, Resazurin ve diğer metabolik boyalar kullanılarak hücre canlılığı değerlendirmesi kolay virüs 12 ile kombinasyon halinde sinerjistik bir antiviral öldürülmesine yol ekranlar ya da bileşiklerin tanımlanması sitotoksik bileşiklerin ayrım sağlayan, iş akışı içinde dahil edilebilir. Bununla birlikte, bu yöntemin sınırlamaları her zaman mümkün değildir, bir lusiferaz transgen ifade virüs, gereksinimi ve yeterince izin veren hücre hattının durumunu içerir. Bununla birlikte, adapte etmek mümkündür muhtemeldirDiğer raportör gen ile birlikte kullanılmak için olan yöntem (örneğin GFP) raportör ölçme yöntemi gürültü oranı için uygun bir doğrusallık ve sinyal sahip olması koşuluyla. Genel olarak, anlatılan yöntem, yüksek verimli bir çok farklı virüs uyacak şekilde değiştirilebilir ve farklı uygulamalar için uygun olabilir.

Klasik viral plak testleri, herkesin bildiği gibi zaman alıcı olabilmelerine ve deneylerden sonuç elde etmek için önemli bir darboğaz oluşturabilmelerine rağmen, virüs araştırmalarında temel bir dayanak noktası olmaya devam ediyor. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), ELISA ve akış sitometrisi1-4 dahil olmak üzere daha hızlı dolaylı virüs miktar tayin yöntemleri ortaya çıkmıştır. Virocyt virüs sayacı gibi son yenilikler, gelişmiş akış sıralama teknolojisini kullanarak ve protein ve DNA / RNA boyalarının bir kombinasyonu yoluyla virüsleri doğrudan sayabilir5. Bu yöntemlerin tümü şüphesiz virüs araştırmalarının hızını artırmış olsa da, her yöntemin avantajları ve dezavantajları vardır. Örneğin, qPCR, spesifik viral genom dizisinin nicelleştirilmesine izin verebilir, ancak bulaşıcıyı kusurlu virionlardan etkili bir şekilde ayırt edemez6. ELISA'lar çok spesifik olabilir, ancak istenen hedef viral proteine karşı uygun bir antikor gerektirir ve çok pahalı olabilir. Akış sitometrisi teknolojisi birçok avantaj sunsa ve önemli ölçüde iyileşmiş olsa da, son derece özel ekipmanlara verim ve erişilebilirlik yine de bir engel olmaya devam etmektedir. Daha da önemlisi, bu tekniklerin tümü, virüs ölçüm adımının kolaylık ve zaman gereksiniminin kritik öneme sahip olduğu yüksek verimli tarama için ideal olarak uygun değildir.
Burada, bir Firefly lusiferaz (Fluc) transgeni eksprese eden virüsleri titre etmek için yüksek verimli ve kolayca otomatikleştirilebilir bir tekniği açıklıyoruz. Bu yöntem, bilinen virüs miktarlarının standart bir eğrisinin paralel kullanımı yoluyla okunan lüminesans sinyaline dayalı olarak bir test numunesinde yaklaşık viral titreler üretir. Bilinmeyen miktarlarda lusiferaz eksprese eden virüs içeren numuneler, standart virüs seyreltme eğrisine paralel olarak izin verilen bir "plaquing" hücre hattına aktarılır ve birkaç saatlik inkübasyon süresinden sonra virüsle ilişkili lüminesans okunur. Bu, görünür plakları7-9 manuel olarak saymak için tipik olarak birkaç günlük inkübasyon gerektiren klasik plak tahlil protokollerinin aksine, hızlı, kantitatif, genellikle aynı gün sonuç üretimine izin verir. 
Protokol, örnek olarak bir Fluc transgeni (VSV∆51-Fluc) kodlayan onkolitik Veziküler Stomatit Virüsünü kullanarak titrasyon yöntemimizin adımlarını ana hatlarıyla belirtir ve 1'e genel bir bakış sağlar. Numune hazırlama 2. Otomatik bir dağıtıcı kullanılarak virüs titrasyonu için izin verilen bir hücre hattının kaplanması 3. Viral standart eğrisinin hazırlanması 4. Numune süpernatantlarının 96 oyuklu bir manuel pipetleyici 5 kullanılarak izin verilen hücre hattına aktarılması. Bir hücre canlılığı reaktifi kullanılarak numune sitotoksisitesinin değerlendirilmesi 6. Luciferin substratının hazırlanması 7. Biyolüminesans okuması ve 8. Veri analizi.

<table><tbody><tr><td>Dulbeccos'un Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td> <td>Corning</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>NorthBio Inc.</td><td>NBSF-701</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td>1 mM'lik bir çözelti hazırlayın, pH 7.3</td></tr><tr><td>alamarBlue&nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>BUF012B</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin potasyum tuzu</td><td>Biotium</td><td>10101-2</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu katı beyaz düz tabanlı polistiren TC ile muamele edilmiş mikroplakalar</td><td>Corning</td><td>3917</td><td>384 oyuklu plakalar daha yüksek verim için de kullanılabilir</td></tr><tr><td>Synergy Mx</td><td>BioTek</td><td>SMTBL</td><td>Monokromatör mikroplaka okuyucu</td></tr><tr><td>Liquidator96</td><td>Mettler Toledo</td><td>LIQ-96-200</td><td>96 uçlu manuel pipetleme sistemi</td></tr><tr><td>Liquidator96 LTS Filtrelerle sterilize edilmiş uçlar</td><td>Mettler Toledo</td><td>LQR-200F</td><td>Tercih edilen pipetleyicilerle uyumlu herhangi bir steril filtreli uç uygundur</td></tr><tr><td>Microflo</td><td>BioTek</td><td>111-206-21</td><td>96 oyuklu bir plakadaki hücreleri plakalamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent FL</td><td>Thermo Scientific</td><td>5210450</td><td>Mikroplaka florometre</td></tr></tbody></table>

lusiferaz ifade eden rekombinant virüsler yüksek verimlilik titrasyon

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Enfeksiyöz viral titreleri belirlemek için standart plak testleri zaman alıcı olabilir, yüksek hacimli numunelere uygun değildir ve plak oluşturmayan virüslerle yapılamaz. Plak tahlillerine alternatif olarak, tek bir günde yüksek hacimli numunelerin eş zamanlı titrasyonuna olanak tanıyan yüksek verimli bir titrasyon metodu geliştirdik. Bu yaklaşım, numunelerin Firefly lusiferaz etiketli bir virüs ile enfeksiyonunu, enfekte olmuş numunelerin uygun bir izin veren hücre hattına aktarılmasını, ardından lusiferin eklenmesini, lüminesans okumaları elde etmek için plakaların okunmasını ve son olarak lüminesanstan viral titrelere dönüşümü içerir. Metabolik canlılık boyası kullanılarak sitotoksisitenin değerlendirilmesi, paralel olarak iş akışına kolayca dahil edilebilir ve bir ilaç taraması bağlamında değerli bilgiler sağlayabilir. Bu teknik, standart bir plak testine alternatif olarak viral titreleri belirlemek için güvenilir, yüksek verimli bir yöntem sağlar.

Yüksek verimli bir metodu tarif eden akışı bir özeti Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir. Şekil 2 tipik bir standart eğri ofVSVΔ51-Fluc sonuçlarını göstermektedir. Non-lineer regresyon analizi Dört-parametresi bilinmiyor giriş pfu (viral titreye tahmini) interpolasyon edilebileceği bir Tepesi arsa oluşturulur. Bu tahmini titerleri olarak adlandırılır viral sentezleme birimi (VEU). Şekil 3A ve Veus titreleri aynı örnekler 10, standart plak test sureti ile elde edilen göstermektedir. Numuneler çeşitli kimyasallar çoğaltma geliştirmek için kullanılabilir, 786-0 hücrelerinde VSVΔ51-Fluc arasında yayılmış olan bir deney kaynaklanmıştır. Standart eğri interpolasyon Veus örnek süpernatanların seyreltilmesine dayanan bir faktör ile çarpılmalıdır Vero hücreleri üzerine transfer edilmektedir (bu durumda, seyreltme faktörü 5&#39;tir). Titreleri ve VEU arasında doğrusal bir ilişki Şekil 3B&#39;de gösterilmiştir </strong&gt; Ar 0,8083 2 ve 0,899 (p &lt;0.0001) Pearson r skoru. Şekil 4&#39;te, bir metabolik tahlilinden elde edilen tipik bir hücre sitotoksisitesi veriler önceden VSVΔ51-Fluc enfeksiyonuna kimyasal ile muamele 786-0 hücreler için gösterilmiştir. Son olarak, Şekil 5, çeşitli virüs ile kullanılarak elde edilen standart bir eğri (herpes simpleks virüsü (HSV), vaccinia virüs ve adeno-ilişkili virüs (AAV), tüm ifade ateşböceği lüsiferaz) gösterir ve gerekirse, inkübasyon sürelerini ve donma-erime döngüleri tarif eder. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig1highres.jpg" width="500" /> VSV-Δ 51 Fluc yardımıyla yüksek verimli, virüs titre ve sitotoksisite tahlilinin Şekil 1. İş Akışı. 37 ° C&#39;de (A) Tohum oyuk (100 ul) başına 2.5 x 10 4 Vero hücreleri ve inkübe edilir. (B) 24saat sonra aktarım için Vero hücreleri üzerinde standart bir eğri 25 ul (plaka başına 2 sütun). (C) örneklerinin Aktarım 25 ul kalan Vero hücreleri üzerinde titre etmek için. Santrifüj plakaları ve de 37 ° C &#39;. (D) içindeki hacmin% 10&#39;una eşit olan bir miktar içinde en inkübe orijinal numune içeren plağa resazurin reaktifmi. , 5 saat sonra, (F). Sitotoksisite floresans okunur ve değerlendirilmesi, 3 saat sonra, 37 ° C&#39;de. (E) inkübe edin Vero hücrelerinin her oyuğuna luciferase 2 mg / ml çözeltisi 25 ul ekle. Luminescence okuyun ve Viral İfade Birimleri hesaplayın. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2. VSV Δ 51-Fluc standart eğri Beklenen. Lüsiferaz ifadesi bendimiyi bir luminometre kullanılarak ve bioluminesans ortalama bağıl ışık birimleri (RLU) olarak ifade edildi içinde beş farklı noktalarda 5 saat sonrası süpernatant transferi asured. RLU ortalama bilinen girişine karşı çizilmiştir pfu / ml non-lineer regresyon çözmek ve Hill-Denklemi üretir. Iki suret eğrileri ve standart hata çubukları ortalama (r = 0,9993 2) gösterilmiştir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil yüksek verimli bir yöntem ile elde edilen standart plak test titrelerinin 3. karşılaştırılması. (A), VEU / ml arasında pfu / mL yüksek verimli bir lusiferaz deneyi kullanılarak titre aynı örneklerden hesaplanan viral titreler (VEU / ml) ile karşılaştırıldı Vero hücreleri üzerinde standart plak deneyi ile elde edilmiştir. (B) lineer bir ilişki içinde viral titreleri ve titre standart p yoluyla elde edilenlaque deneyi. Doğrusal regresyon eğrisi ve kararlılıkla (R 2) katsayısı gösterilmiştir. <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4. Örnek mevcudiyetini göstermektedir. Vero hücreleri üzerinde yüzer transferi, ticari olarak temin edilebilir çözelti kullanılarak Resazurin hücresel metabolik aktivitesinin değerlendirilmesi ile belirlenmiştir örnek canlılığı önce. Ham flüoresan değerleri, muamele edilmemiş, enfekte olmamış kuyusunun en az normalize edildi. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5. HSV, vaksiniya, ve AAV virüs, standart eğriler beklenir. Lusiferaz tanımı, iyi bir luminometre kullanılarak bir mesafede olan beş farklı noktalarda ölçülmüştür ve biyoışıldama ortalama gerçek konusunda ifade edilditif ışık birimleri (RLU), (A). HSV standart bir eğri Vero hücrelerine ilave edilmiştir 17 saat sonrası Süpernatan transferi (R2 yapıldı oyuk (100 ul) ve lusiferaz ölçüm başına 2.5 x 10 4 hücre yoğunluğunda 24 saat önce kaplı = 0,9489, n = 1). , Hill denklemi bir lineer olmayan regresyon çözerek elde edilmiştir. (B), bir standart eğri, Vaccinia Vero hücrelerine ilave edilmiştir oyuk (100 ul) başına 2.5 x 10 4 hücrelerinin 24 saat önce bir yoğunluğa yerleştirildi ve 37 ° C&#39;de 2.5 saat boyunca kuluçkaya C, bundan sonra lusiferaz ölçümleri alınmıştır (R 2 = 0,9892). Lineer bir bağıntı lineer regresyon çözülmesi ile elde edilmiştir. (C), bir standart eğri, AAV insan akciğer kanser hücreleri (A549) üzerinde ilave edildi oyuk (100 ul) ve lusiferaz ölçüm başına 2.5 x 10 4 hücre yoğunluğunda 24 saat önce kaplı 24 saat sonrası enfeksiyon yapıldı. A Hill denklemi doğrusal olmayan regresyon çözme ile oluşturulmuştur. OrtalamaBeş kopya eğrileri ve standart hata sütunları gösterilmiştir (R 2 = 0,9926).

Bu makale, otomatik ve manuel sıvı işleyiciler kullanarak çeşitli RNA ve DNA virüslerini titre etmek için yüksek verimli lusiferaz ifadesine dayalı bir yöntem sunar.

Lusiferaz ifade eden rekombinant virüsler yüksek verimlilik Titrasyon

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yüksek kapasiteli bir kantifikasyon yöntemi kullanarak lusiferaz etiketli bir virüsün viral titresini tahmin etmektir. Bu işlem, titresi belirlenecek örneklerin süpernatantı ile viral standart eğrisinin, lusiferaz ekspresyonuna izin vermek için permissif bir hücre hattına aktarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, hücre canlılığını değerlendirmek amacıyla orijinal örneklere Resazurin eklenebilir.Ardından, uygun bir inkübasyon süresinin ardından, biyolüminesansı nicelleştirmek için hücrelere lusiferin eklenir. Sonuçlar, lusiferaz ekspresyonuna dayanarak örnekteki virüs miktarını gösterir.Bu tekniğin plak titrasyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok sayıda örneğin hızlı ve eş zamanlı olarak işlenebilmesidir. Bu yöntem, plak oluşumuna bağımlı olmadığı için plak oluşturmayan lusiferaz eksprese eden virüslere de genişletilebilir. Hücre sitotoksisitesi okuması iş akışına kolayca dahil edilebilir ve bir ilaç taraması bağlamında faydalı olabilir. Prosedürü laboratuvarımdan üç lisansüstü öğrencisi olan Vanessa, Ramya ve Colin gösterecektir.İlk olarak, 96 kuyucuklu doku kültürü plaklarında Firefly Luciferase eksprese eden VSV-Delta 51 kullanılarak enfeksiyonlar gerçekleştirin. Bu plakalardaki süpernatantlar, uygun bir inkübasyon süresinin ardından titre edilecektir. Titrelemeden 24 saat önce, %10 FBS, 30 milimolar HEPES ve %1 penisilinle streptomisin içeren DMEM içerisinde 2,5 x 10⁵ hücre/mL konsantrasyonunda bir Vero hücresi süspansiyonu hazırlayın. Bir mikroplaka dağıtıcı kullanarak, 96 kuyucuklu beyaz, katı düz dipli plakalara 2,5 x 10⁴ hücre ekin. Hücre süspansiyonunu hazırlamak için, boru hattını 50 mililitre steril su ile yıkayarak bir mikroplaka dağıtıcı kasetini temizleyin.Ardından, mikropalyet dağıtıcı hatlarını hücre süspansiyonu ile doldurarak beş mililitre hücre süspansiyonunun akmasına izin verin. Beyaz duvarlı 96 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna 100 mikrolitre dağıtacak bir program seçin. Dağıtımı gerçekleştirin ve ek plakalar için gerektiği şekilde tekrarlayın. Ayrıca, hücre sağlığını ve yoğunluğunu doğrulamak için 96 kuyucuklu şeffaf beyaz tabanlı bir plakadaki birkaç kuyucuğa da hücre ekin.İşlem tamamlandığında, hücreleri orijinal kaplarına geri boşaltın. Tüplerden 50 mililitre %70 etanol ve ardından 50 mililitre ılık steril su geçirerek kaseti temizleyin. Bunun ardından, hücreleri nemlendirilmiş %5 karbon dioksit inkübatöründe, 37 santigrat derecede 24 saat boyunca inkübe edin.Vero hücrelerine transfer edildikten sonraki nihai mililitre başına plak oluşturan birim konsantrasyonu aşağıdaki gibi olacak şekilde, serumsuz DMEM içinde bir VSV-Delta-51 standart eğrisi hazırlayın. Her bir Vero hücresi plakası için her konsantrasyondan 50 µL ve ek olarak %10 fazlasını hazırlayın. Standart eğri, 96 derin kuyucuklu bir plakaya aktarılabilir. Ardından, tek tabakaların en az %95 konfluens düzeyinde olduğunu doğrulamak için şeffaf tabanlı 96 kuyucuklu plakaya ekilmiş Vero hücrelerini bir ışık mikrosobu altında kontrol edin. 12 kanallı bir çok kanallı pipet kullanarak, standart eğrinin her dilüsyonundan 25 µL'lik örnek süpernatantını, belirlenen iki kolondaki Vero hücrelerine, beyaz duvarlı plakalara ekilmiş Vero hücreleri üzerine 25 µL şeklinde transfer edin. Plakaları oda sıcaklığında 430 g kuvvetinde beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından plakaları, nemlendirilmiş %5 karbon dioksit inkübatöründe 37 °C'de beş saat boyunca inkübe edin.Bu aşamada, virüs ve hücre içeren örneklerin bulunduğu 96 kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğun hacminin %10'una eşit miktarda resazurin ekleyin. İki ila dört saat sonra, uyarılma için 530 ila 560 ve emisyon için 590 değerlerini kullanarak floresan plaka okuyucu ile sinyali okuyun ve kaydedin. Örnek için hücre canlılığını aşağıdaki formüle göre raporlayın.Beş saatlik inkübasyonun bitimine 30 dakika kala, steril fosfat tamponlu salinde mililitrede iki miligramlık bir çözelti elde etmek için Lusiferini hazırlayın. Çözeltiyi ışıktan koruyun. Beş saatlik inkübasyon süresinden sonra, lüminometreye entegre otomatik bir dağıtıcı ile beyaz katı plakalardaki Vero hücrelerinin her kuyucuğuna 25 mikrolitre Lusiferin ekleyin. Plakaları aşağıdaki parametrelerle okuyun.Beş saniye boyunca çalkalayın ve 30 saniye bekleyin. Lüminesansı uygun bir sabit hassasiyet veya pozlama değerinde okuyun, ardından nicelleştirilmiş biyolüminesans yoğunluğunu kaydedin ve saklayın. Lusiferin eklemek için otomatik bir dağıtıcı kullanıldıysa, lusiferini temizleyin ve hatları steril su ile hazırlayın. Doğru sonuçlar elde etmek için, standart eğrilerden bir Hill denklemi oluşturmak amacıyla doğrusal olmayan regresyonu çözün.Viral ekspresyon birimlerini hesaplamak için bu denklemi titresi belirlenmiş örneklere uygulayın. VSV-Delta 51 için tipik bir standart eğrinin sonuçları burada gösterilmiştir. Dört parametreli doğrusal olmayan regresyon analizi, bilinmeyen girdi plak oluşturan birimlerin interpole edilebileceği bir Hill grafiği oluşturmuştur. Vero hücrelerinde standart plak deneyi ile elde edilen viral titreler, yüksek kapasiteli lusiferaz deneyi kullanılarak titresi belirlenen aynı örneklerden hesaplanan viral titrelerle karşılaştırılmıştır. Örnekler, 786-0 hücrelerinde VSV-Delta-51'in replikasyonunu ve yayılımını artırmak için çeşitli kimyasalların kullanıldığı bir deneyden elde edilmiştir. Titreler ile viral ekspresyon birimleri arasındaki 0,8083 R kare ve 0,899 Pearson R-skoru değerine sahip doğrusal korelasyon burada resmedilmiştir. VSV-Delta-51 ile enfeksiyondan önce kimyasallarla işlem görmüş 786-0 hücreleri için metabolik bir deneyden elde edilen tipik hücre sitotoksisite verileri burada gösterilmiştir. Hepsi ateş böceği lusiferazı eksprese eden herpes simpleks virüsü, vaccinia virüsü ve adeno-ilişkili virüs ile elde edilen tipik standart eğriler burada sunulmaktadır.Bu teknik uzmanlaşıldıktan sonra, viral titreler ve sitotoksisite verileri elde etmek amacıyla, ilgilenilen virüsle birlikte bileşik kütüphanelerinin yüksek kapasiteli taramalarını gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu prosedür uygulanırken, viral ekspresyon birimlerinin interpolasyonu için kritik olduğundan standart eğrinin uygun şekilde seyreltilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.Canlı virüslerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken biyolojik güvenlik kabininde çalışmak ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, bir standart eğriden bilinmeyen viral ekspresyon birimlerinin interpolasyonu ile biyolüminesans ölçümü üzerinden bir lusiferaz transgen ekspresyonuna dayalı yüksek kapasiteli bir kantifikasyon yöntemi kullanarak viral titlerin nasıl tahmin edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Örnek sitotoksisitesi, uygun bir canlılık analizi ile eş zamanlı olarak belirlenebilir.

high-throughput-titration-of-luciferase-expressing-recombinant-viruses

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lentiviruses yapmak için, DNA vektörleri insan 293 hücrelerine transfekte. Hasattan sonra ve supernatant yoğunlaşarak, virüs titresi bir akış sitometresi ile floresan ifade tarafından belirlenir.

Lentivirüs Üretim

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates a luciferase-based pseudovirus titration assay to determine the optimal target cell density for maximum infection. By comparing luminescence across cell densities, the method ensures high assay sensitivity and reproducibility for downstream applications.

Determining Optimal Target Cell Density Using a Luciferase-Based Pseudovirus Infection Assay

HEK-293T hücrelerini 37 °C'de ve %5 CO2'de, stabilize L-glutamin içeren, %10 fetal calf serum (FCS), streptomisin (100 μg/ml) ve penisilin (100 IU/ml) ile desteklenmiş Dulbecco modifiye Eagle ortamında (DMEM) büyütün. Hücreler her 4-5 günde bir tripsinizasyon ile pasajlanmalı ve taze bir flaska 1:10 oranında dilüe edilmelidir. Deneyler için hücrelerin log fazında olması gerekir.

İnsan Embriyonik Böbrek Hücrelerinde Antiviral Bileşiklerin Değerlendirilmesi için Lusiferaz Tabanlı Analiz

Kaynak: Garcia, V., et al. High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses. J. Vis. Exp. (91), e51890, doi:10.3791/51890 (2014).Bu video, lusiferaz tabanlı bir analiz kullanarak viral yükün değerlendirilmesi için hücre kültürü örneklerinin hazırlanmasını göstermektedir. Epitel hücrelerin genetik olarak modifiye edilmiş bir virüsle enfekte edilmesi, viral süpernatanların ve standartların analiz kuyucuklarına aktarılması, ayrıca santrifüj ve inkübasyon yoluyla viral girişin...

Lusiferaz Tabanlı Viral Kantifikasyon için Numune Hazırlama

Video, lusiferaz etiketli proteinleri ölçmek için kullanılan lusiferaz testini göstermektedir. Tahlil, ilgilenilen bir protein ile konjuge edilen küçük parçaya bağlanan büyük bir parçadan oluşan tasarlanmış bir lusiferaz enzimi kullanır. Bağlı alt birimler, substratın varlığında ışıldayan bir sinyal yayan aktif bir enzim oluşturur. Bu sinyal daha sonra bir luminometre kullanılarak ölçülür.

Lusiferaz Testi: Tasarlanmış Nanolusiferaz Sistem Tabanlı Biyomuhabirler Kullanarak Lüminesan Sinyalleri Ölçmek İçin Yüksek Verimli Bir Test

Bu videoda, rekombinant bir HBV raportör sistemi aracılığıyla hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonunu tespit etmek için kullanılan bir in vitro teknik gösterilmektedir. Konakçı hücreleri enfekte ettikten sonra, rekombinant viral genom, substratını oksitledikten sonra biyolüminesans üreten lusiferaz raportör enzimini eksprese eder - viral enfeksiyonu tespit etmeye yardımcı olur.

Viral Enfeksiyonun Tespiti için İn Vitro Rekombinant Virüs Raportör Sistemi

Bu yüksek verimli robot transfections ve bir ev yapımı çift ışıma lusiferaz deneyi kullanılarak transkripsiyon düzenleyiciler belirlenmesi için hızlı ve ucuz bir tarama yöntemi sunulmaktadır. Bu protokol, hızlı bir şekilde binlerce gen için doğrudan yan yana fonksiyonel veriler üreten ve ilgi duyulan herhangi bir geni hedef kolayca değiştirilebilir olduğunu.

Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

Burada, pseudotyped parçacıklar spike protein yüksek patojenik virüs Ortadoğu solunum sendromu ve şiddetli akut solunum Sendromu coronaviruses birleştiren bir BSL-2 ayar oluşturmak için bir protokol mevcut. Pseudotyped bu parçacıklar hedef ana bilgisayar hücreler virüs girdiği miktar izin luciferase muhabir gen içerir.

Bir biyogüvenlik seviye 2 ortamda yüksek patojenik Coronaviruses çalışmaya Pseudotyped parçacıklar imalatı

Biz poxvirus enfekte hücreler içinde vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir assay kullanarak mRNA çeviri Yönetmeliği çalışmak için bir protokol sunuyoruz. Tahlil, 5 '-untranslated bölgesi (UTR) ve 3 '-UTR dahil olmak üzere bir mRNA BDTelemanları tarafından çeviri Yönetmeliği eğitim için kullanılabilir. Bu yöntem kullanılarak farklı çeviri başlatma modları da incelenebilir.

In vitro transkripsiyonu RNA tabanlı luciferase Reporter assay Poxvirus-virüslü hücrelerde çeviri Yönetmeliği çalışma

Influenza A virüsleri (IAVs) yıllık salgınlara ve ara sıra salgınlara neden olan bulaşıcı solunum patojenleridir. Burada, yeni bir rekombinant luciferase ve floresan ifade iki muhabir IAV (BIRFLU) kullanarak vivo viral enfeksiyonları izlemek için bir protokol açıklar. Bu yaklaşım in vivo IAV çalışma için mükemmel bir araç ile araştırmacılar sağlar.

Canlı Görüntüleme ve Viral Enfeksiyon Quantification için Bir Luciferase-floresan Reporter Grip Virüsü

Transkripsiyon faktörlerinin yeni düzenleyicilerini belirlemek için, çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir testi kullanarak dizili lentiviral veya retroviral RNAi kitaplıklarını taramak için bir yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım, tek bir deneyde yüzlerce adayı taramak için hızlı ve nispeten ucuz bir yol sunar.

Dizili Kütüphanelerin Orta İşleç Lik Taraması ve Çift Luciferase Tabanlı Muhabir kullanılarak Transkripsiyon Faktörü Düzenleyicilerin Tanımlanması

Öğrenin, lusiferaz ifade eden rekombinant virüslerin yüksek verimlilik titrasyonunu. Bu yöntem, hücre canlılığını değerlendirerek çok sayıda örneği hızla işlemenizi sağlar.

Lusiferaz ifade eden rekombinant virüsler yüksek verimlilik Titrasyon

Daha fazla video keşfet