Lusiferaz ifade eden rekombinant virüsler yüksek verimlilik Titrasyon

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yüksek verimli bir niceleme yöntemi kullanarak lusiferaz etiketli bir virüsün viral titrelerini tahmin etmektir. Bu, titrelenecek numunelerin süpernatantının yanı sıra viral bir standart eğrinin, lusiferaz ekspresyonuna izin vermek için izin verilen bir hücre hattına aktarılmasıyla elde edilir. İkinci adım olarak, hücre canlılığını değerlendirmek için kullanılacak olan orijinal numunelere RESA zurin eklenebilir.

Daha sonra, uygun bir inkübasyon süresinin ardından, lüminesans ile nicelleştirmek için hücrelere luciferian eklenir. Sonuçlar, lusiferaz ekspresyonuna dayalı olarak örnekteki virüs miktarını gösterir. Bu tekniğin plak titretme gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, çok sayıda numunenin hızlı ve aynı anda işlenebilmesidir.

Bu yöntem aynı zamanda tıkırdayan lusiferaz eksprese eden virüslere de genişletilebilir. Plak oluşumuna bağlı olmadığından, hücre sitotoksisitesinin bir okuması iş akışına kolayca dahil edilebilir ve bir ilaç taraması bağlamında yararlı olabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan üç yüksek lisans öğrencisi olan Vanessa Ramia ve Colin olacak: İlk olarak, 96'da Ateşböceği Luciferaz'ı ifade eden VSP Delta 51 kullanarak enfeksiyonları gerçekleştirin.

Bu plakalardan elde edilen doku kültürü plakaları süpernatantları, titreden 24 saat önce uygun bir inkübasyon süresinden sonra titre edilecektir. % 10 FBS 30 milimolar yığın ve% 1 penisilin streptomisin C, 2.5 kez 10 ila dördüncü hücre içeren DMEM'de mililitre başına 10 ila beşinci hücre konsantrasyonunda bir Vero hücresi süspansiyonu hazırlayın. Hücre süspansiyonunu hazırlamak için bir mikroplaka dağıtıcı kullanarak iyi beyaz, katı düz tabanlı plakalar, boruyu 50 mililitre steril su ile yıkayarak bir mikroplaka dağıtıcı kasetini temizleyin.

Daha sonra mikroplaka dağıtıcı hatlarını hücre süspansiyonu ile doldurun ve beş mililitre hücre süspansiyonunun akmasına izin verin. Beyaz duvarlı 96 kuyulu bir plaka dağıtımının her bir oyuğuna 100 mikrolitre dağıtacak bir program seçin ve ek plakalar için gerektiği kadar tekrarlayın. Ayrıca, hücre sağlığının ve yoğunluğunun doğrulanması için 96 kuyulu berrak beyaz bir alt plakaya birkaç kuyu tohumlayın.

Bittiğinde, hücreleri orijinal kabına geri yıkayın. Kaseti 50 mililitre% 70 etanol ve ardından borudan 50 mililitre ılık steril su geçirerek temizleyin. Bunu takiben,% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe hücreleri 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin.

Serum serbest DMEM'de standart bir VSV Delta 51 eğrisi hazırlayın, böylece Vero hücrelerine transferden sonra mililitre başına platform birimlerinin nihai konsantrasyonu aşağıdaki gibi olacaktır. Vero hücrelerinin plakası başına her konsantrasyondan 50 mikrolitre hazırlayın, ayrıca ekstra% 10 Standart eğri, 96 derin kuyucuklu bir plakaya aktarılabilir. Daha sonra, tek tabakaların en az% 95 birleşik trans transferi olduğunu doğrulamak için bir ışık mikroskobu altında şeffaf alt 96 oyuklu plakada kaplanmış Vero hücrelerini kontrol edin.

Belirlenen iki sütundaki Vero hücrelerine standart eğrinin her seyreltilmesinde 25 mikrolitrede 12 kanallı çok kanallı bir pipetleyici kullanılarak beyaz duvarlı plakalara oturtulmuş Vero hücreleri üzerine 25 mikrolitre numune süpernatanı. Plakaları oda sıcaklığında 430 Gs'de beş dakika santrifüjleyin. Daha sonra plakaları nemlendirilmiş% 5 karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede beş saat inkübe edin.

Bu noktada, virüs ve hücreler içeren 96 oyuklu numune plakasının her bir oyuğundaki hacmin% 10'una eşit bir miktarda zurin ekleyin. İki ila dört saat sonra, uyarma için 530 ila 560 ve emisyon raporu için 590 kullanarak sinyali bir floresan plaka okuyucu ile okuyun ve kaydedin. Aşağıdaki formüle göre numune için hücre canlılığı.

Beş saatlik inkübasyonun bitiminden 30 dakika önce, Lucifer'i steril fosfat tamponlu salin içinde mililitre başına iki miligram çözelti elde edecek şekilde hazırlayın. Luminometreye entegre edilmiş otomatik bir dağıtıcı ile beyaz katı plakalardaki her bir Vero hücresine 25 mikrolitre Lucifer'de beş saatlik inkübasyon süresinden sonra çözeltiyi ışıktan koruyun. Plakaları aşağıdaki parametrelerle okuyun.

Beş saniye çalkalayın ve 30 saniye bekleyin. Lüminesansı uygun bir sabit hassasiyetli eğik çizgi pozlama değerinde okuyun, ardından niceliksel biyolüminesan yoğunluğunu kaydedin ve kaydedin. Luciferian eklemek için otomatik bir dağıtıcı kullanılmışsa, luciferian'ı tünemek ve hatları steril su veya doğru sonuçlarla astarlamak, standart eğrilerden bir tepe denklemi oluşturmak için doğrusal olmayan regresyonu çözün.

Viral ekspresyon birimlerini hesaplamak için bu denklemi titreli numunelere uygulayın. VSV Delta 51'in tipik bir standart eğrisinin sonuçları burada gösterilmiştir veya parametre doğrusal olmayan regresyon analizi, bilinmeyen girdi oluşturma birimlerinin enterpolasyonunun yapılabileceği bir dolu grafiği oluşturmuştur. Vero hücreleri üzerinde standart plak tahlili ile elde edilen viral titreler, aynı numunelerden hesaplanan viral titreler ile karşılaştırıldı.

Yüksek verimli lusiferaz tahlil numuneleri kullanılarak titterasyon, VSV Delta 51 ve 7 8 6 0 hücrelerinin replikasyonunu ve yayılmasını arttırmak için çeşitli kimyasalların kullanıldığı bir deneyden kaynaklanmıştır. R karesi 0.8083 ve Pearsons R skoru 0.899 olan titreler ve viral ekspresyon birimleri arasındaki doğrusal korelasyon burada gösterilmiştir. Metabolik bir testten elde edilen tipik hücre sitotoksisite verileri, enfeksiyondan önce kimyasallarla tedavi edilen 7, 8, 6, 0 hücreleri için burada gösterilmiştir.

VSV Delta 51 ile, herpes simpleks virüsü, aşı virüsü ve adeno ilişkili virüs ile elde edilen tipik standart eğriler, ateşböceği lusiferazı ifade eden tümü burada görüntülenir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, titreler ve sitotoksisite verileri oluşturmak için ilgilendiğiniz virüsle birlikte bileşik kitaplıkların yüksek verimli ekranlarını yürütmek için kullanılabilir. Bu prosedürü denerken, viral ekspresyon birimlerinin enterpolasyonu için kritik olduğundan, standart eğriyi uygun şekilde seyreltmeyi unutmamak önemlidir.

Canlı virüslerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken biyolojik güvenlik kabininde çalışmak ve uygun kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, bilinmeyen viral ekspresyon birimlerinin enterpolasyonunda biyolüminesansın lusiferaz transgen ölçümünün ekspresyonuna dayanan yüksek verimli bir niceleme yöntemi kullanarak viral titrelerin nasıl tahmin edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Standart bir eğri örneğinden, sitotoksisite aynı anda uygun bir canlılık testi ile belirlenebilir.