Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

Aşağıdaki videonun genel amacı, bir memeli ekspresyon sistemi kullanarak iyi bir protein veya protein kompleksi verimi üretmek için basit ve uygun fiyatlı bir teknik göstermektir. Bu, HEC 2 93 F hücrelerinin, %5 karbondioksitte tutulan bir atmosfere sahip nemlendirilmiş bir çalkalama inkübatöründe süspansiyon halinde kültürlenmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, hücreler bir veya daha fazla yüksek kopya sayılı ekspresyon plazmidi ile geçici olarak transfekte edilir.

Transfeksiyon ajanı polietilen EIN veya PEI kullanılarak, hücrelerin hasattan önce 48 saat büyümesine izin verildi. Daha sonra afinite reçinesi kullanılarak protein saflaştırması gerçekleştirilir, ardından yapısal ve fonksiyonel çalışmalar yapmak için ilgilenilen protein kompleksini saflaştırmak için jel filtrasyonu yapılır. Sonuç olarak, bu uygun fiyatlı ve basit memeli ekspresyon sistemi, bakteri hücrelerinde eksprese edilmesi zor olan proteinlerin ve protein komplekslerinin ekspresyonunu ve saflaştırılmasını sağlar.

Bu yaklaşımın temel avantajı, protein komplekslerinin ekspresyonu için rahatlığı ve çok yönlülüğüdür. Bakterilerde protein yapmak kadar kolaydır, özellikle de protein ekspresyon vektörlerini karıştırıp eşleştirebildiğiniz için. Yöntem başlangıçta protein kompreslerinin ekspresyonunu test etmek için küçük ölçekte kullanılabilir, ancak iyi bir protein kompresi verimi elde etmek için kolayca ölçeklenebilir Yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için, başarının anahtarı, hücreleri bakteri veya maya enfeksiyonundan arınmış sağlıklı bir durumda tutmaktır.

Ortamdaki antibiyotikler protein veriminizi büyük ölçüde azaltır. Başlamak için, sıvı nitrojenden mililitre başına 20 milyon hücre yoğunluğunda bir mililitre HEC 2 9 3 F hücresi içeren bir kriyo şişesini çıkarın ve 37 santigrat derece su banyosunda hızla çözün. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek kümeleri ayırın ve tüm içeriği 34 mililitre Ön Isıtma ortamı içeren 250 mililitrelik bir konik hücre kültürü şişesine pipetleyin.

Kültürü, 48 saat sonra 37 santigrat derece, 120 RPM ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir yörünge sallama inkübatörüne yerleştirin. Trian mavisi ile hücre canlılığını kontrol edin. Bu aşamada normal hücre canlılığının boyanması, hücrelerin mililitrede yaklaşık 1 milyon hücre sayısına ulaşacağı zaman yaklaşık% 70'tir.

Bunları, 60 mililitre ön ısıtma ortamı içeren 250 mililitrelik bir konik hücre kültürü şişesine mililitrede 0.35 milyon hücrenin son sayımına kadar masaj yapın, hücrelere her 48 saatte bir veya mililitrede yaklaşık 2 milyon hücre miktarına ulaştıklarında masaj yapmaya devam edin. Burada, transfeksiyon hücreleri için tohumlanmaya hazır bir stoktan mililitrede 2.3 milyon hücrede Trian mavisi lekeli HEC 2 9 3 F hücrelerinin bir örneği gösterilmektedir, hücreler yalnızca tek veya bölünen hücreler olarak bulunmalıdır. Hücreler aşırı büyürse, büyük kümeler oluştururlar ve bu resimde gösterildiği gibi çok düşük bir canlılığa sahip olurlar.

Hücreler kümeler oluşturuyorsa, bunlar 25 saniye boyunca kuvvetli girdaplarla parçalanabilir. Başlamak için, büyük ölçekli kültürler, hücreleri mililitrede yarım milyon hücrede, her bir litrelik silindir şişede 300 mililitrelik bir nihai hacme tohumlar. Hücreler mililitre başına 1 milyon hücre yoğunluğuna ulaşana kadar 37 santigrat derece, 135 RPM ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir yörünge çalkalayıcıda 24 saat inkübe edin.

Daha sonra, toplam 300 mikrogram filtreyle sterilize edilmiş DNA'yı 30 mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS'ye pipetleyin ve üç saniye boyunca kuvvetlice girdap yapın. Ardından mililitre başına 1,2 mililitre 0,5 miligram ekleyin. Sterilize edilmiş PEI'yi PB SDNA çözeltisine filtreleyin ve üç saniye daha kuvvetlice girdaplayın.

Karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe ettikten sonra karışımı hücrelere ekleyin. Transfeksiyon, hücreleri nemlendirilmiş bir orbital çalkalama inkübatöründe 48 saat sonra 37 santigrat derece, 135 RPM ve %5 karbondioksitte 48 saat daha inkübe eder. Hücreleri beş dakika boyunca 3000 kez G'de santrifüjleyerek hücre içi proteinleri hasat edin.

Hücre peleti hemen kullanım için değilse, eksi 80 santigrat derecede saklanabilir. Bu protokol, proteinlerden birinin bayrak etiketine sahip olduğu çekirdekten protein komplekslerinin saflaştırılması için optimize edilmiştir. Saflaştırma resüsüne başlamak için, hücre paletini yaklaşık 40 mililitre önceden soğutulmuş lizise askıya alın, litre kültür başına tamponlayın, birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme kombinasyonu ve 15 saniye kapalı 15 saniyelik üç döngü için bir cam homojenizatör sonikat kullanın.

Daha sonra 108.000 kez G'nizi dört santigrat derecede 25 dakika boyunca santrifüjleyin ve sırtüstü natanı koruyun. Daha sonra, reçine dengeleme tamponu ile üç kez yıkayarak kültür litresi başına 1.2 mililitre Anti-Flag paketlenmiş aros reçinesini dengeleyin, tüm hücre ekstraktını temsil eden supinatı, bir veya daha fazla 50 mililitrelik santrifüj tüpünde afinite reçinesi ile temsil eder, 3000 kez G'de dört santigrat derece inkübasyon santrifüjünü takiben 30 ila 120 dakika boyunca dört santigrat derece boyunca hafifçe döndürün. Supinatı attıktan sonra, reçineyi 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve toplam 45 mililitre önceden soğutulmuş tamponla yıkayın, bir santrifüj önce ve ardından yüksek tuz tamponu kullanarak supinat tekrar yıkama ve santrifüjlemeyi atın, ardından düşük tuz tamponu ve TEV bölünme tamponu.

Her yıkamanın reçineyi tamamen yeniden süspanse etmek için yeterli olduğundan, ancak daha fazla olmadığından emin olun. Daha sonra, 10 mikrolitrelik bir reçine numunesi toplayın ve bağlı protein numunesini temsil edecek şekilde analiz için iki kez protein yükleme tamponunun bir hacmine seyreltin. İndirgeyici ajanlar kullanmayın çünkü bunlar antikoru reçineden serbest bırakacaktır.

Daha sonra reçineyi, orijinal kültürün litresi başına yaklaşık 40 mikrogram TEV proteazda 10 mililitre önceden soğutulmuş TEV bölünme tamponuna yeniden süspanse edin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın. TEV proteaz seviyeleri, eksprese protein miktarına göre optimize edilebilir. Ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede hafifçe döndürmeden önce protein oksidasyonunu önlemek için tüp atmosferini %100 nitrojen gazı ile değiştirin.

Numuneyi 10 dakika boyunca 3000 kez G'de santrifüjleyin, ardından supinatı uygun bir moleküler ağırlık kesimi ile ultra santrifüj bir filtreye aktarın ve 500 mikrolitreye kadar konsantre edin. Konsantre proteinin 10 mikrolitrelik bir örneğini toplayın ve analiz için iki kez protein yükleme tamponunun bir hacmine seyreltin. Bu numune, TEV elüat numunesini temsil eder.

Daha sonra reçinenin 10 mikrolitrelik bir örneğini toplayın ve iki kez protein yükleme tamponunun bir hacmine seyreltin. Bu numune, TEV sonrası reçine numunesini temsil eder. Bir sonraki adım, proteini bir boyut dışlama kolonundan geçirmektir ve ilgilenilen kompleksin boyutuna göre uygun jel filtrasyon matrisi kullanılmalıdır.

Bu durumda, 10 x 300 milimetre S 200 boyutlu bir dışlama kromatografisi sütunu A kullandık, boyut dışlama kromatografisi sütununu jel filtrasyon tamponu ile eşitler. Proteini 0,22 mikronluk bir filtreden süzün ve numuneyi kolona yükleyin. Kesirleri sütundan çıktıkları gibi toplamaya devam edin.

Son adım olarak, toplanan numuneler üzerinde SDS poli akrilamid jel elektroferezi veya SDS sayfası ve ayrıca jel filtrasyon fraksiyonları, histon DS SLA bir veya HD bir kusurlu susturma baskılayıcı üç veya SDS üç ve syn üç, Bir HDAC etkileşim alanı veya syn üç, Bir HID stabil bir döner kompleks oluşturur. Turny kompleksinin afinite saflaştırması SDS sayfası aracılığıyla gözlemlenebilir. Burada, iki litre hücreyi kesen manşon tarafından üretilen saflaştırılmış kompleks gösterilmektedir.

Bağlı protein şeridi, afinite reçinesine bağlı kompleksi gösterir. TEV sindirimini takiben, günah üç A HID üzerinde bulunan etiket parçalanır ve kompleksten ima edilir. Burada gösterilen reçine, 10 x 300 milimetre S 200 boyutlu bir dışlama kromatografi sütunu kullanılarak saflaştırılmış protein kompleksinin bir kromatogramıdır.

Saf kompleksin, çözeltide bir dimer oluşturduğu için boşluk hacmine yakın bir yerden kaçtığına dikkat edin. Son olarak, SDS sayfa analizi, jel filtrasyon fraksiyonlarındaki saflaştırılmış proteini ortaya çıkarır. Bu videoyu izledikten sonra, iki ve üç uygulama hücresinin nasıl büyütüleceğini, korunacağını ve cotran süspansiyonu ile yetiştirilen HEC iki ve üç uygulama hücrelerinin yanı sıra proteininizi nasıl afinite edeceğinizi, saflaştıracağınızı ve konsantre edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Karmaşık Sağlıklı hücreler, deneylerin başarısı için gerekli olacaktır, bu nedenle onların yetiştirildiğinden ve koşullarında ve geçişlerinde düzenli olarak muhafaza edildiklerinden emin olun. Doku kültürü sizi yanıltmasın. Yapısal biyologların memeli hücrelerinden büyük miktarlarda protein ve protein komplekslerini ifade etmesi ve saflaştırması kolaydır.