Name: Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Öğrenin, HEK 293F askı hücrelerinde rekombinant protein kompleksleri üretmek için uygun maliyetli bir memeli hücre ekspresyon sistemi. Bu yöntem, yapısal biyoloji çalışmaları için yüksek verimli protein saflaştırma sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bu iş ve Leicester Çekirdek Biyoteknoloji Hizmetleri Üniversitesi için kullanılan ifade yapıları hazırlamak için Dr Xiaowen Yang (PROTEX klonlama servisi) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma BBSRC öğrencilikle tarafından desteklenen, Wellcome Trust Programı ve Kıdemli Araştırmacı hibe WT085408 &amp; WT100237 ve BBSRC RM31G0224 hibe.

NOT: Protokol, bu nedenle reaktif hacimleri ve miktarları orantılı ölçekli gerektiğini ifade herhangi bir ölçek için uygundur. Uygun bir memeli ifade vektörü, bu protokol için kullanılmalıdır. Burada uygun bir klonlama (Şekil 1) ikinci sınırlama enzimleri seçimine bağlı olarak, bir afinite etiketi dahil veya hariç tutulması sağlayan değiştirilmiş pcDNA 3.1 sentezleme vektörünü kullandık. Aşağıdaki protokol, büyük ölçekli bir transfeksiyon açıklanmaktadır. 1 litrelik silindir şeklinde şişelerde geliştirilmiştir: 1. Büyük Ölçekli Kültür / transfeksiyonu Büyüme ve standart protokollere göre, süspansiyona adapte olmuş HEK293F hücreleri korumak. Tipik olarak 30 ila 100 ml &#39;lik başlangıç ​​kültürleri 250 ml konik bir hücre kültürü şişelerinde büyütülür. <ol><li> Her bir 1 litrelik silindir bir şişe içinde 300 ml lik bir son hacim için 0.5 x 10 6 hücre / ml tohum hücreleri. Not: Silindir şişe en fazla 150 ml &#39;lik bir minimum uyumSüspansiyon kültürünün 300 mi. Büyük ölçekli nakiller için birden fazla şişe kullanmayın. </li><li> Hücreler 1.0 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir yoğunluğa ulaşana kadar 37 ° C&#39;de bir orbital çalkalayıcı bir inkübatör içinde 24 saat 120 rpm&#39;de ve% 5 CO2 inkübe edin (hücreler yaklaşık olarak her 24 saatte bölmeliyiz). </li><li> Filtre ve sterilize edilen 300 ug DNA, toplam Pipet 3 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde 30 ml PBS ve girdap içine (tamamlayıcı şekli). Not: milyon başına transfekte edilmiş hücrelerin DNA 1 ug toplam kullanın. Iki ya da daha fazla plazmidin edilecek ise hücrelere DNA oranı sabit kalır, böylece her bir miktarını azaltmak birlikte-transfekte edilmiştir. </li><li> 1.2 ml 0.5 mg Ekle / 3 saniye boyunca kuvvetlice PBS / DNA çözümü ve vorteks PEI-süzülerek sterilize ml. </li><li> 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı. </li><li> DNA ekleme / PEI karışımı hücrelere - 1 x 10 6 hücre / ml (adım 1.3) de bir yoğunlukta olması gereken. </li><li> Müşterek transfeksiyon sonrasında hücreler inkübeBir başka 37 ° C de 48 saat, 120 rpm&#39;de ve% 5 CO2 boyunca orbital bir gece boyunca kuluçkaya yatırılmaktadırlar. </li><li> 5 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ile hücreler -80 ° C&#39;de saklayın pelet Hasat hücre içi proteinlerdir. Not: Alternatif olarak, kültür ortamı üzerinde% 5 CO2 ile değiştirilir ve şişe kapağı kapatılır değilse (CO2), kuluçka makinesi çalkalanarak bir standart kullanır. Atmosfer her bir geçit (normal olarak her 2 gün) ile değiştirilmesi gerekir. </li></ol> Tüm Hücre ekstresi 2. Protein saflaştırma kompleks Bu protokol, FLAG-etiketli proteinleri kullanılarak nükleer komplekslerinin saflaştırılması için optimize edilmiştir. <ol><li> Hücre topaklarını içine defrost ~ önceden soğutulmuş lizis tamponu, 40 ml (100 mM potasyum asetat, 50 mM Tris, pH 7.5,% 5 gliserol,% 0.3 Triton X-100, proteaz inhibitörleri) kültür bir L başına. </li><li> Yeniden askıya pipetleme ve birkaç kez aşağı pelet (köpük önlemek vorteks yapmak değil). </li&gt; <li> İyice bir cam homojenleştirici kullanılarak hücrelerin yeniden askıya. 3 siklus (15 sn, 15 sn kapalı) için sonikasyon. 4ºC&#39;de 25 dakika boyunca 30.000 x g&#39;de santrifüj ve süpernatant saklayın. </li><li> Dengeye reçine dengeleme tamponu (100 mM potasyum asetat, 50 mM Tris pH 7.5) ile üç kez yıkanarak kültürün her bir litresi için agaroz reçinesi paketlenmiş bir anti-flag 1.25 ml. </li><li> Bir ya da daha fazla 50 ml santrifüj tüplerine afinite reçinesiyle adım 2.3 bütün hücre ekstresi inkübe yavaşça 4 ° C&#39;de 30-120 dakika için örnek döndürün. </li><li> 4 ° C, ıskarta süpernatan 1 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Önceden soğutulmuş tampon 1 45 ml reçine ile yıkayın (100 mM potasyum asetat, 50 mM Tris, pH 7.5,% 5 gliserol,% 0.3 Triton X-100). 1 dakika boyunca 3.000 x g&#39;de santrifüj ve süpernatant atın. </li><li> Adımı tekrar 2.7 tuz tamponu kullanılarak düşük tuzlu tampon (50 mM potasyum asetat, 50 mM Tris pH 7 ile (300 mM potasyum asetat, 50 mM Tris pH 7.5,% 5 gliserol), ardından0,5,% 5 gliserol) TEV yarılması tamponu (50 mM potasyum asetat, 50 mM Tris, pH 7.5, 0.5 mM TCEP). NOT: Her yıkama emin olun tamamen artık reçine yeniden askıya ve yeterli kısa, yani olduğunu. </li><li> Reçine 10 ul numune toplamak ve analiz için 2x protein yükleme tamponu (bağlı protein kontrol) 1 hacim içine sulandırmak. Reçineden antikoru serbest önlemek için indirgeyici maddeler kullanmayın. </li><li> Bir 15 ml santrifüj tüpüne önceden soğutulmuş TEV yarılma tamponu ve transfer 8-10 ml reçine yeniden askıya. </li><li> Ekle ~ 40 orijinal kültür bir L başına (1 mg / ml stok) TEV proteaz ug ve birçok kez aşağı ve yukarı pipetlenerek ile iyice karıştırın. </li><li> Protein oksidasyonunu önlemek için% 100 N 2 gazı ile tüp atmosferi değiştirin. </li><li> Yavaşça 4ºC&#39;de O / N döndürmek. </li><li> 10 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj. Uygun bir molekül ağırlığı kesmesi ile bir ultra santrifüj filtre içine süpernatant aktarın ve konsantre500 ul kadar. </li><li> Konsantre protein, 10 ul numune toplamak ve analiz için 2x protein yükleme tamponu 1 hacim içine sulandırmak. (TEV kontrol sıyırma sıvısı). </li><li> Reçine, 10 ul numune toplayın ve analiz için 2x proteini yükleme tamponu içinde 1 hacim içine seyreltilir. Reçineden büyük miktarlarda antikor serbest önlemek amacıyla indirgeyici maddeler kullanmayın. (Post-TEV reçine kontrol). </li><li> Jel filtrasyon tamponu (50 mM potasyum asetat, 50 mM Tris pH 7.5, 0.5 mM TCEP) ile boyut dışlama kromatografisi kolonu dengelenmesi. </li><li> 0.22 um bir filtre ile filtre proteinini </li><li> Kolona numunenin yükleyin ve fraksiyonlarım toplamak. </li><li> Adım 2.9, 2.15 ve 2.16 ve analiz için bir SDS-PAGE ve Coomassie boyaması, adım 2.19 ikinci jel filtrasyon fraksiyonlardan çalıştırın örnekleri. Not: Bu, hedef proteininin ekspresyonunu doğrulamak için adımlar 2.9, 2.15 ve 2.16 önce jel süzülerek örnekler SDS-PAGE çalıştırmak için tavsiye edilir.</li>
</ol>

<ol><li>Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Current opinion in biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).</li>
<li>Aricescu, A. R., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+recombinant+glycoproteins+in+mammalian+cells%3A+towards+an+integrative+approach+to+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology.</a> Current opinion in structural biology. 23 (3), 345-356 (2013).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Boussif, O., Zanta, M. A., Behr, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+galenics+improve+in+vitro+gene+transfer+with+cationic+molecules+up+to+1000-fold%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Optimized galenics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1000-fold.</a> Gene therapy. 3 (12), 1074-1080 (1996).</li>
<li>Godbey, W. T., Wu, K. K., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+%28ethylenimine%29+and+its+role+in+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Poly (ethylenimine) and its role in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 60 ((2-3)), 149-160 (1999).</li>
<li>Beljelarskaya, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+systems+for+production+of+recombinant+proteins+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression systems for production of recombinant proteins in insect and mammalian cells.</a> Molecular Biology. 45 (1), 123-138 (2011).</li>
<li>Cregg, J. M., Vedvick, T. S., Raschke, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+expression+of+foreign+genes+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris.</a> Nature Biotechnology. 11 (8), 905-910 (1993).</li>
<li>Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+HDAC3+bound+to+co-repressor+and+inositol+tetraphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate.</a> Nature. 481 (7381), 335-340 (2013).</li>
<li>Millard, C. J., Watson, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I+HDACs+Share+a+Common+Mechanism+of+Regulation+by+Inositol+Phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Class I HDACs Share a Common Mechanism of Regulation by Inositol Phosphates.</a> Molecular Cell. 51 (1), 57-67 (2013).</li>
<li>Tom, R., Bisson, L., Durocher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+HEK293-EBNA1+Cells+in+Suspension+with+Linear+PEI+for+Production+of+Recombinant+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Transfection of HEK293-EBNA1 Cells in Suspension with Linear PEI for Production of Recombinant Proteins.</a> CSH protocols. , pdb.prot4977(2008).</li>
<li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), (2002).</li>
<li>Baldi, L., Muller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Gene+Expression+in+Suspension+HEK%E2%80%90293+Cells%3A+Application+to+Large%E2%80%90Scale+Protein+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Transient Gene Expression in Suspension HEK‐293 Cells: Application to Large‐Scale Protein Production.</a> Biotechnology Progress. 21 (1), 148-153 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu ifade ile, rekombinant proteinleri ve memeli hücrelerinden çoklu bir alt birim kompleksinin saflaştırılması için büyük miktarda (PEI&#39;ler ticari olarak temin edilebilen lipofilik transfeksiyon reaktifleri daha az maliyeti), bir basit ve uygun maliyetli bir yöntem geliştirdik. Protokol bölümünde tarif edildiği gibi, son derece saf DNA (260/280 1.8 ila 2.0) PEI ile bir arada kullanıldığında, optimum transfeksiyon ve ekspresyon etkinliği ulaşılabilir. Hücreler serum- ve antibiyotik içermeyen ortam içinde kültür olmalıdır, bu nedenle sıkı bir şekilde steril teknik pahalı ve zaman alıcı enfeksiyonları önlemek için pasaj ve transfekte hücreler için gereklidir. Hücre canlılığı,% 90 ya da daha yüksek olmalıdır ve kültürler 2.5 x 10 6 hücre daha yüksek yoğunlukları ile olmamalıdır / hemen transfeksiyondan önce, bu sayede protein verimini düşürür ml. Başarılı transfeksiyon için, kültürler, sadece tek ya da bölünen hücreleri içermelidir. Kümeler gayretle tarafından kırılmış olabilir30 sn (Şekil 5) için lı vorteksleme 20. Ko-transfeksiyon kullanılan her plazmid oranı incelenmiştir olan kompleks bir karma bilgisine göre kullanıcı tarafından değiştirilebilir. Bir kez uygun bir ekspresyon kurulabilir, böylece sentezlenmesi verimliliği, ilgilenilen protein için optimize edilebilir. Arıtma istenmeyen proteolitik bozulması riskini azaltmak için her zaman, protein numune soğuk tutmak yapılmalıdır. Genellikle daha düşük çözünürlük ve / veya enzimatik aktivite kaybı ile sonuçlanan, yapısal elemanlar veya belli proteinlerin aktif alanlarının müdahale edebilir yana etiketler ve saflaştırma tamponların seçimi kritiktir. Küçük ölçekli transfeksiyon, büyük protein komplekslerinin saflaştırılması için çeşitli konstruktlarının test edilmesi için özellikle yararlıdır. Bugün, farklı yöntem büyük bir çeşitlilik rekombinant proteinlerin ökariyotik (Tablo 2) ekspresyonu için kullanılabilir. Örneğin, Baculoviböcek hücrelerinde sentezleme rus yaygın olarak yüksek transdüksiyon verimliliği ve diğer viral türler 6 ile karşılaştırıldığında sitotoksisite eksikliğine bağlı olarak kullanılır. Bununla birlikte, virüs verme süreci, zaman alıcıdır ve istikrarsızlık virüs uzun süre saklanmasına izin vermez. Öte yandan, maya ekspresyon sistemleri, yüksek protein verimi 7 sonuçlanan fermentasyon kültürlerde hücre çok yüksek yoğunluklar büyüme ihtimalini sunmaktadır. Ama yine de doğru katlanmayacak ve protein partnerleri ile etkileşim için gereken ökariyotik proteinlerin post-translasyonel modifikasyonlar tam çeşitli yoksundur. HDAC3, örneğin, eksprese edilir, fakat E&#39;de bükülmemesini coli. 293F hücrelerinde ifade Ancak, onun ortak bastıncısı (SMRT) ve prokaryotik hücrelerde bulunmayan inositol tetrafosfat (IP4) 8, bir molekül ile kompleks aktif enzimin saflaştırılması mümkün. Bu yöntem ayrıca st arındırmak ve kristal çözmek için bize izin verdiHDAC1 üzerindeki etkisi benzer şekilde 9 IP4 aktive edilir nurd kompleksinde mta1 etkileşim kezlerinin. İdeal olarak, biz her zaman onların doğal, fizyolojik bir ortamda ökaryotik proteinleri ifade etmek istiyorum. Biyoreaktörler 10-12, HEK 293, EBNA1-hücreleri kullanan memeli ekspresyon sistemleri de tarif edilen ve proteininin çok yüksek seviyelerini elde edilmiştir, fakat bu kullanımı da karmaşıktır olabilir edilmiştir. Önerilen yöntem, bakteri, maya ve biyoreaktör sistemlerinde tanımlanması için basit ve erişilebilir bir alternatiftir. Ekspresyon yöntem hızlıdır ve silindir şişe, kavanoz bir atmosfer,% 5 CO2 ve standart çalkalanarak kuluçka kullanılan ile değiştirilir, özellikle pahalı ekipman kullanımını gerektirmez. Birden fazla plazmidler ortak transfeksiyonu ve kültürü içinde&gt; 1 mg / L&#39;lik bir verimle en fazla beş proteinlerle de kompleksler saflaştırmak için aşağıdaki protokol kullanılmıştır. İlginç bir şekilde, sistem kararlı uslu komplekslerinin tanımlanmasını sağlar. Örneğin, exHDAC1 ve Sin3A ikili kompleksinin sıkıştırma protein sınırlı verimlerini verdi, ancak SDS3 ilavesi daha yüksek miktarlarda 5-kat ve bu nedenle uygun yapılar ve kristalize edilmesine yönelik olarak kararlı kompleksler seçimi yapısal biyologdan kılavuzları ile sonuçlanmıştır.

Moleküler hücre biyolojisi hızlı ilerleme ve tıp geliştirilmiş ilaçların sürekli bir ihtiyaç yapısal biyologlar giderek daha karmaşık protein yapılarının bakmak için bir ihtiyaç yarattı. Bu genellikle karmaşık bir katlama ve enzimatik aktivitesini desteklemek için özel bir post-translasyonel modifikasyonlar, moleküler şaperonlar ve ko-faktörlerini de gerektirebilir. Bakteriyel ekspresyon sistemleri kullanılarak elde edilmiştir Protein Data Bank mevcut yapıların büyük çoğunluğu iken, prokaryotes bu değişiklikler çok sayıda yapamazsanız ve birçok temel ökaryot ko-faktörler yoksundur. Bu küçük sinyal molekülleri tarafından yanı sıra nükleer, hücre yüzeyinde ve ayrıntılı katlama makineleri gerektiren salgılanan proteinler aktive edilmiş büyük çok-alt birim komplekslerinin çalışma için bir sorun olabilir. E. bir dizi coli suşları bu sınırlamaların 1 bazılarının üstesinden gelmek için tasarlanmış edilmiştir. M Son yıllarda, ancak, kullanımonlar güvenilir diğer sistemlerde 2 ifade aksi takdirde sorunlu ökaryotik proteinler üretmek çünkü ammalian ifade sistemleri artmaktadır. Bugün kimyasal aracılığında transfeksiyon, viral transdüksiyon arasında değişen çeşitli teknikler vasıtasıyla kararlı ve geçici memeli ifadesi hücre çizgileri elde etmek mümkündür, örneğin elektroporasyon, doğrudan enjeksiyon 3 fiziksel gen transferi. Bu yöntemlerin hepsi avantaj ve dezavantajları kendi seti var ise, bunlardan sadece birkaç ya da çok pahalı ve / veya zaman alıcı olmak yapısal çalışmalar için uygundur. Burada askı büyümüş memeli hücrelerinde yapısal biyoloji, protein kompleksleri ifade etmek için, çok basit, hızlı, ucuz ama son derece etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Yaklaşım (örneğin, 293F Serbest HEK hücreleri) bir insan embriyonik böbrek (HEK) hücre hattının geçici ko-transfeksiyon kullanır. Bu hücreler, HEK 293 mesaf elde edilmiştirII hattı, serumsuz ortam kullanılarak yüksek yoğunluğa (örneğin 293 Antarctica sentezlenmesi ortamı) ulaşan, süspansiyon kültürleri içinde büyümeye adapte edilir. Hücreler, bundan sonra, geçici polietilenimin dallı bir versiyonu (PEI), endositoz 5 konak hücre içine girer, DNA / PEI kompleksleri oluşturarak memeli hücrelerinin 4 arasında geniş bir aralıkta çalışması için rapor edilmiş bir ucuz polimerik bir reaktif kullanılarak transfekte edilir. Bu yöntem büyük ölçekte (30 mi) ve (300 ml kadar) büyük ölçekli deneyler için uygundur ve saflaştırılmıştır protein komplekslerinin yüksek seviyelerde üretebilir. Bu kompleks bir katlama makineleri, ko-faktörler ya da bakteri, maya ve böcek hücreleri tarafından yapılamaz, özellikle post-translasyonel modifikasyonlar gerektiren protein çalışmaları için yararlıdır. Bu protokolde Sin3A transkripsiyonel represyon kompleksinden üç proteinin merkezi skafoldun ifadesi ve saflaştırılması sunuyoruz. Bu histon oluşmaktadırDeacetylase 1 (HDAC1), Arızalı suskunluğu 3 (SDS3) arasında Supresor ve Switch-bağımsız 3 (Sin3A). Arıtılmış karmaşık ve yüksek verimlilik kristallendirme çalışmalarında kullanılmaktadır.

<table><tbody><tr><td>FreeStyle HEK 293F hücreleri&nbsp;</td><td>LifeTechnologies</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle 293 İfade Orta</td><td>LifeTechnologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 Afinite Jeli</td><td>SIGMA</td><td>A220</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Havalandırmalı Kapaklı Erlenmeyer Şişesi</td><td>Corning</td><td>431144</td><td></td></tr><tr><td>Havalandırmalı kapaklı rulo şişeler</td><td>Corning</td><td>01836-02</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimin, 25 kDa, dallı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>H <2 / sub>O'da 0.5 mg / ml stokları yapın, seyreltik HCl ile pH'ı 7.0'a ayarlayın ve -20 - 4 &gtm'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Memeli ifade vektörü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (DPBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.22 ve mikro; m Santrifüj Filtre Üniteleri</td><td>Amicon</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Ultra santrifüj filtreler (10 kDa kesme)</td><td>Amicon</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Superdex&nbsp; 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr></tbody></table>

bir roman ve erişilebilir yaklaşım: yapısal hek 293f askı hücreleri biyoloji rekombinant protein

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

Büyük miktarlarda rekombinant protein komplekslerinin ekspresyonu ve saflaştırılması, yapısal biyoloji çalışmaları için temel bir gerekliliktir. Yirmi yılı aşkın bir süredir, E. coli gibi prokaryotik ekspresyon sistemleri, bilimsel literatüre maliyetli ve daha az verimli ökaryotik hücre dizileri üzerinde hakim olmuştur. Bakterilerde rekombinant proteinlerin eksprese edilmesinin verim ve maliyetleri açısından açık avantaja rağmen, spesifik kofaktörlerin, şaperonların ve translasyon sonrası modifikasyonların yokluğu, fonksiyon kaybına, yanlış katlanmaya neden olabilir ve bazı ökaryotik çok alt birim komplekslerinin, yüzey reseptörlerinin ve salgılanan proteinlerin protein-protein etkileşimlerini bozabilir. Memeli hücre ekspresyon sistemlerinin kullanılması, ökaryotik bir ekspresyon ortamı sağladıkları için bu dezavantajları giderebilir. Bununla birlikte, düşük protein verimleri ve bu tür yöntemlerin yüksek maliyetleri, yakın zamana kadar yapısal biyoloji için kullanımlarını sınırlamıştır. Burada, süspansiyon halinde yetiştirilen HEK (İnsan Embriyonik Böbrek) 293F hücrelerinin geçici transfeksiyonlarını gerçekleştirerek miligram miktarlarda proteini ifade etmek ve saflaştırmak için basit ve erişilebilir bir yöntemi açıklıyoruz.

Burada HDAC1, SDS3, Sin3A üçlü kompleksin bir 2 L (8 x 250 mi kültür) geçici ko-transfeksiyon ve saflaştırılmasını göstermektedir. HDAC1 üzerindeki etkisi ve SDS3 Sin3A bir HDAC-etkileşim alanı (HID) aracılığıyla Sin3A etkileşime girer. Kültürün litresi başına kompleksi 1 mg a kadar bir tipik saflaştırma ürünleri. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500"> Şekil değiştirilmiş pcDNA 3.1 ekspresyon vektörünün şematik 1.. Plazmid Sin3A amino terminusunda afinite etiketi TEV yarılma sitesini içermeli EcoRV ve EcoRI ile sindirildi. HDAC1 ve SDS3 arasında etiketlenmemiş sürümlerini klonlanması amacıyla, vektör Kpnl ve EcoRI ile sindirildi. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500"> Şekil 2. SDS-PAGE saflaştırma birinci aşamasını gösteren. "Bağlı protein," şerit afiniteli bir reçine bağlı kompleksini göstermektedir. Sindirme işlemini takiben, TEV, Sin3A-HID üzerinde etiketi mevcut keislir ve jelin ikinci ve üçüncü şerit gösterildiği gibi karmaşık reçineden elüe edilir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500"> Şekil protein kompleksi kullanılarak saflaştınldı boyut dışlama kromatografisi 3. kromatogramı. Bu çözelti içinde bir dimer oluşturur, çünkü saf kompleks boşluk hacminde elüt unutmayın. <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500"> Şekil 3'te gösterilen jel filtrasyon fraksiyonların gösteren Şekil 4, SDS-PAGE. 6 hücre / mL Ready 2.3x10 Şekil 5'de Tripan mavi boyalı HEK 293F transfekte edilebilecek hücreler. Büyük kümeler, yaklaşık 25 saniye boyunca kuvvetli bir girdap tarafından kırılmış olabilir iken, sadece hücreler, tek veya bölünen hücreler olarak mevcut olması gerekmektedir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Sorun </td><td> Olası nedenleri </td><td> Eylem </td></tr><tr><td rowspan="4"> Düşük protein verimi. </td><td> Düşük sayıda hücrelerin transfekte edildi. </td><td> Emin hücre yoğunluğu 1.0 x 10 6 kültüre transfeksiyon reaksiyon karışımının eklemeden önce yaklaşık olduğundan emin olun. </td></tr><tr><td> Hücreler çok kez pasajlandı olabilir. </td><td> Yaklaşık 90 geçişten sonra Taze stok hücrelerini kullanınyaşları. </td></tr><tr><td> DNA, düşmüş ya da yabancı maddeler, yüksek bir miktarda olabilir. </td><td> Emin plazmid DNA, kullanılmakta olan 1.8 ve 2.0 arasında bir 260/280 oranına sahiptir. Bir agaroz jeli üzerinde çalışan DNA kalitesini değerlendirmek için tavsiye edilir. </td></tr><tr><td> Protein (ler) olarak ifade edilen sabit ya da yeterince çözünür değildir. </td><td> Önce transfections ölçekleme yukarı-küçük ölçekli Farklı yapıları test edin. Emin etiketler ilgilenilen protein (ler) in yapısı ile karışmaz olun. </td></tr><tr><td> Hücreler bulutlu bakmak ve sıradışı renk ve / veya koku var. </td><td> Hücreler, bakteri ya da maya ile enfekte edilir. </td><td> İyi steril teknik her zaman için kullanılmalıdır. Laminer akış davlumbaz buharla dezenfekte eden ve enfeksiyon durumunda, hücre kültür odası UV dezenfekte sorunu içeren yardımcı olur. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Hücreler, düşük canlılığı sahiptir. </td><td> Medyada yanlış pH. </td><td> Emin kültürler CO 2% 5-8 yetiştirilen emin olunher zaman. </td></tr><tr><td> Hücreler 3.0x10 6 hücre / ml 'den fazla bir yoğunluğa kadar kültürlenmiştir. </td><td> Hücreler, 2.5 x 10 6 hücre / ml hemen önce transfeksiyon ve asla 6 10 x 3,0 Yukarıda sözü edilen hücreler / ml üzerinde yoğunluklara büyümüş olmamalıdır. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Afinite saflaştırma işe yaramadı </td><td> Protein (ler) olarak ifade varlık değildir. </td><td> Yukarıdaki bakın. </td></tr><tr><td> Arıtma koşulları yanlış olabilir. </td><td> (Örneğin, yüksek tuz, düşük tuz, pH). Tampon koşullarını ayarlayın </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Sorun Giderme. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Sistem </td><td> Avantajları </td><td> Dezavantajları </td></tr><tr><td> E.coli </td><td><ul><li> Hızlıifade sistemi </li><li> Yüksek protein verimi </li><li> Ucuz </li><li> Izotopik olarak etiketlenmiş proteinlerin uygun üretimi için uygun </li></ul></td><td><ul><li> Protein katlanması için gerekli olabilir önemli şaperonlar eksikliği </li><li> Birçok post-translasyonel modifikasyonlar eksikliği </li><li> Protein fonksiyonunun ve / veya karmaşık montaj için önemli olan ko-faktörlerini eksikliği olabilir. </li></ul></td></tr><tr><td> P. pastoris </td><td><ul><li> Translasyon sonrası modifikasyonlar çoğunluğu gerçekleştirebilir miyim </li><li> Ucuz </li></ul></td><td><ul><li> Bazı çeviri-sonrası tadilat Lack </li><li> Protein fonksiyonunun ve / veya karmaşık montaj için önemli olan ko-faktörlerini eksikliği olabilir. </li></ul></td></tr><tr><td> Böcek hücrelerinde baculovirüs tanım </td><td><ul><li> Tüm post translasyonel modifikasyonlar gerçekleştirebilirsiniz &lt;/ Li&gt; </li><li> Bakulovirüs diğer viral suşlar daha az sitotoksik olan </li></ul></td><td><ul><li> Transdüksiyon virüsü hazırlanması zaman alıcıdır </li><li> Virüs kararlı değildir ve uzun süreler boyunca saklanamaz </li><li> Böcek hücreleri, protein fonksiyonunun ve / veya karmaşık montaj için önemli olan ko-faktörlerini eksikliği olabilir. </li></ul></td></tr><tr><td> Memeli sistemleri Biyoreaktörler </td><td><ul><li> Tüm post translasyonel modifikasyonlar gerçekleştirebilir </li><li> Protein fonksiyonu ve karmaşık montaj için gerekli tüm kofaktörlere sağlayabilir </li><li> Çok yüksek yoğunluklarda Can Hücre kültürü </li><li> Karmaşık katlama makineleri gerektiren tüm memeli proteinleri ifade edebilir </li><li> Çok yüksek protein verimi </li></ul></td><td><ul><li> Biyoreaktörü kullanmak için uzman personel gerektirir. </li><li> Pahalı ekipman gerekmektedir. </li><li> Optimize ifade koşuls zaman alıcı olabilir. </li></ul></td></tr><tr><td> HEK hücreleri süspansiyon 293F </td><td><ul><li> Tüm post translasyonel modifikasyonlar gerçekleştirebilir </li><li> Protein fonksiyonu ve karmaşık montaj için gerekli tüm kofaktörlere sağlayabilir </li><li> Karmaşık katlama makineleri gerektiren tüm memeli proteinleri ifade edebilir </li><li> Hızlı ve sezgisel transfeksiyon protokolü </li><li> Biyoreaktörler ve / veya diğer ticari olarak temin edilebilen transfeksiyon reaktifleri ile karşılaştırıldığında nispeten pahalı olmayan bir. </li></ul></td><td><ul><li> Bakterilerde ifadesi olarak olsa da uygun fiyatlı, ucuz değil </li></ul></td></tr></tbody></table> Tablo 2. Avantajları ve ana sentezleme sistemlerinin dezavantajları.

Memeli sistemleri tarafından rekombinant proteinlerin ekspresyonu, yapısal biyoloji için protein kompleksleri üretmek için çekici bir yöntem haline geliyor. Burada, yapısal çalışmalar için protein komplekslerini saflaştırmak için süspansiyonda yetiştirilen memeli hücrelerini kullanan basit ama oldukça verimli bir ekspresyon sistemi sunuyoruz.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

Aşağıdaki videonun genel amacı, bir memeli ekspresyon sistemi kullanarak iyi bir protein veya protein kompleksi verimi üretmek için basit ve uygun fiyatlı bir teknik göstermektir. Bu, HEC 2 93 F hücrelerinin, %5 karbondioksitte tutulan bir atmosfere sahip nemlendirilmiş bir çalkalama inkübatöründe süspansiyon halinde kültürlenmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, hücreler bir veya daha fazla yüksek kopya sayılı ekspresyon plazmidi ile geçici olarak transfekte edilir.Transfeksiyon ajanı polietilen EIN veya PEI kullanılarak, hücrelerin hasattan önce 48 saat büyümesine izin verildi. Daha sonra afinite reçinesi kullanılarak protein saflaştırması gerçekleştirilir, ardından yapısal ve fonksiyonel çalışmalar yapmak için ilgilenilen protein kompleksini saflaştırmak için jel filtrasyonu yapılır. Sonuç olarak, bu uygun fiyatlı ve basit memeli ekspresyon sistemi, bakteri hücrelerinde eksprese edilmesi zor olan proteinlerin ve protein komplekslerinin ekspresyonunu ve saflaştırılmasını sağlar.Bu yaklaşımın temel avantajı, protein komplekslerinin ekspresyonu için rahatlığı ve çok yönlülüğüdür. Bakterilerde protein yapmak kadar kolaydır, özellikle de protein ekspresyon vektörlerini karıştırıp eşleştirebildiğiniz için. Yöntem başlangıçta protein kompreslerinin ekspresyonunu test etmek için küçük ölçekte kullanılabilir, ancak iyi bir protein kompresi verimi elde etmek için kolayca ölçeklenebilir Yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için, başarının anahtarı, hücreleri bakteri veya maya enfeksiyonundan arınmış sağlıklı bir durumda tutmaktır.Ortamdaki antibiyotikler protein veriminizi büyük ölçüde azaltır. Başlamak için, sıvı nitrojenden mililitre başına 20 milyon hücre yoğunluğunda bir mililitre HEC 2 9 3 F hücresi içeren bir kriyo şişesini çıkarın ve 37 santigrat derece su banyosunda hızla çözün. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek kümeleri ayırın ve tüm içeriği 34 mililitre Ön Isıtma ortamı içeren 250 mililitrelik bir konik hücre kültürü şişesine pipetleyin.Kültürü, 48 saat sonra 37 santigrat derece, 120 RPM ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir yörünge sallama inkübatörüne yerleştirin. Trian mavisi ile hücre canlılığını kontrol edin. Bu aşamada normal hücre canlılığının boyanması, hücrelerin mililitrede yaklaşık 1 milyon hücre sayısına ulaşacağı zaman yaklaşık% 70'tir.Bunları, 60 mililitre ön ısıtma ortamı içeren 250 mililitrelik bir konik hücre kültürü şişesine mililitrede 0.35 milyon hücrenin son sayımına kadar masaj yapın, hücrelere her 48 saatte bir veya mililitrede yaklaşık 2 milyon hücre miktarına ulaştıklarında masaj yapmaya devam edin. Burada, transfeksiyon hücreleri için tohumlanmaya hazır bir stoktan mililitrede 2.3 milyon hücrede Trian mavisi lekeli HEC 2 9 3 F hücrelerinin bir örneği gösterilmektedir, hücreler yalnızca tek veya bölünen hücreler olarak bulunmalıdır. Hücreler aşırı büyürse, büyük kümeler oluştururlar ve bu resimde gösterildiği gibi çok düşük bir canlılığa sahip olurlar.Hücreler kümeler oluşturuyorsa, bunlar 25 saniye boyunca kuvvetli girdaplarla parçalanabilir. Başlamak için, büyük ölçekli kültürler, hücreleri mililitrede yarım milyon hücrede, her bir litrelik silindir şişede 300 mililitrelik bir nihai hacme tohumlar. Hücreler mililitre başına 1 milyon hücre yoğunluğuna ulaşana kadar 37 santigrat derece, 135 RPM ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir yörünge çalkalayıcıda 24 saat inkübe edin.Daha sonra, toplam 300 mikrogram filtreyle sterilize edilmiş DNA'yı 30 mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS'ye pipetleyin ve üç saniye boyunca kuvvetlice girdap yapın. Ardından mililitre başına 1,2 mililitre 0,5 miligram ekleyin. Sterilize edilmiş PEI'yi PB SDNA çözeltisine filtreleyin ve üç saniye daha kuvvetlice girdaplayın.Karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe ettikten sonra karışımı hücrelere ekleyin. Transfeksiyon, hücreleri nemlendirilmiş bir orbital çalkalama inkübatöründe 48 saat sonra 37 santigrat derece, 135 RPM ve %5 karbondioksitte 48 saat daha inkübe eder. Hücreleri beş dakika boyunca 3000 kez G'de santrifüjleyerek hücre içi proteinleri hasat edin.Hücre peleti hemen kullanım için değilse, eksi 80 santigrat derecede saklanabilir. Bu protokol, proteinlerden birinin bayrak etiketine sahip olduğu çekirdekten protein komplekslerinin saflaştırılması için optimize edilmiştir. Saflaştırma resüsüne başlamak için, hücre paletini yaklaşık 40 mililitre önceden soğutulmuş lizise askıya alın, litre kültür başına tamponlayın, birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme kombinasyonu ve 15 saniye kapalı 15 saniyelik üç döngü için bir cam homojenizatör sonikat kullanın.Daha sonra 108.000 kez G'nizi dört santigrat derecede 25 dakika boyunca santrifüjleyin ve sırtüstü natanı koruyun. Daha sonra, reçine dengeleme tamponu ile üç kez yıkayarak kültür litresi başına 1.2 mililitre Anti-Flag paketlenmiş aros reçinesini dengeleyin, tüm hücre ekstraktını temsil eden supinatı, bir veya daha fazla 50 mililitrelik santrifüj tüpünde afinite reçinesi ile temsil eder, 3000 kez G'de dört santigrat derece inkübasyon santrifüjünü takiben 30 ila 120 dakika boyunca dört santigrat derece boyunca hafifçe döndürün. Supinatı attıktan sonra, reçineyi 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve toplam 45 mililitre önceden soğutulmuş tamponla yıkayın, bir santrifüj önce ve ardından yüksek tuz tamponu kullanarak supinat tekrar yıkama ve santrifüjlemeyi atın, ardından düşük tuz tamponu ve TEV bölünme tamponu.Her yıkamanın reçineyi tamamen yeniden süspanse etmek için yeterli olduğundan, ancak daha fazla olmadığından emin olun. Daha sonra, 10 mikrolitrelik bir reçine numunesi toplayın ve bağlı protein numunesini temsil edecek şekilde analiz için iki kez protein yükleme tamponunun bir hacmine seyreltin. İndirgeyici ajanlar kullanmayın çünkü bunlar antikoru reçineden serbest bırakacaktır.Daha sonra reçineyi, orijinal kültürün litresi başına yaklaşık 40 mikrogram TEV proteazda 10 mililitre önceden soğutulmuş TEV bölünme tamponuna yeniden süspanse edin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın. TEV proteaz seviyeleri, eksprese protein miktarına göre optimize edilebilir. Ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede hafifçe döndürmeden önce protein oksidasyonunu önlemek için tüp atmosferini %100 nitrojen gazı ile değiştirin.Numuneyi 10 dakika boyunca 3000 kez G'de santrifüjleyin, ardından supinatı uygun bir moleküler ağırlık kesimi ile ultra santrifüj bir filtreye aktarın ve 500 mikrolitreye kadar konsantre edin. Konsantre proteinin 10 mikrolitrelik bir örneğini toplayın ve analiz için iki kez protein yükleme tamponunun bir hacmine seyreltin. Bu numune, TEV elüat numunesini temsil eder.Daha sonra reçinenin 10 mikrolitrelik bir örneğini toplayın ve iki kez protein yükleme tamponunun bir hacmine seyreltin. Bu numune, TEV sonrası reçine numunesini temsil eder. Bir sonraki adım, proteini bir boyut dışlama kolonundan geçirmektir ve ilgilenilen kompleksin boyutuna göre uygun jel filtrasyon matrisi kullanılmalıdır.Bu durumda, 10 x 300 milimetre S 200 boyutlu bir dışlama kromatografisi sütunu A kullandık, boyut dışlama kromatografisi sütununu jel filtrasyon tamponu ile eşitler. Proteini 0,22 mikronluk bir filtreden süzün ve numuneyi kolona yükleyin. Kesirleri sütundan çıktıkları gibi toplamaya devam edin.Son adım olarak, toplanan numuneler üzerinde SDS poli akrilamid jel elektroferezi veya SDS sayfası ve ayrıca jel filtrasyon fraksiyonları, histon DS SLA bir veya HD bir kusurlu susturma baskılayıcı üç veya SDS üç ve syn üç, Bir HDAC etkileşim alanı veya syn üç, Bir HID stabil bir döner kompleks oluşturur. Turny kompleksinin afinite saflaştırması SDS sayfası aracılığıyla gözlemlenebilir. Burada, iki litre hücreyi kesen manşon tarafından üretilen saflaştırılmış kompleks gösterilmektedir.Bağlı protein şeridi, afinite reçinesine bağlı kompleksi gösterir. TEV sindirimini takiben, günah üç A HID üzerinde bulunan etiket parçalanır ve kompleksten ima edilir. Burada gösterilen reçine, 10 x 300 milimetre S 200 boyutlu bir dışlama kromatografi sütunu kullanılarak saflaştırılmış protein kompleksinin bir kromatogramıdır.Saf kompleksin, çözeltide bir dimer oluşturduğu için boşluk hacmine yakın bir yerden kaçtığına dikkat edin. Son olarak, SDS sayfa analizi, jel filtrasyon fraksiyonlarındaki saflaştırılmış proteini ortaya çıkarır. Bu videoyu izledikten sonra, iki ve üç uygulama hücresinin nasıl büyütüleceğini, korunacağını ve cotran süspansiyonu ile yetiştirilen HEC iki ve üç uygulama hücrelerinin yanı sıra proteininizi nasıl afinite edeceğinizi, saflaştıracağınızı ve konsantre edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.Karmaşık Sağlıklı hücreler, deneylerin başarısı için gerekli olacaktır, bu nedenle onların yetiştirildiğinden ve koşullarında ve geçişlerinde düzenli olarak muhafaza edildiklerinden emin olun. Doku kültürü sizi yanıltmasın. Yapısal biyologların memeli hücrelerinden büyük miktarlarda protein ve protein komplekslerini ifade etmesi ve saflaştırması kolaydır.

recombinant-protein-expression-for-structural-biology-hek-293f

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Protein transdüksiyon biyolojik olarak aktif proteinler hücre içine doğrudan teslim sağlar. DNA transfeksiyon veya viral transdüksiyon gibi geleneksel yöntemler yerine, aksine bu non-invaziv bir paradigma hücresel toksisite ve kalıcı genetik modifikasyon onkojenik transformasyon riskini engellemeyi titrasyon bir şekilde yüksek verimli hücresel manipülasyon sağlar.

Mühendislik Hücre geçirgen Protein

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Kindlins İntegrinlerin yoluyla hücre yapışması temel vardır ama bunların çalışmalar bakteriyel konaklarda rekombinant olarak bunları ifade karşılaşılan zorluk engel olmuştur. Burada bakulovirüs ile enfekte olmuş böcek hücrelerinde bunların verimli üretimi için yöntemleri tarif eder.

Verimli Üretimi ve Saflaştırılması Rekombinant murin kindlin-3 Biophysical Çalışmaları Böcek hücrelerinden

Biyotinile füzyon proteinleri geliştirerek araştırma çeşitli alanlarda birçok potansiyel uygulamalar vardır. Yeniden birleştirici protein mühendisliği özel olarak tasarlanmış proteinlerin yüksek verim sağlayan, düşük maliyetli olan bir düz ön işlemdir.

Sinir doku rejenerasyonu için Çözünür ve Çözünmeyen Biyotinile Proteinlerin ifade, izolasyon ve saflaştırılması

Tarama kantitatif, yüksek miktarda ifade ve küçük ölçekli Escherichia coli kültürlerinden füzyon proteinlerinin saflaştırılması için analitik bir protokol tarif disülfid zengin hayvansal protein zehir hedeflerin ekspresyonu uygulanır.

Üretilen Rekombinant Disülfid zengin Venom Proteinler Uygulanan Yüksek Randımanlı Sayısal Anlatım Tarama ve Arıtma<em&gt; E. coli</em

Bu, salgılanan, glikosile edilmiş memeli proteinlerinin üretimi ve ardından X-ışını kristalografisi ve diğer biyofiziksel çalışmalar için yeterli homojen protein verimi ile tek aşamalı saflaştırma için hızlı, uygun maliyetli bir protokoldür.

Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Ökaryotik proteinlerin uygun translasyon sonrası modifikasyonla laboratuvar ölçeğinde üretimi önemli bir engel teşkil etmektedir. İşte bir memeli ekspresyon sistemi kullanarak protein ekspresyonu için hızlı kuruluş ve geri dönüşe sahip sağlam bir protokol. Bu sistem, seçici amino asidi, proteinlerin seçici etiketlenmesini ve glikan bileşiminin küçük molekül modülatörlerini destekler.

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

Nonlytic böcek hücresi ifade sistemleri üretim, selüler trafik / lokalizasyonu ve rekombinant protein, fonksiyonel analiz için atıl edilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen bir lepidopteran hücresi çizgilerinde ifade vektörleri ve daha sonra geçici protein sentezlenmesinin üretilmesi için yöntemleri tarif eder. Hücre içi fluoresan işaretleyici proteinleri ile Bemisia tabaci aquaporins eş yerleşimi de sunulmuştur.

Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme

İnsan zarı taşıyıcılarının yapısal ve biyokimyasal çalışmaları, miligram miktarlarda kararlı, sağlam ve homojen protein gerektirir. Burada, kodon için optimize edilmiş genleri kullanarak insan çözünen taşıyıcı taşıyıcıları taramak, eksprese etmek ve saflaştırmak için ölçeklenebilir yöntemleri açıklıyoruz.

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması

Bu protokol, rekombinant insan SLFN14 ribonükleazının üretimini ve kütle fotometrisiyle stoikiyometrik analizini tanımlar.<br...

Rekombinant İnsan SLFN14 ribonükleazının hızlı üretimi ve kütle fotometrisi ile stoikiyometrik analiz

Öğrenin, HEK 293F askı hücrelerinde rekombinant protein kompleksleri üretmek için uygun maliyetli bir memeli hücre ekspresyon sistemi. Bu yöntem, yapısal biyoloji çalışmaları için yüksek verimli protein saflaştırma sağlar.

Bir Roman ve Erişilebilir Yaklaşım: Yapısal HEK 293F Askı Hücreleri Biyoloji Rekombinant Protein

Daha fazla video keşfet