Name: Bir İn Vitro Globoid Hücre lökodistrofi Hücresel Patofizyoloji Çalışması Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Keşfedin, mikroglial hücrelerin globoid hücrelere dönüşümünü in vitro kültür modelinde. Siklin toksini etkilerini ve fagositik yeteneği immünofloresan mikroskopi ile değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Ulusal Multipl Skleroz Derneği'nden (RG 5001-A-3'ten SJC'ye), Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (NS065808 ERB'ye; NS078392'den SJC'ye), UConn Sağlık Merkezi'nden (SJC'ye) ve Kim Aile Fonu'ndan (CHIC'yi destekleyen UCHC) başlangıç fonları.

Hayvanları ile ilgili tüm prosedürler Insancıl Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımına İlişkin Politikasına uygun olarak yapıldı Laboratuvarı Hayvan Refahı Dairesi (NIH) tarafından ve yalnızca Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) onayı ile belirlenen Connecticut Sağlık Merkezi. Karışık Glial Kültürler 1. Hazırlık <ol><li> Kullanmadan önce tüm aletleri sterilize edin. Soğuk muhafaza etmek için buz üzerinde muhafaza üç steril, 60 mm Petri tabaklarına (Mg 2 + ya da Ca +2) herhangi bir katyonları içeren buz soğukluğunda steril Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 3 ml ilave edilir. </li><li> Daha önce 17,18 açıklandığı gibi, doğum sonrası P0-P2 fare yavrularından korteks izole eder. NOT: Hipokampuslardan gibi subkortikal yapıları, bu kültürlerde dahil değildir. </li><li> Bir pı kullanarak, dikkatlice meninksler kaldırmak ve daha sonra taze HBSS&#39;nin için izole korteks aktarmak ve enzimatik dokuları ayırmaküreticinin protokolüne uygun olarak ural doku diseksiyon kiti. </li><li> Plaka steril, T-175 şişeleri içine hücre ve ortam içinde bir gece boyunca inkübe [Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamı 1 x penisilin / streptomisin ve% 10 fetal sığır serumu ile (FCS) (FBS)]. </li><li> Taze medya ile ertesi gün tüm medyayı değiştirin. Yaklaşık 3 hafta süreyle veya bir hücresel mono-katman kurulana kadar, normal ortam değişiklikleri ile kültürleri inkübe devam edin. Not: 1 oranında 19: Bu tek-katmanın, yaklaşık 10, astrositler ve mikroglia oluşacaktır. </li></ol> Karışık Glial Kültürlerde 2. Globoid Hücre İndüksiyon <ol><li> ECM-kaplı lamelleri hazırlayın. <ol><li> 30 dakika boyunca Steril bir Petri tabağında steril 1 N hidroklorik asit (HCI) olan dairesel lamelleri ıslatın. Steril su 3x lamelleri yıkayın ve sonra en az 20 dakika boyunca% 95 EtOH içinde bekletin. ve sonra hava kurumaya bırakın. </li><li> Sulandırılmış dışı MATR Yeri damlacıklarıParafilm bir levha üzerine ix (ECM), protein bir kaplama maddesi (ml steril fosfat tampon çözeltisi içinde çözüldü, laminin 10 ug / örneğin, 150-250 ul / damlacık [PBS]). Bu damlacıklar üzerine yerleştirildiğinde lamelleri dokunmaz böylece damlacıkların dağıtın. Yavaşça forseps kullanarak bir damlacık üzerine her kurutulur lamel yerleştirin. </li><li> Yaklaşık damlacıklarının lamelleri bırakın. Kanat ile kültürü kaputu içinde 4-6 saat kapalı. </li><li> 24 oyuklu plakanın oyuklarından her ECM içine kaplı lamelleri (ECM ile kaplanmış tarafı) yerleştirin. Steril PBS içinde 3 kat ile de her bir yıkama, ve gerekli olana kadar, 4 ° C&#39;de tutun. </li></ol></li><li> Lameller üzerine Kaplama için Glial hücreler hazırlanıyor. <ol><li> Glial kültürlerden ortamı aspire ve yavaşça steril, 10 ml PBS ile glial tek tabaka 3 kez yıkayın. Ardından, T-175 8-10 ml tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 37 ° C&#39;de 5-10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Tek tabaka en ayrıldıktan sonra, tam bir ortamda 20 ml ekleyinşişeye tripsinizasyon durdurun. 50 ml&#39;lik konik bir tüp içine müstakil hücreleri ihtiva eden ortam toplayın ve oda sıcaklığında 300 x g&#39;de 10 dakika boyunca dönerler. </li><li> Yavaşça P1000 pipeti kullanılarak çözeltisinin pipetlenmesiyle taze tam ortam, 2 ml hücrelerin yeniden askıya daha sonra pelet bozmadan süpernatanı havalandırın, ve. </li><li> Istenen yoğunluğa (ör: 10 5 hücre / ml) tam ortam içinde hücrelerin askıya ve sonra tekrar bir hemositometre kullanılarak hücre sayısını belirlemek. ECM ile kaplanmış lamelleri (24 oyuklu plakanın her oyuğuna örneğin 500 ul) üzerine hücreleri Plate. 37 ° C&#39;de inkübasyon her bir göze, 3-5 gün boyunca ek taze tamamlanmış ortam ekleyin, ya da hücrelerin istenilen görsel ortak akışa kadar büyümeye kadar. </li></ol></li><li> Psychosine ile tedavi. <ol><li> Bir stok konsantrasyonu dimetil sülfoksit (108,3 mM) içerir (DMSO) psychosine sulandırın. Bir çalışma stoğu elde etmek üzere% 100 EtOH içinde bu stokunu çıkarabilenn, 10 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna ilave edilebilir. </li><li> Psychosine eklenmesi zamanda, kültür ortamı içine yavaşça psychosine karıştırmak için kültür plakası girdap. Bir hafta boyunca 10 uM her gün eşdeğer ekleyerek psychosine Ek. </li></ol></li><li> Psychosine tedaviden 7 gün sonra, ortam ve her kuyuya, soğuk% 4 paraformaldehit (PFA) pipetle 500 ul toplamak. 20 dakika sonra, hücrelerin tespit edilmeleri için oda sıcaklığında inkübe edilir. Daha sonra, her bir göze, PBS ile yıkayın ve 3x (aşağıya bakınız) İmmünositokimya için işlenene kadar 4 ° C&#39;de plakalar tutun. Not: istenirse hücre kültür ortamı, bu noktada enzimatik ya da ELISA tahlili için toplanabilir. </li></ol> 3. İmmünositokimya (ICC) Globoid Hücreleri Visualize&#39;a <ol><li> Buffer [PBS +% 0.3 Tween-20 +% 5 normal keçi serumu (NGS)] bloke PBS ile değiştirin ve oda sıcaklığında 1 saat için kuluçkalayın. </li><li> InIBA-1 karşı yapılan ilk antisera olarak sabit hücreler cubate [(1: 1000) PBS içinde seyreltilmiş + 0.3 +% 2 NGS% Tween-20], oda sıcaklığında en az 1 saat, daha sonra, PBS ile 5 dakika 3x, her oyuğa yıkama / yıkayın. </li><li> Çekirdekleri tespit etmek: 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI 1000, 1) sahip antikor etiketleme ve karşı leke birincil tanımlamak için uygun bir ikincil floresan-konjuge antikor ekleyin. Oda sıcaklığında 1 st için bir ikincil antikor çözeltisi içinde inkübe ve PBS ile 5 dakika 3x ile yıkayın. </li><li> Bir montaj orta kullanarak slaytlar mikroskop her coverglass monte edin. Görsel ve kantitatif analizler için bir floresan mikroskop gör slaytlar. </li></ol> 4. Analiz ve İlköğretim Kültür Globoid Hücrelerinin Karakterizasyonu <ol><li> Kültüründe globoid hücreyi tanımlamak için aşağıdaki üç morfolojik kriterleri kullanın: <ol><li> , Mikrogliyal işaretleyici için immünopozitif etiketleme tarafından İba-1 + floresan mikroskobu kullanarak globoid hücreleri tanımlayın. </li><li> Belirlemek-çekirdekli (örneğin iki ya da daha DAPI pozitif çekirdeklerin) halinde globoid hücreleri. </li><li> Mikroglial hücrelerinde dinlenme yüksek ölçüde dallanmış görünümünü farklı yuvarlak bir morfolojisi ile globoid hücrelerin belirlenmesi. Not: Hücreler, aynı zamanda bu kültürlerden akış sitometrisi ile hücre yüzey markör analizi ve miktar tayini için toplanabilir. </li></ol></li><li> Mikroglia ve globoid hücrelerinin fagositik aktivasyonunu ölçülmesi <ol><li> Psychosine ile muamele mikroglia fagositik aktivitesini değerlendirmek için, üreticinin talimatlarına uygun olarak kuyu FITC ile işaretlenmiş lateks boncuk ekleyin. Önceden PFA ile tespit için flüoresan konjuge edilmiş lateks boncukları 48 saat ekleyin. (3. bölümde açıklandığı gibi) immünsitokimya (2.4 bölümde belirtildiği gibi) boncuklarla işlenmiş hücreleri, ve süreç Fix. </li><li> Bunlar fluorofor etiketli boncukların floresan emisyon spektrumlarına örtüşmeyen böylece fluorofor-konjuge sekonder antikor seçin. </li><li> AnalyzE Bu hücrelerin belirlenmesi ile IBA-1 + mikroglia phagocytotic profilleri floresan etiketli boncuklar ile birlikte lokalize. NOT: Psychosine mikroglianın aktive edecektir. Fagosite boncuk bu kültür ortamında mononükleer ve çok çekirdekli İba-1 + hücreleri içinde tespit edilecektir. </li></ol></li></ol> Saf Mikroglial KÜLTÜRLERİNDEN Globoid Hücreleri 5. İndüksiyon Not: astrosit ve mikroglia arasında hücreler arası sinyal deşifre alternatif bir yolu, in vitro globoid hücre modelinin bir diğer avantajdır. Aşağıdaki adımlardan (Bölüm 5.2) de tarif edildiği gibi ya da ko-şarjı kültür için ana mikroglial hücrelerinin saflaştırılması, kültür içerisinde daha düşük bir yapışma özelliği elde edilebilir. <ol><li> 50 mL konik tüp içine birleşik karışık kültürlerden glial ortamı toplayın ve inkübatör içinde 37 ° C&#39;de korumak. </li><li> İlköğretim Karışık Glial KÜLTÜRLERİNDEN Mikroglial İzolasyon.<ol><li> Konfluent karışık kültür glial T175 şişesi ortamı çıkarılmasından sonra, [+ 25 mM 4-(2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), 25 mM + sodyum bikarbonat (Sigma) ile tam bir ortam maddelerini kapsayan] sıcak çalkalama ortamı eklenir. 100 rpm&#39;de (37 ° C) bir yörüngesel karıştırıcıda 3-4 saat boyunca çalkalama. 50 ml konik tüpler içine bu sarsıldı matara medyayı toplayın. NOT: Bu ortam şişelerden daha az yapışık mikroglianın içerecektir. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de ortamı Spin. Astrosit-işlemi görmüş ortam 2 ml hücrelerin yeniden askıya sonra süpernatan aspire ve (adım 5.1 toplanmıştır). </li><li> Bir hemasitometre kullanarak ve daha sonra alt-tabaka ile kaplanmış kapak slipleri üzerine mikroglial hücreleri plaka elde edilen hücre sayısını belirlemek için imünosito kimyasal olarak (bakınız bölüm 2.1), ya da diğer hücre tipleri ile ko-kültür için globoid hücre gelecek toplanması için, ultra yapışma gözlü levhalar üzerine plaka, Böyle oligodendrositlerin gibi (azalan olarak) Aşağıdaki bölümde ribed. NOT: Bir kez mikroglia (2.3 bölümü) yukarıda tarif edildiği gibi psychosine (10 uM) ile muamele edilebilir kaplama. </li></ol></li><li> Sitotoksisite Analizi için birincil oligodendrositler ile aynı kültür. Not: Primer oligodendrosit kültürleri, veya oligodendrosit progenitör hücreler üzerine takip eden ko-kültür için düşük yapışkan plakalardan psychosine ile muamele edilmiş mikroglia toplanması, bu in vitro globoid benzeri hücrelerin sitotoksik potansiyel işlevini incelemek için kullanılabilir. <ol><li> Kurulmuş yöntemleri 18,20 kullanılarak primer oligodendrositlerin kültürlerini geliştirme. Psychosine ile muamele mikroglia toplamak için, hafifçe kuyu altından gevşek bir biçimde bulunan hücreler ayırmak için pipetleyin. 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de, santrifüj hücreleri toplamak, ve daha sonra dikkatli bir şekilde, Neuro temelli ortam oluşan oligodendrosit farklılaşma medya [tekrar süspansiyon, L-glutamin (1x), B-27 ek (1x) ve triiyodotironin (T 3, 10 ng / ml )]. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısını ve daha sonra yaklaşık 1 ile sonuçlanır, 1 x 10 5 hücre / ml oligodendrosit bir kültüre mikroglia tohum: 2 mikroglia / oligodendrosit oranı. En fazla 3 gün boyunca ko-kültür olarak inkübe edin. </li><li> Immünsitokimya hücreleri saptamak (bölüm 2.4). ELISA için hücre kültürü ortamı toplayın ya da gerektiği gibi kimyasal analizler. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+deletion+together+with+a+point+mutation+in+the+GALC+gene+is+a+common+mutant+allele+in+patients+with+infantile+Krabbe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease.</a> Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).</li>
<li>Duffner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-term+outcomes+of+presymptomatic+infants+transplanted+for+Krabbe+disease%3A+report+of+the+workshop+held+on+July+11+and+12%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Med%22%5BJournal%5D)">The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12.</a> Genet Med. 11, Holiday Valley, New York. 450-454 (2008).</li>
<li>Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hunter%27s+Hope+Krabbe+family+database%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">The Hunter's Hope Krabbe family database.</a> Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).</li>
<li>Duffner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newborn+screening+for+Krabbe+disease%3A+the+New+York+State+model%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model.</a> Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).</li>
<li>Krabbe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+familial%2C+infantile+form+of+brain+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A new familial, infantile form of brain sclerosis.</a> Brain. 39, 74-114 (1916).</li>
<li>Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globoid+cell+leukodystrophy%3A+comparison+of+neuropathology+with+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging.</a> Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).</li>
<li>Itoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+study+of+globoid+cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Dev%22%5BJournal%5D)">Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy.</a> Brain Dev. 24, 284-290 (2002).</li>
<li>Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+pathology+progresses+independently+of+KC+and+CXCR2+in+globoid-cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>McNally, A. K., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+fusion+and+multinucleated+giant+cells+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation.</a> Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).</li>
<li>Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+immunohistochemistry+as+a+marker+for+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia.</a> Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).</li>
<li>Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microglial+cytoskeleton%3A+vimentin+is+localized+within+activated+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ.</a> J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).</li>
<li>Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+counteract+demyelination+in+a+mouse+model+of+globoid+cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy.</a> J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).</li>
<li>Pollanen, M. S., Brody, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+globoid+cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Fetal globoid cell leukodystrophy.</a> Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).</li>
<li>Martin, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+Krabbe+leukodystrophy.+A+morphologic+study+of+two+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases.</a> Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).</li>
<li>Ijichi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP-3+mediates+psychosine-induced+globoid+cell+formation%3A+Implications+for+leukodystrophy+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology.</a> Glia. , (2013).</li>
<li>Pellegatta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+neural+stem%2Fprogenitor+cells+in+murine+globoid+cell+leukodystrophy+is+conditioned+by+macrophage%2Fmicroglia+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation.</a> Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).</li>
<li>Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+agonist-specific+regulation+of+genes+for+matrix+metalloproteinases+and+their+tissue+inhibitors+by+primary+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+establish+microglia-free+astrocyte+cultures%3A+comparison+of+matrix+metalloproteinase+expression+profiles+in+pure+cultures+of+astrocytes+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia.</a> Glia. 56, 1187-1198 (2008).</li>
<li>Moore, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+Tissue+Inhibitor+of+Metalloproteinase-1+%28TIMP-1%29+Promotes+Oligodendrocyte+Differentiation+and+Enhances+CNS+Myelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination.</a> J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).</li>
<li>Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O'Dowd, B. F., Lynch, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+molecular+target+of+psychosine+and+its+role+in+globoid+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation.</a> J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Burada tarif edilen protokol geliştirilmesi ve aktif mikroglia ve globoid hücrelerin fonksiyonel karakterizasyonu incelemek için olan yeni bir model sistemi sağlar. Im ve arkadaşları tarafından önceki iş. Bir HEK293 hücre hattı kullanılarak globoid hücre oluşumu 21 çalışma için mevcut protokol geliştirilmesi için bir şablon sağladı. Bu modelde elde edilen hücreler globoid GLD tanımlanabilir doğal globoid hücrelerden farklı olduğuna işaret etmek de önemlidir. GLD yılında globoid hücreler sıklıkla 10 ç...

Ayrıca, Krabbe hastalığı olarak da bilinir globoid hücre lökodistrofi (MP), galatocerebrosidase (galc) geni 1 mutasyonlar işlev kaybı olmasından kaynaklanan öldürücü bir demiyeline eden bir hastalıktır. GLD en yaygın şekli, erken çocukluk döneminde başlayan verebiliriz ve genellikle yaş 2,3 beş yaşından önce motor ve erken ölüme yol açan bilişsel gerileme agresif bir klinik seyri ile karakterizedir infantil çeşididir. Genetik test GLD 4 tanısını doğrulamak için kullanılır. GLD Nöropatoloji globoid hücreler 5-7 adlandırılan yaygın demiyelinasyon, nöronal atrofi, ve astrogliyozun tıkanmış çok çekirdekli mikroglia varlığını ortaya koymaktadır. Bu göze çarpan hücrelerinin spesifik işlevi belirsiz kalmıştır rağmen bunların sitoplazmalarında tubulous inklüzyonları içeren globoid hücrelerin tanımlanması, son 97 yıldır GLD belirleyici bir özelliğidir. Olmayan MYEL katılımlarıGLD patogenezinde bertaraf eder glial (mikroglia ve astrositler) bu kadar uzun süre hastalık 8 derin demiyelinasyon ikincil yanıt olarak kabul edilmiştir. İlginçtir, 1916 5 Knud Krabbe tarafından yapılan bu hastalığın ilk açıklama, adını almış lipit enkaz içeren çok çekirdekli fagositlerin bildirdi oluşumu &#39;hücreleri GLOBOID&#39; ve bu hastalığın belirleyici bir özelliği vardır. GLD rollerini uzun ihmal edilmiş olsa Globoid hücreleri, GLD patoloji damgasını özelliğidir. İlginç bir şekilde, bu hücreler GLD CNS dokusunun bir erken karakteristik değişikliklere arasındadır. Bu bilgi eksikliği nedeniyle çok çekirdekli fagositler, diğer hastalıklar olarak adlandırılan dev hücrelerin oluşumu, tipik olarak, bir ilk patojenik itici gücü 9 daha patoloji sonucu olarak kabul edilir olduğu varsayımına olabilir. Bu nedenle, WHI tarafından mekanizmasını araştıran az sayıda çalışma vardırkanal globoid hücreleri özellikle GLD CNS&#39;de, fagositoz oluşturulur. Bu raporda açıklanan prosedür CNS&#39;de globoid hücre formasyonunun önemi ve fagositik aktivite daha yüksek seviyede sergilediği in vitro mikroglia ve bu hücrelerin bu psychosine kaynaklı multinükleasyon önceki gösteri odaklanmaktadır. Bu gözlemlerle tutarlı olarak, titrek beyinlerinde globoid fagositik hücreleri sıklıkla yüksek düzeyde aktivite gösteren, PAS pozitif kalıntı içermektedir. Globoid hücreler de ferritin için immünopozitif bulunmuştur (Mikroglia işaretleyici) 10, KP-1 / CD68 (bir monosit işaretleyici), ve biraz da vimentin için pozitif (bir ara filament proteini ve astrositlerde işaretleyici ve aktif mikroglia) 11, HLA DRA (MHC II bir yüzey reseptörü) ve TNF-α 7 ve IBA-1 12 (mikroglia tanımlamak için kullanılan bir kalsiyum bağlayıcı protein). Belirteçlerin bu koleksiyon dayanarak, globoid hücreleri geliştirmek mikrogliada kaynaklananeşsiz bir fenotip. Onların teklik rağmen, belirli bir işlevi ve GLD patogeneze GClerin katkısı büyük ölçüde gözardı edilmiştir. Globoid hücreleri kronik bir demyelinizasyon ikincil sonucu olarak düşünülmektedir. Ancak, GLD beyaz cevher patoloji globoid hücrelerin zamansal ilişkiyi ele geçmiş çalışmaların erken doğum sonrası dönemlere geç embriyonik içinde globoid hücrelerin varlığını tespit ettik; olgodendrosit apoptoz ve aleni demiyelinizasyonu 13 önceki kez. Böylece gld içinde nöropatolojinin gelişme zamansal dizisi globoid hücreleri bu hastalığın 14 demyelinasyon önceden oluşturulmuş olduğunu göstermektedir. Bu GLD içinde globoid hücrelerin erken oluşumu olgodendrosit hasar 15 ikincil reaktif tepki yerine tanımlayan bir patojenik olayı temsil edebilir bizim hipoteze. Ayrıca, GLD mikrogliyal aktivite düzensizliği facto bir kabul edilmiştirR, bu hastalığın tedavi edilmesi için 16 hematopeotic kök hücre tedavilerinin uzun vadeli etkisini azaltır. Böylece, psychosine yanıt hücresel fonksiyonları ve mikroglianın düzenleme ve globoid hücreleri, soruşturma GLD patogenezinde yeni anlayışlar sağlaması bekleniyor. Yakın zamana kadar, globoid hücre oluşumunu incelemek için uygun bir modelin eksikliği kesin fonksiyonu ve GLD patolojiye bu hücrelerin katkı anlayış olamadı. Son zamanlarda yapılan araştırmalarda, bu globoid benzeri hücreler gld biriken patojenik toksin lipit psychosine doğrudan tepki olarak oluşturulabilir olduğu belirlenmiştir. O mikroglia değil, ancak makrofajlar, aktive edilmiş ve 15 psychosine karşılık olarak birincil kültürde globoid glial hücrelere transforme edilir. Globoid hücrelere Bu dönüşüm, hücre dışı proteaz, matris metaloproteinaz (MMP) -3 15 aracılık ettiği bulunmuştur. Daha yakın zamanlarda,Bu in vitro model sisteminde geliştirilen psychosine-aktif mikroglia ve globoid hücreler genişletilmiş ve bu bulguları belirledikten oligodendrosit ve oligodendrosit projenitör hücreler için potansiyel olarak toksik değildir. Bu nedenle, GLD, psychosine ve bu hastalıkta mikroglia için, ortaya çıkan ilk ve muhtemelen patojenik bir rol destekleyecektir demiyelinasyon önce globoid hücrelerinin oluşumunun erken birikimi bağlamında dikkati çekmektedir. Biz bu hastalığın anlaşılmasına katkıda bulunacaktır GLD patogenezi hakkında yeni bilgiler ortaya çıkacaktır globoid hücresi oluşumu bu çalışmayı öneriyorum. Dahası, GLD bu yeni hücresel modelin yeni tedavi yaklaşımları, bu hastalığın patolojik değişiklikler test edilebilir hitap hangi yeni bir biçimi sağlayabilir. Bu nedenle, bu raporda non-myelinating glia primer kültürlerinde psychosine kaynaklı globoid hücrelerinin in vitro olarak geliştirilmesi için ayrıntılı bir protokol sağlar.

<table><tbody><tr><td>Hank' katyon içermeyen dengeli tuz çözeltisi (HBSS) (Mg2+ ve Ca2+).</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Nöral Doku Ayrışma Kiti</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>40 & # 956; m hücre süzgeci</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Hank' katyonlar (Mg2+ ve Ca2+) içeren dengeli tuz çözeltisi (HBSS).</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>25299-056</td><td></td></tr><tr><td>Psikosin</td><td>Sigma</td><td>P9256</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td> <td>Elektron Mikroskobu Bilimi</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu (NGS)</td> <td>İnvitrojen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Iba-1</td><td>WAKO</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor konjuge antisera</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>Montaj Ortamları</td><td>Southern Biotech</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>Fagositik Test Kiti</td><td>Cayman Kimyasalları</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>BP310-500</td><td></td></tr></tbody></table>

bir İn vitro globoid hücre lökodistrofi hücresel patofizyoloji Çalışması modeli

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid hücre lökodistrofi (GLD) merkezi sinir sisteminde benzersiz bol miktarda globoid hücreler olarak adlandırılan, çok-çekirdekli mikroglia işlevi tam, açık değildir. Bilginin bu boşluk çalışma için bir in vitro model uygun olmaması ile engellenmiştir. Bu yazıda, bir ilköğretim kemirgen glial kültür sistemi açıklanmaktadır GLD bulunan karakteristik globoid hücrelerini andıran mikroglianın multinükleasyon içinde psychosine sonuçları ile hangi tedavi olarak. Bu roman sistemi kullanarak, biz globoid hücrelerin çalışması için koşulları ve analiz modları tanımlanır. Bu model sisteminin potansiyel kullanım matriks metalloproteinaz (MMP) için potansiyel bir rol tespit önceki çalışmamızda, geçerliliği -3 GLD içinde. Vitro sistemde bu yeni bu eşsiz hücrelerin oluşumu ve işlevi, hem de potansiyel tedavi edici işleme, çalışılacak yararlı bir model olabilir.

Bu protokol, yazılı olarak, bitirmek (: Deneysel Akışı Şeması Bkz: Şekil 1) baştan tamamlamak için yaklaşık 36 gün sürmesi bekleniyor. Bu, birincil kültür sisteminde 'globoid benzeri' hücrelerin gelişimi, güvenilir ve tekrarlanabilir bir nitelikte olduğu deneyim olmuştur: psychosine yanıt olarak çok çekirdekli hücrelerinin oluşumu sürekli tedaviden 7 gün ile görülmektedir. Büyük bir tespit edilmesine olanak verecektir nükleer karşı-boya ile bağlantılı olarak IBA-1 kullanılar...

Globoid hücreler, şu anda etkili bir uzun süreli tedavisi olmayan bir lökodistrofi olan Krabbe hastalığının tanımlayıcı bir patolojik özelliğidir. Aktive edilmiş mikrogliaların doğuştan gelen biyolojisini ve patojenik potansiyelini ve bunların globoid hücrelere dönüşümünü incelemek için bir hücre kültürü modeli geliştirdik.

Bir İn Vitro Globoid Hücre lökodistrofi Hücresel Patofizyoloji Çalışması Modeli

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Bu prosedürün genel amacı, toksin siklin varlığında mikroglia'nın GLO hücrelerine benzersiz dönüşümünü göstermektir. Bu, ilk olarak kapak fişlerinin hücre dışı matriks proteinleri ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci aşamada, glial hücreler örtü fişleri üzerine kaplanır ve daha sonra kültürlere siklin ve lateks boncuklar uygulanır.Son adımda, hücreler immünokimya ile boyanır. Sonuç olarak, siklinin mikroglial hücrelerin çekirdeklenme ve fagositik yeteneği üzerindeki etkileri immünofloresan mikroskopi ile değerlendirilebilir. Bu tekniğin mikroglial hücre hatlarının kullanımı gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, birincil glial kültürlerin kullanımının, GLO boşluklu hücreli lökodistrofi veya GLD'li bireylerin beyinlerinde I astrositleri ve mikroglia arasındaki varsayımsal etkileşimleri taklit etmesidir ve prosedürü gösteren KO Claycomb, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır.Hücre dışı matrisi veya ECM kaplı lamele fişlerini hazırlamak için, önce dairesel klozetleri steril bir Petri kabına steril hidroklorik asit ile batırın. 30 dakika sonra, kapak fişlerini üç kez steril suyla yıkayın ve ardından en az 20 dakika boyunca %95 etanol içinde bekletin. Kapak fişlerinin kurumasına izin verdikten sonra, 150 ila 250 mikrolitrelik seyreltilmiş ECM protein kaplama malzemesi damlacıklarını, damlacıkları yerleştirdikten sonra üst üste binmeyecek şekilde dağıtan bir paraform tabakasına ekleyin.Daha sonra, her bir damlacığın üzerine nazikçe bir kapak fişi yerleştirmek için forseps kullanın ve ardından paraformu, dört ila altı saat sonra kanat kapalı olarak bir hücre kültürü başlığının içine yerleştirin, kapak fişlerini ECM kaplı tarafı yukarı bakacak şekilde 24 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirin. Daha sonra her bir kuyuyu steril PB S3 ile yıkayın ve kapak fişlerini dört santigrat derecede saklayın. Glial hücreleri kapak kızaklarına kaplamaya hazırlamak için, ortamı glial hücre kültürlerinden aspire edin ve ardından tek katmanları 10 mililitre steril PBS ile üç kez nazikçe yıkayın.Hücreleri beş ila 10 dakika sonra sekiz ila 10 mililitre tripsin EDTA ile ayırın. 37 santigrat derecede, reaksiyonu durdurmak için şişeye 20 mililitre tam ortam ekleyin. Daha sonra hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri 10 dakika boyunca döndürün.300 Gs ve oda sıcaklığında, damağı iki mililitre taze, eksiksiz ortamda nazikçe yeniden süspanse etmek için bir P 1000 kullanın. Saydıktan sonra, hücreleri mililitre başına yaklaşık bir kez 10 ila beşinci hücreye seyreltin. Şimdi 500 mikrolitre hücreyi ECM kaplı kapak kızaklarının her birine yerleştirin.Her bir oyuğa ilave taze tam ortam ekleyin ve ardından plakayı üç ila beş gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreler istenen birleşmeye ulaştığında, her bir oyuğa taze hazırlanmış siklin ekleyin ve karıştırmak için kültür plakasını hafifçe döndürün. Bir haftalık siklin tedavisinden sonra, ortamı toplayın ve hücreleri oda sıcaklığında oyuk başına 500 mikrolitre soğuk,% 4 para formaldehit içinde sabitleyin.Daha sonra her bir kuyuyu PBS ile üç kez yıkayın ve plakaları dört santigrat derecede saklayın. GLO hücrelerini immünosito kimyası ile görselleştirmek için, önce PBS'yi bloke edici tampon ile değiştirin ve hücreleri oda sıcaklığında inkübe edin. Bir saat sonra, hücreleri oda sıcaklığında en az bir saat boyunca mikroglia işaretleyici IO'ya karşı birincil antiserumlarda inkübe edin ve daha sonra her bir kuyucuğu PBS'de beş dakika boyunca üç kez yıkayın.Hücreleri uygun floresan konjuge ikincil antikor ile inkübe ettikten sonra, çekirdekleri tanımlamak için hücreleri DAPI ile karşı boyayın. Daha sonra hücreleri az önce gösterildiği gibi yıkadıktan sonra, her bir kapak kızağını ayrı mikroskop slaytlarına monte etmek için montaj ortamını kullanın ve slaytları görsel ve kantitatif analiz için bir floresan mikroskopta görüntüleyin. Siklin muamelesinden sonra, ancak fiksasyondan önce, siklin ile muamele edilen mikroglia'nın fagositik aktivitesini değerlendirmek için, üreticinin ve talimatlara uygun olarak her G OID hücre kültürüne FITC etiketli lateks boncuklar ekleyin.48 saat sonra, hücreleri az önce gösterildiği gibi PFA'da sabitleyin ve ardından hücreleri gösterildiği gibi immünokimya için işleyin. Son olarak, floresan mikroskobu immünokimyasal ile floresan etiketli boncuklarla birlikte lokalize olan IBO bir pozitif mikroglia sayısını değerlendirin. Mikroglia'nın bir nükleer karşı boyama ile birlikte IO one kullanılarak boyanması, büyük yuvarlak çok çekirdekli hücrelerin tanımlanmasını sağlar.Birçok durumda, çekirdeğin boyutunun brüt büyümesinin, bu görüntüde gözlemlendiği gibi bu hücrelerin çok çekirdekli durumunu yansıttığına dikkat edin, siklin tedavisi ayrıca, tek çekirdekli mikroglia'nın PHA asidik aktivitesindeki bir artışla ölçülebilen mikroglia'nın genelleştirilmiş bir aktivasyonunu çağrıştırır, yanı sıra çok çekirdekli GLO hücreleri. Bu temsili görüntüde gözlemlendiği gibi, IBO bir pozitif mikroglia'nın PHA Asidik aktif profilleri, oligodendrosit progenitör hücreleri ile ko-kültür sırasında kolayca tanımlanabilir. Bu tekniğin etkileri, siklin tedavisine yanıt olarak bu çok çekirdekli hücrelerin oluşumu GLD nöropatolojisinin tanımlayıcı bir özelliği olduğundan ve bu hücrelerin bu patolojiye katkısı daha önce bu şekilde araştırılmadığından, GLD tedavisine kadar uzanır.

an-vitro-model-for-study-cellular-pathophysiology-globoid-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, fetal spinal kablolarından Glial Yasak Öncüleri derivasyon özetliyor ve transplantasyon için veya oligodendrocytic soyunun çalışma için ya in vitro korunmuştur.

E13 farelerin Glial Yasak Öncüleri türetilmesi

Video, oligodendrosit öncü hücrelerini (OPC'ler) oligodendrositlere farklılaştırmak ve dorsal kök ganglion (DRG) nöronları ile bir ko-kültürde miyelinasyonu indüklemek için bir protokolü göstermektedir. OPC'ler, miyelinasyonu düzenleyen bir sinyal proteinini kodlayan lentiviral vektörlerle dönüştürülür. Dönüştürülen OPC'ler, oligodendrositlere farklılaşmayı ve sinyal proteini kaynaklı miyelinasyonu değerlendirmek için DRG nöronları ile birlikte kültürlenir.

Oligodendrosit Öncü Hücreleri için İn Vitro Transdüksiyonla İndüklenen Miyelinasyon Testi

Burada, geliştirmek için sistematik bir yaklaşım sunmak fizyolojik, ilgili duyarlı ve...

Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

Floklanmış, koşullu onkojenik alellerle tasarlanmış ve viral Cre aracılı rekombinasyon yoluyla transforme edilmiş farelerden toplanan fenotipik vahşi tip astrositler ve nöral kök hücreler, astrositom patogenezini modellemek için kullanılabilir in vitro ve in vivo dönüştürülmüş hücrelerin sinjeneik, bağışıklığı yetkin yavruların beyinlerine ortotopik enjeksiyonu ile.

Modelleme Astrositom Patogenez İn Vitro Ve In Vivo Kortikal Astrositler veya Şartlı, Genetiği fareler ile Nöral Kök Hücreler kullanma

Burada, oligodendrosit öncü hücrelerini, merkezi sinir sistemi miyelinasyonunun in vitro modeli aracılığıyla oligodendrositlerdeki rollerini spesifik olarak sorgulamak amacıyla, ilgilenilen proteinleri aşırı eksprese etmek üzere viral olarak manipüle etmek için esnek ve stratejik bir temel sunan protokoller sunuyoruz.

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için İn Vitro Myelinasyon Tahliller

İnflamatuar demiyelinizan bozuklukların kortikal lezyonlarında demiyelinizasyon ve nöronal apoptoz mekanizmalarını ele almak için farklı hayvan modelleri kullanılır. Biz burada, beyin dilimlerinde oligodendrosit spesifik CD8 + T hücreleri kullanarak, oligodendroglial ve nöronal ölümle sonuçlanan ex vivo bir yaklaşımı tanımladık. Modelin potansiyel uygulamaları ve sınırlılıkları tartışılmıştır.

Bir Ex vivo Akut Beyin Dilimleri bir Oligodendrosit yönelik T-Hücre Saldırı Modeli

Burada, lenfositlerin merkezi sinir sistemine in vitro göçünü araştırmayı sağlayan bir insan kan-beyin bariyeri modelini açıklıyoruz.

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Bu raporda, organotypic ve fare kaynaklı dorsal kök gangliyon Disosiye birincil kültürler avantajları ile nöron gliyal etkileşim, nöroplastisite ilişkili mekanizmaları geniş bir araştırmaya vurgulanır, neuroinflammation ve viral enfeksiyon yanıt.

Yetişkin fare DRG Explant ve nöroplastisite ve Viral enfeksiyon da dahil olmak üzere çevre hakaret yanıtlar araştırmak için hücre modelleri ayrışmış

Bu teknik amacı birincil motoneurons (MNs) fare omurilik üzerinden zenginleştirilmiş kültürünün hazırlamaktır. Tarif MN hastalıklar neden mutasyonlar sonuçlarını değerlendirmek için biz burada bu yalıtım MNs ve onların transfection magnetofection tarafından izole.

Fare birincil Motoneurons Transfecting tarafından Charcot Marie Tooth hastalığı Vitro modelleme

Beyin organoidleri, Mitokondriyal Ensefalomiyopati, Laktik Asidoz ve İnme benzeri ataklar (MELAS) çalışmaları için değerli bir model görevi görerek, bunların altında yatan patofizyolojiye dair içgörüler sunar ve ilaç taraması için bir platform sağlar. Hastalığa neden olan genlerin değişen seviyelerde heteroplazmisine sahip hücre dizilerinden türetilen organoidler, önemli fenotipik farklılıklar sergiler.

Beyin Organoidleri Kullanılarak Mitokondriyal Hastalığın Modellenmesi: Mitokondriyal Ensefalomiyopati, Laktik Asidoz ve İnme Benzeri Epizodlara Odaklanma

Keşfedin, mikroglial hücrelerin globoid hücrelere dönüşümünü in vitro kültür modelinde. Siklin toksini etkilerini ve fagositik yeteneği immünofloresan mikroskopi ile değerlendirin.

Bir İn Vitro Globoid Hücre lökodistrofi Hücresel Patofizyoloji Çalışması Modeli

Daha fazla video keşfet