Bir İn Vitro Globoid Hücre lökodistrofi Hücresel Patofizyoloji Çalışması Modeli

Bu prosedürün genel amacı, toksin siklin varlığında mikroglia'nın GLO hücrelerine benzersiz dönüşümünü göstermektir. Bu, ilk olarak kapak fişlerinin hücre dışı matriks proteinleri ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci aşamada, glial hücreler örtü fişleri üzerine kaplanır ve daha sonra kültürlere siklin ve lateks boncuklar uygulanır.

Son adımda, hücreler immünokimya ile boyanır. Sonuç olarak, siklinin mikroglial hücrelerin çekirdeklenme ve fagositik yeteneği üzerindeki etkileri immünofloresan mikroskopi ile değerlendirilebilir. Bu tekniğin mikroglial hücre hatlarının kullanımı gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, birincil glial kültürlerin kullanımının, GLO boşluklu hücreli lökodistrofi veya GLD'li bireylerin beyinlerinde I astrositleri ve mikroglia arasındaki varsayımsal etkileşimleri taklit etmesidir ve prosedürü gösteren KO Claycomb, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır.

Hücre dışı matrisi veya ECM kaplı lamele fişlerini hazırlamak için, önce dairesel klozetleri steril bir Petri kabına steril hidroklorik asit ile batırın. 30 dakika sonra, kapak fişlerini üç kez steril suyla yıkayın ve ardından en az 20 dakika boyunca %95 etanol içinde bekletin. Kapak fişlerinin kurumasına izin verdikten sonra, 150 ila 250 mikrolitrelik seyreltilmiş ECM protein kaplama malzemesi damlacıklarını, damlacıkları yerleştirdikten sonra üst üste binmeyecek şekilde dağıtan bir paraform tabakasına ekleyin.

Daha sonra, her bir damlacığın üzerine nazikçe bir kapak fişi yerleştirmek için forseps kullanın ve ardından paraformu, dört ila altı saat sonra kanat kapalı olarak bir hücre kültürü başlığının içine yerleştirin, kapak fişlerini ECM kaplı tarafı yukarı bakacak şekilde 24 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirin. Daha sonra her bir kuyuyu steril PB S3 ile yıkayın ve kapak fişlerini dört santigrat derecede saklayın. Glial hücreleri kapak kızaklarına kaplamaya hazırlamak için, ortamı glial hücre kültürlerinden aspire edin ve ardından tek katmanları 10 mililitre steril PBS ile üç kez nazikçe yıkayın.

Hücreleri beş ila 10 dakika sonra sekiz ila 10 mililitre tripsin EDTA ile ayırın. 37 santigrat derecede, reaksiyonu durdurmak için şişeye 20 mililitre tam ortam ekleyin. Daha sonra hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri 10 dakika boyunca döndürün.

300 Gs ve oda sıcaklığında, damağı iki mililitre taze, eksiksiz ortamda nazikçe yeniden süspanse etmek için bir P 1000 kullanın. Saydıktan sonra, hücreleri mililitre başına yaklaşık bir kez 10 ila beşinci hücreye seyreltin. Şimdi 500 mikrolitre hücreyi ECM kaplı kapak kızaklarının her birine yerleştirin.

Her bir oyuğa ilave taze tam ortam ekleyin ve ardından plakayı üç ila beş gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreler istenen birleşmeye ulaştığında, her bir oyuğa taze hazırlanmış siklin ekleyin ve karıştırmak için kültür plakasını hafifçe döndürün. Bir haftalık siklin tedavisinden sonra, ortamı toplayın ve hücreleri oda sıcaklığında oyuk başına 500 mikrolitre soğuk,% 4 para formaldehit içinde sabitleyin.

Daha sonra her bir kuyuyu PBS ile üç kez yıkayın ve plakaları dört santigrat derecede saklayın. GLO hücrelerini immünosito kimyası ile görselleştirmek için, önce PBS'yi bloke edici tampon ile değiştirin ve hücreleri oda sıcaklığında inkübe edin. Bir saat sonra, hücreleri oda sıcaklığında en az bir saat boyunca mikroglia işaretleyici IO'ya karşı birincil antiserumlarda inkübe edin ve daha sonra her bir kuyucuğu PBS'de beş dakika boyunca üç kez yıkayın.

Hücreleri uygun floresan konjuge ikincil antikor ile inkübe ettikten sonra, çekirdekleri tanımlamak için hücreleri DAPI ile karşı boyayın. Daha sonra hücreleri az önce gösterildiği gibi yıkadıktan sonra, her bir kapak kızağını ayrı mikroskop slaytlarına monte etmek için montaj ortamını kullanın ve slaytları görsel ve kantitatif analiz için bir floresan mikroskopta görüntüleyin. Siklin muamelesinden sonra, ancak fiksasyondan önce, siklin ile muamele edilen mikroglia'nın fagositik aktivitesini değerlendirmek için, üreticinin ve talimatlara uygun olarak her G OID hücre kültürüne FITC etiketli lateks boncuklar ekleyin.

48 saat sonra, hücreleri az önce gösterildiği gibi PFA'da sabitleyin ve ardından hücreleri gösterildiği gibi immünokimya için işleyin. Son olarak, floresan mikroskobu immünokimyasal ile floresan etiketli boncuklarla birlikte lokalize olan IBO bir pozitif mikroglia sayısını değerlendirin. Mikroglia'nın bir nükleer karşı boyama ile birlikte IO one kullanılarak boyanması, büyük yuvarlak çok çekirdekli hücrelerin tanımlanmasını sağlar.

Birçok durumda, çekirdeğin boyutunun brüt büyümesinin, bu görüntüde gözlemlendiği gibi bu hücrelerin çok çekirdekli durumunu yansıttığına dikkat edin, siklin tedavisi ayrıca, tek çekirdekli mikroglia'nın PHA asidik aktivitesindeki bir artışla ölçülebilen mikroglia'nın genelleştirilmiş bir aktivasyonunu çağrıştırır, yanı sıra çok çekirdekli GLO hücreleri. Bu temsili görüntüde gözlemlendiği gibi, IBO bir pozitif mikroglia'nın PHA Asidik aktif profilleri, oligodendrosit progenitör hücreleri ile ko-kültür sırasında kolayca tanımlanabilir. Bu tekniğin etkileri, siklin tedavisine yanıt olarak bu çok çekirdekli hücrelerin oluşumu GLD nöropatolojisinin tanımlayıcı bir özelliği olduğundan ve bu hücrelerin bu patolojiye katkısı daha önce bu şekilde araştırılmadığından, GLD tedavisine kadar uzanır.