Name: Toplama, İzolasyon, ve İnsan endoservikal Akışı Sitometrik Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Öğrenin, sitobrush örnekleme ile endoservikal hücre izolasyonu ve akış sitometri analizi yöntemlerini. Bu protokol, kadın üreme sağlığı bağışıklık araştırmaları için invaziv olmayan bir teknik sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Nairobi Üniversitesi'ndeki araştırma programının klinik direktörü Joshua Kimani'ye, bu protokolle ilgili mukozal immünoloji çalışmalarına yaptığı yardım için teşekkür eder. Yazarlar, CHVI hibesi MOP 86721'den sağlanan finansmanı kabul etmek ister.

Etik deyimi: Manitoba Üniversitesi&#39;nde ve Nairobi Kenyatta Ulusal Hastane / Üniversitesi&#39;nin hem araştırma etik kurulları bu çalışmayı onayladı ve yazılı bilgilendirilmiş onam tüm katılımcıların elde edilmiştir. 1.. Medya hazırlanması ve CMC Toplama Tüpleri <ol><li> Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi (137,93 mM NaCl, 2.67 mM KCI, 8.1 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2 PO 4) hazırlayın. Kısırlık için Otoklav. Bu birkaç ay boyunca 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Ön kısım 5 ml PBS içine 50 ml şahin tüp (tahsil edilecek numune başına bir) ve 4 º C&#39;de mağaza örnek toplama zamanına kadar. </li><li> Depolama için lavaj toplamak için örnek başına 2-4 cryovials ya da 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri etiketleyin. </li><li> Hücre kültürü ortamı hazırlayın: RPMI 1640 +% 1 penisilin / streptomisin / amfoterisin B (nihai konsantrasyon 100 birim / ml, 100 ug / ml ve 250 ng / ml, respectivFCS yok / FBS&#39;li ely ekledi. </li></ol> Cytobrush Numune 2. Koleksiyonu Cytobrush örneklerinin toplanması eğitimli bir MD veya jinekolog tarafından yapılmalıdır non-invaziv bir işlemdir. <ol><li> Bir cytobrush ve bir tahta veya plastik kazıyıcı ikisi kullanılarak servikal mononükleer hücreleri (CMC) toplayın. (Şekil 1) sıyırıcıyı taktıktan ve servikal os etrafında dönen tarafından spekulum muayenesi altında katılımcıdan CMC&#39;yi toplayın. , Endoservikal os içine cytobrush yerleştirin 360 ° döndürmek ve derhal 5 ml PBS içeren 50 ml şahin tüp içine cytobrush ve kazıyıcı hem yerleştirin. </li><li> Işleme kadar 4 º C / buz örnekleri tutun. Toplama 2 saat içinde hücre canlılığı, süreç örnekleri korumak için. </li><li> Mümkünse, periferik kan mononükleer hücre CMC analizi için bir karşılaştırma / kontrol olarak hizmet etmek (hücre) izolasyon için yeşil üst heparin vacutainers eşleşen kan örnekleri toplamak. </li&gt; </ol> CMC 3. İzolasyonu Çift eldiven ile steril bir biyogüvenlik kabini içinde, bir biyogüvenlik düzeyi 2 laboratuarda örnek işleme gerçekleştirin. <ol><li> Toplama sırasında, CMC örnekleri kan ile kirlenebilir. Nihai numunede PBMC&#39;nin karıştırıcı dahil önlemek amacıyla çalışmadan görünür kan kirlenme örnekleri hariç. Nedeniyle CMC örneklerden izole edilen lenfositlerin düşük sayıda, küçük kan kontaminasyon kolayca CMC lenfosit bileşeni bunaltabilir. </li><li> Fırçalarından hücreleri ayırmak için 45 saniye boyunca cytobrush ve kazıyıcı hem de içeren Vortex şahin tüpler. Örnekler, bu işlem sırasında köpüklü hale gelebilir; Bu normaldir. </li><li> Kazıyıcı kapalı kalan malzemeyi kazımak ve bir çamaşır suyu çözeltisi içine kazıyıcı atmak için cytobrush kullanın. Fırça / kazıyıcı bağlı kalarak herhangi hücreleri toplamak için, başparmak ve işaret parmağı arasında kazıyıcı sıkmak taze bir eldiven kullanın.Hücreleri ve PBS aynı 50 ml tüp tahsil edilecek izin, fırçayı aşağı kaydırın. Bir çamaşır suyu çözeltisi içine cytobrush atmak ve eldiven atın. ÖNEMLİ: Her örnek için yeni bir eldiven kullanın. </li><li> Yeni bir 50 ml şahin tüp 100 mikron naylon hücre süzgeç yerleştirin. Bir transfer pipeti kullanarak, numune tüpten PBS-hücre süspansiyonu toplamak ve temiz bir tüp içine süzgeç içinden geçirilerek filtre edilmektedir. </li><li> Orijinal numune tüpüne RPMI 1640 içinde 5 ml. Transfer pipeti kullanarak, RPMI ile örnek tüpün tarafı yıkayın ve yeni bir toplama tüpüne filtreden aktarın. De RPMI ile naylon filtrenin alt yıkayın. </li><li> 514 x g de 10 dakika süre ile numuneler santrifüjleyin. Bu CMC pelet yerinden ayrılmasını önlemek amacıyla, bu aşama sırasında santrifüj fren bırakmak için çok önemlidir. </li><li> Yavaşça pelet rahatsız değil özen, tüpten çıkarın. Pelet boyutu son derece değişken olacaktır; öylesineDiğer durumlarda, topak zor görünür ve son derece şeffaf iken me örnekleri, topak nedeniyle epitel hücreleri çok sayıda varlığı oldukça büyüktür. </li><li> Falcon tüpün yumuşak çalkalama ile pelet yeniden süspanse edin. Örnek yıkamak için 5 ml PBS ekleyin. </li><li> Herhangi bir santrifüj freni ile 514 x g&#39;de 10 dakika boyunca tekrar santrifüj. </li><li> Dikkatlice süpernatant atın ve yukarıdaki gibi pelet yeniden askıya. Hücreleri (bir PBMC dondurulması protokolünü kullanarak) kriyokoruması, uyarma veya fenotiplen akış sitometri ya için hazırız. </li></ol> 4. CMC Yüzey Boyama ve Sitometrisi <ol><li> 100 ml bloke etme ul aşama 3.10 gelen pelet yeniden süspanse edin ve 96 oyuklu bir plaka ya da FACS tüpü içine ya aktarın. Bloklama çözeltisi (Fcy reseptörleri bloke etmek için) aşağıdaki tarifi: 1.8 ul fare IgG (nihai konsantrasyon 0.2 mg / ml), 5 ul FBS ve 93,2 ul FACS yıkama (PBS +% 2 FBS).Boyama topak boyutları kadar küçük ise, 96 oyuklu bir plaka içerisinde gerçekleştirilebilir, ama granül rutin olarak büyük ise FACS tüpler içinde gerçekleştirilebilir gerekebilir. Bu, buna göre antikor titre etmek için önemlidir. </li><li> 4 ° C&#39;de buz / 10 dakika boyunca numune bloke </li><li> 96 oyuklu plakalar içinde FACS yıkama (PBS +% 2 FBS), 100 ul, FACS ya da tüpler içinde 500 ul hücreleri yıkayın. Üzerinde düşük fren ile 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 600 x g santrifüj (kapalı veya düşük fren ayarı kullanılamaz ise). </li><li> Süpernatantı ve ajitasyon ile hücre pelet yeniden askıya. Canlılığı Leke (Canlı Ölü düzeltilebilir canlılığı boya) ekleyin. Üreticinin talimatlarına uygun olarak canlılığı boya hazırlayın. Her laboratuvar / sitometresiyle kurulumunda kullanılmak üzere titre gerekebilir. 4 ° C&#39;de karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe </li><li> (96 oyuklu plaka / FACS borular için) hücreleri PBS içinde 100 ul μl/500 yıkayın. Düşük / yok frenli 10 dakika boyunca 600 x g&#39;de santrifüj. Supernatan Kaldırt ve tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> 100 ul&#39;lik bir toplam hacimde, yüzey işaretleyici antikor kokteyli ile hücreleri inkübe edin. ÖNEMLİ: Optimize ve boyanma örnek önce panelde sitometri her akışını titre. 4 ° C&#39;de karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe hücreleri </li><li> Adımı 4.5 tekrarlayın. bir FACS tüpü 96 oyuklu bir plaka, transfer hücrelerde boyama ve% 1 paraformaldehid (PFA) içeren FACS yıkama 750 ul&#39;lik nihai bir hacme kadar seyreltin (veya Cytofix 4, 1 &#39;seyreltilmiş). Bir akış Sitometre üzerinde veri toplama devam edin. </li></ol> 5.. Toplama ve Servikal Vajinal Lavajın Hazırlama (CVL) <ol><li> Örnekleme cytobrush önce, steril PBS içinde 2 ml endoserviksten yıkama ve posterior forniksten lavaj aspire için bir şırınga kullanın. </li><li> 15 ml şahin tüp içine aspire lavaj örnek toplamak ve işlenmesine kadar 4 º C / buz üzerinde tutmak. </li><li> Hücresel enkaz kaldırmak için 7 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj örnek. </li><li> Co-70 ° C&#39;de 1 ml ya da 500 ul alikotları ve deposuna süpernatan, kısım örnek llect Alikolar ELISA veya CVL proteinlerin boncuk dizisi analizi için çözülmüş, ancak birden donma / çözülme döngüleri önlemek olabilir. </li><li> Eğer arzu edilirse, üreticinin protokolü izlenerek RNA ekspresyonunu ölçmek için daha sonra RNA hücresel enkaz pelletini. </li></ol> 6.. Veri Toplama <ol><li> Antikor paneli maçlar tazminat tüpler bir dizi hazırlamak. Spektral örtüşme ayarlamak için tazminat tüpler çalıştırın. Bu sitometresi renkli bir akış örnekleri çalıştırın panelde kullanılan florokrom eşlenik antikorlar için yapılandırılır. </li><li> Lenfosit nüfusu tespit etmek için İleri Dağılım&#39;ı (FSC) ve yan dağılım (SSC) voltaj ayarlamak için ilk PBMC&#39;nin örnek edinin. Lineer ölçekte her bir eksen üzerinde 100 onları tutmaya çalışın. Bir PBMC denetimi Koşu önemli ölçüde daha kolay CMC lenfosit nüfusu bulmak için yapacaktır. </li><li> CMC numuneler için FSC eşik düşük FSC değerlerinde SSC eksenini smear nedeniyle PBMC&#39;nin numunelere göre artmış gerekebilir. </li><li> Almadan önce her tüp vorteks. Toplanan lenfosit kapısı olayların sayısını arttırmak için bütün boruyu edinin. Tıkanmasını önlemek için dikkatli makineyi izleyin. </li><li> Böyle FlowJo gibi bir akım sitometri analizi programına İhracat verileri. </li></ol> 7. Yolluk Stratejisi <ol><li> Yüksek İleri yan dağılım (FSC-H) seçin / İleri yan dağılım alanı (FSC-A) tekli nüfusu belirlemek için. </li><li> Edinimi kalitesi kontrol etmek için (örnek olarak FITC) Floresan işaretleyici karşı Saat&#39;i seçin. Akış hızı değişim verilerde eserler taşıyabilirler. Akış hızında farklılık gösteren herhangi bir alan kapsar. </li><li> SSC-A/FSC-A arsa üzerinde lenfosit popülasyonu tespit. Kimlik kolaylaştırmak için bir PBMC&#39;nin kontrolünü kullanın. CMC lenfosit nüfus PBMC kontrolü gibi net olmayabilir unutmayın. &lt;/ Li&gt; <li> SSC-A/viability üzerinde Kapısı canlı hücreler ölü hücreleri hariç boya. Ölü hücreler non-spesifik eserler tanıtacak olan antikorları dahil edebilirsiniz. </li><li> SSC-A/CD3 üzerinde kapı T hücre popülasyonu tespit etmek. Bu kapıdan, CD4 + ve CD8 + popülasyonlarının belirlenmesi. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNAIDS.+Global+Report+2013%5BTitle%5D)+AND+%22http%3A%2F%2Fwww.unaids.org%2Fen%2Fmedia%2Funaids%2Fcontentassets%2Fdocuments%2Fepidemiology%2F2013%2Fgr2013%2FUNAIDS_Global_Report_2013_en.pdf%22%5BJournal%5D)">UNAIDS. Global Report 2013.</a> http://www.unaids.org/en/media/unaids/contentassets/documents/epidemiology/2013/gr2013/UNAIDS_Global_Report_2013_en.pdf. , (2013).</li>
<li>Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+anti-HIV+immune+responses+in+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+reproductive+immunology%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract.</a> Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).</li>
<li>Douek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+disease+progression%3A+immune+activation%2C+microbes%2C+and+a+leaky+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+HIV+medicine+%3A+a+publication+of+the+International+AIDS+Society%2C+USA%22%5BJournal%5D)">HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut.</a> Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).</li>
<li>Hofer, U., Speck, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbance+of+the+gut-associated+lymphoid+tissue+is+associated+with+disease+progression+in+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+immunopathology%22%5BJournal%5D)">Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection.</a> Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).</li>
<li>Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+in+the+female+genital+tract%3A+discrete+influence+of+the+local+mucosal+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+reproductive+immunology%22%5BJournal%5D)">HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment.</a> American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).</li>
<li>Hladik, F., Hope, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+of+the+genital+mucosa+in+women%5BTitle%5D)+AND+%22Current+HIV%2FAIDS+reports%22%5BJournal%5D)">HIV infection of the genital mucosa in women.</a> Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).</li>
<li>Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seminal+fluid+induces+leukocyte+recruitment+and+cytokine+and+chemokine+mRNA+expression+in+the+human+cervix+after+coitus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus.</a> Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).</li>
<li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Productive+HIV-1+infection+of+human+cervical+tissue+ex+vivo+is+associated+with+the+secretory+phase+of+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+immunology%22%5BJournal%5D)">Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle.</a> Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).</li>
<li>St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+activation+and+maturation+induced+by+mucosal+fluid+from+women+with+bacterial+vaginosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis.</a> Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).</li>
<li>Liebenberg, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+transport+of+cervical+cytobrushes+for+isolation+of+mononuclear+cells+from+the+female+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract.</a> Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).</li>
<li>Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+distribution+of+HIV-binding+CCR5+and+C-type+lectin+receptors+in+the+human+endocervical+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa.</a> PloS one. 6, (2011).</li>
<li>Hasselrot, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+and+safety+of+cervical+biopsy+sampling+for+mucosal+immune+studies+in+female+sex+workers+from+Nairobi%2C+Kenya%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya.</a> PloS one. 7, (2012).</li>
<li>McKinnon, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+viable+leukocyte+sampling+from+the+female+genital+tract+for+clinical+trials%3A+an+international+multi-site+study%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study.</a> PloS one. 9, (2014).</li>
<li>Lajoie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+cytokine+and+chemokine+profile+at+the+genital+mucosa+is+associated+with+HIV-1+protection+among+HIV-exposed+seronegative+commercial+sex+workers%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+immunology%22%5BJournal%5D)">A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers.</a> Mucosal immunology. 5, (2012).</li>
<li>Burgener, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Proteomic+Study+Identifies+Serpin+and+Cystatin+Antiproteases+as+Novel+Correlates+of+HIV-1+Resistance+in+the+Cervicovaginal+Mucosa+of+Female+Sex+Workers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteome+research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers.</a> Journal of proteome research. 10, (2011).</li>
<li>Burgener, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systems+biology+examination+of+the+human+female+genital+tract+shows+compartmentalization+of+immune+factor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression.</a> Journal of virology. 87, (2013).</li>
<li>Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-specific+T+cell+responses+detected+in+the+genital+tract+of+chronically+HIV-infected+women+are+largely+monofunctional%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional.</a> Immunology. 139, (2013).</li>
<li>McKinnon, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Human+Cervical+CD4%2B+T+Cell+Subset+Coexpressing+Multiple+Markers+of+HIV+Susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility.</a> Journal of immunology. , (2011).</li>
<li>Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyclonal+expansion+of+cervical+cytobrush-derived+T+cells+to+investigate+HIV-specific+responses+in+the+female+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract.</a> Immunology. 130, 23-33 (2010).</li>
<li>Iqbal, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+T+cell+counts+and+RANTES+expression+in+the+genital+mucosa+of+HIV-1-resistant+Kenyan+commercial+sex+workers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers.</a> The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).</li>
<li>Hirbod, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+CD4+expression+and+local+immune+activation+in+the+ectocervical+mucosa+of+HIV-infected+women%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women.</a> Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).</li>
<li>Horton, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+gene+expression+patterns+and+cell+phenotypes+between+cervical+and+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells.</a> PloS one. 4, (2009).</li>
<li>Begaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+CD4+T+cell+activation+and+in+vitro+susceptibility+to+HIV-1+infection+in+exposed+uninfected+Central+Africans%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans.</a> Retrovirology. 3, 35 (2006).</li>
<li>McLaren, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-exposed+seronegative+commercial+sex+workers+show+a+quiescent+phenotype+in+the+CD4%2B+T+cell+compartment+and+reduced+expression+of+HIV-dependent+host+factors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors.</a> The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).</li>
<li>Card, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Cellular+Susceptibility+to+In+Vitro+HIV+Infection+Is+Associated+with+CD4T+Cell+Quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence.</a> PloS one. 7, (2012).</li>
<li>Prodger, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreskin+T-cell+subsets+differ+substantially+from+blood+with+respect+to+HIV+co-receptor+expression%2C+inflammatory+profile%2C+and+memory+status%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+immunology%22%5BJournal%5D)">Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status.</a> Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).</li>
<li>Reusch, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+microscopy+and+ultrasound+imaging+of+human+cervical+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure.</a> Journal of biomedical optics. 18, (2013).</li>
<li>Oertelt-Prigione, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+and+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity+reviews%22%5BJournal%5D)">Immunology and the menstrual cycle.</a> Autoimmunity reviews. 11, (2012).</li>
<li>Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+serpin+A1+and+A3+levels+in+HIV+highly+exposed+sero-negative+women+are+affected+by+the+menstrual+cycle+and+hormonal+contraceptives+but+are+independent+of+epidemiological+confounders%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+reproductive+immunology%22%5BJournal%5D)">Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders.</a> American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Kadın genital sistem (FGT) de dokunulmazlık ile ilgili bilgide büyük boşluklar göz önüne alındığında, CMC fenotipik analizi serviks birden fazla lenfosit nüfus içine anlayışlar geniş bir dizi sağlayabilir. Proteomik analizi ve servikal lavajında ​​viral yük ölçümleri ile birleştiğinde, cinsel yolla bulaşan enfeksiyonlar (CYBE) ler ve diğer patojenler için bağışıklık çeşitli toplumlarda disseke edilebilir. Teknik hususlar - CMCs: izolasyon ve CMC numunelerin boyama zor olabil...

Yeni HIV enfeksiyonlarının çoğunluğu dünya çapında kadınların 2011 yılında (UNAIDS 1) yeni enfeksiyonların% 47 temsil ile, heteroseksüel iletim yoluyla ortaya çıkar. Kadın genital (FGT), HIV ve diğer cinsel yolla bulaşan patojenler için ana giriş portallarından birini anlamak, enfeksiyonu önlemek için etkili stratejiler bulmak için yolda yüksek önem taşımaktadır. Genital mukoza bağışıklık karşılıkları da açık bir şekilde benzersiz ve periferik kan 2 ölçülen farklıdır. Ancak, FGT de bağışıklık dinamikleri mevcut bilgi en iyi sınırlıdır. Bugüne kadar, mukozal bağışıklık çevre çalışmaları büyük ölçüde enfeksiyonu takiben mukozal dokularda erken olaylar sonraki hastalığın ilerlemesi 3,4 üzerinde güçlü bir etkiye sahip olduğunu açık hale gelmiştir gut-ilişkili lenfoid dokularda (GALT), odaklanmıştır. Genital mukoza numune toplama büyük bir sorun teşkil etmektedir ve lak için en azından kısmen sorumludurFGT ve immünoloji anlayış k. FGT bu yerel örnekler toplamak ve analiz etmek için etkili yöntemler gerektiren olan farklı çevre bağlamında ev sahibi ve patojen arasındaki bağışıklık dinamiğin bulmaca çözme. FGT iki bölüme ayrılır: fallop tüpleri, endometrium ve endoserviksten ve ektoservikste içeren alt sistem ve vajina içeren üst üreme yolları (Kaushic tarafından gözden vd 5). Bu farklı sitelerde nispi katkısı HIV enfeksiyonuna ne hala belirsiz olduğunu, ancak her iki site HIV girişi 6 katkı verebilecek düşünülmektedir. T hücreleri, makrofajlar (Rodriguez-Garcia et al yorumlanan 2) yaklaşık 10% &#39;sini, üst ve alt üreme yolları olarak lökositlerin% 40-50 temsil eder. T hücreleri, vajina, rahim ve endometriyumda tespit edilebilir. Makrofajlar, daha güçlü olan localiher ikisi de dokularda tespit edilebilir, ancak, serviks daha endometriyum ve myometrial bağ dokusunda zed. Son olarak, plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) ve Langerhans hücreleri de FGT dokularda tespit edilebilir. Fenotip ve bağışıklık nüfus ve HIV enfeksiyonuna karşı duyarlılık oranları hormonal döngülerine göre önemlisi değişebilir, hormonal kontraseptifler, bakteriyel vajinozis veya cinsel faaliyetler 5,7-9 kullanımı. Çeşitli yöntemler FGT bağışıklık nüfus ve çalışma ortamı için geliştirilmiştir. Servikal biyopsi, servikal cytobrushes ve servikovaginal lavajlar (CVL) 10-12 en sık literatürde genelinde kullanılmaktadır. PBS lavaj ile CVL toplama en kolay metodu olarak ve son derece düşük bir hücre verimle immün modülatör proteinlerin ancak sonuç çalışma sağlar ve bu nedenle FGT 13&#39;ün bağışıklık hücresi popülasyonlarının çalışmak için uygun değildir. CVL örnekleri, diğer taraftan, v olanELISA, sitokin boncuk dizi 14 ya da kütle spektrofotometresi 15,16 gibi yöntemler kullanılarak, çeşitli sitokinler, kemokinler ya da antimikrobiyal faktörlerin ekspresyonunu ölçerek FGT bağışıklık çevre değerlendirmek için yararlı ery. Immün hücre frekansları, fenotipler ve işlevleri karakterizasyonu servikal cytobrush veya servikal biyopsi örnekleme ile servikal mononükleer hücreleri (CMC) toplanması ile elde edilebilir. Servikal biyopsi örnekleme kanama rahatsızlık ve riskini artırır ve kadının 12 bağışıklık durumuna bağlı olarak prosedürü takip iyileşmek için 2 ila 11 gün sürer invaziv bir yöntemdir. Öte yandan, servikal cytobrushes toplandı, hücre alt verim rağmen FGT bağışık hücreleri toplamak için daha az invaziv ve daha uygun bir yöntemdir. Her iki yöntem de CD45 + lökositlerin aynı verimi ulaşabilir, ancak iki ardışık servikal cytobrushes ihtiva ettiği hücre aynı miktarda elde etmek için gerekli olan in bir biyopsi 13. Bununla birlikte, yine, 14 numune cytobrush akış sitometrisi ile daha da ex vivo feno hücre kabul edilebilir bir sayısı (yaklaşık 5000 CD45 + hücre / cytobrush) sağlamaktadır. Uyarılması ve hücre içi akış sitometrisi veya QPCR HIV spesifik immün tepkilerini 17 ya da hücre Th polarizasyonunu 18 tespit etmek cytobrush türevli CMC kullanılarak gerçekleştirilmiştir edilmiş olarak aynı zamanda, fonksiyonel karakterizasyonu, bu numuneler üzerinde ifa edilebilir. T hücreleri nüfusunun genişleme aynı zamanda CMC lerin 19 ile işlevsel çalışmalar kolaylaştırabilir. Bu biyopsiler ve cytobrushes FGT belirgin bölümlerini örnek olduğuna dikkat etmek önemlidir. Servikal cytobrushes endoserviksten ve muhtemelen transformasyon bölgesinin epitel türetilen hücrelerin toplanması, serviks örnek ise biyopsileri, ektoservikste 12,13 epiteli ve stroma üstün kısmından türetilmiştir. Cytobrush örnekler bu nedenle yeniden örnekbiyopsiler, bir skuamöz tabakalı epitelyum 5 ile kaplı bir bölge dahil ederken gion, kolumnar epitel tek bir tabaka oluşur. Bunun bir sonucu olarak, servikal biyopsi ve cytobrush tarafından toplanan lökosit popülasyonları doğası farklıdır. Cytobrushes CD14 + monositler / makrofajlar 13 daha yüksek bir oranda bir araya gelmesinden ise Biyopsiler, CD3 + T hücrelerinin daha yüksek bir oran toplamak. FGT immünolojisini incelenmesi uzun yıllar 20-22 bir ilgi oldu ve biz cytobrush türetilmiş CMC çalışma ile uzmanlık büyük bir birikimi var. Bizim çalışmalar, HIV ile enfekte enfekte ve HIV-seronegatif maruz Nairobi, Kenya (HESN) kadın seks işçileri çalışma çoğunlukla odaklanmak. HIV tercihli olarak FGT HIV tarafından hedeflenebilir aktive edilmiş hücre 23 ve daha düşük sayılar HIV satın karşı korunmasına katkıda bulunabilir, aktive edilmiş T hücrelerinde çoğaltır. Bu hipoteze göre, birkaç Studi doğrultusundaes henüz 24,25 enfekte kalır ve bu hareketsiz fenotip de FGT 14 gözlenen yüksek HIV maruz HESN seks işçileri arasında düşük bağışıklık aktivasyonunu tarif var. Burada, işleme için bir yöntem tarif ve ex vivo akış sitometrisi ile servikal cytobrushes türetilen CMC örneklerde T hücrelerinin aktivasyonunun değerlendirilmesi.

<table><tbody><tr><td>100 ve mu; 50 ml Falcon tüpü</td><td>BD</td><td>352360</td><td>CMC işleme</td>için m hücre süzgeci</tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30027.01</td><td>CMC işleme</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Life teknolojisi</td><td>16000044</td><td>CMC işleme</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Life teknolojisi</td><td>15290-018</td><td>CMC işleme</td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P4333-20ml</td><td>CMC işleme</td></tr><tr><td>50 ml Falcon tüpü</td><td>Fisher</td><td>14-959-49A</td><td>CMC işleme</td></tr><tr><td>Kan Bankası tek kullanımlık transfer pipeti</td><td>Fisher</td><td>13-711-6M</td><td>CMC işleme</td></tr><tr><td>Cytobrush plus</td><td>Cooper cerrahi</td><td>C0121</td><td>CMC örnekleme</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık servikal kazıyıcı</td><td>Hızlı tıbbi</td><td>2183</td><td>CMC örnekleme</td></tr><tr><td>15 ml Falcon tüp</td><td>Fisher</td><td>14-959-70c</td><td>CVL işleme</td></tr><tr><td>1.5 ml tüp Eppendorf</td><td>Fisher</td><td>05-402-18</td><td>CVL depolama</td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Hücre Leke Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>Çeşitli</td><td>Akış sitometrisi reaktifi</td></tr><tr><td>Fiksasyon tamponu (% 4 PFA)</td> <td>BD</td><td>554655</td><td>Akış sitometrisi regeant</td></tr><tr><td>IgG fare</td><td>Sigma</td><td>I8765</td><td>Akış sitometrisi regeant</td></tr></tbody></table>

toplama, İzolasyon, ve İnsan endoservikal akışı sitometrik analizi

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Mukozal patojenlerin (HIV dahil) halk sağlığı açısından önemine rağmen, özellikle kadın genital sisteminde (FGT) mukozal bağışıklık hakkında nispeten az şey bilinmektedir. Heteroseksüel bulaşma artık HIV bulaşmasının baskın mekanizmasını temsil ettiğinden ve cinsel yolla bulaşan enfeksiyonların (CYBE) sürekli yayılması göz önüne alındığında, genital mukozadaki konakçı ve patojen arasındaki etkileşimi anlamak kritik öneme sahiptir. FGT bağışıklığı ile ilgili bilgilerdeki önemli boşluklar, kısmen mukozal örneklerin başarılı bir şekilde toplanması ve işlenmesindeki zorluktan kaynaklanmaktadır. Yeterli örneklem büyüklüğü ile yapılan çalışmaları kolaylaştırmak için toplama tekniklerinin minimal invaziv ve verimli olması gerekmektedir. Bu amaçla, servikal sitofırça örneklerinin toplanması ve ardından servikal mononükleer hücrelerin (CMC) izolasyonu için bir protokol optimize edilmiştir. Ex vivo akış sitometrisi tabanlı immünofenotipleme kullanılarak, CMC lenfosit/monosit popülasyon frekanslarını ve fenotiplerini doğru ve güvenilir bir şekilde ölçmek mümkündür. Bu teknik, tümü vajinadaki anti- veya pro-inflamatuar ortamı belirlemek için kullanılabilen sitokinler, kemokinler ve anti-proteazlar dahil olmak üzere çözünür bağışıklık aracıları içeren servikal-vajinal lavaj (CVL) toplanması ile birleştirilebilir.

Multiparametreli akış sitometri önce karakterize dokularda hücre alt fenotipleri ve fonksiyonlarını incelemek için güçlü bir araçtır. CMC örneklerinin analizi, uygun yolluk stratejileri ile lenfosit ve monosit nüfus hem de bilgi verebilir. Temsili bir CMC yolluk bir strateji, bir eşleştirilmiş PBMC profili ile karşılaştırıldığında, Şekil 2 'de gösterilmiştir. FSC-H grafiği FSC-A daha sonra filtrasyon, PBMC ile karşılaştırıldığında CMC örneklerde oldukça yaygın olan hücre çif...

Endoserviksten lenfositleri ve monositleri toplamak için sitobrush örneklemesinin kullanılması, kadın genital sistem bağışıklığının analizi için örnekler sağlayan minimal invaziv bir tekniktir. Bu protokolde, akım sitometri testleri için sitobrush örneklerinin toplanmasını ve immün hücre izolasyonunu tarif ediyoruz.

Toplama, İzolasyon, ve İnsan endoservikal Akışı Sitometrik Analizi

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Bu prosedürün genel amacı, servikal mononükleer hücreleri bir sito fırça kullanarak endoservikal kazımadan izole etmektir. İzole edildikten sonra, bu hücreler, kadın genital sistemindeki bağışıklık hücrelerinin fenotipini ve işlevini belirleyebileceğiniz akış sitometrisi de dahil olmak üzere birçok testte kullanılabilir. Sito fırça ve servikal lavaj örneklerinin toplanması, bir jinekolog veya eğitimli bir doktor tarafından yapılması gereken, invaziv olmayan bir prosedürdür.Servikal vajinal lavaj ilk olarak endoserviksin iki değirmen PBS ile yıkandığı ve daha sonra lavajı takiben posterior forniksten toplandığı yerde gerçekleştirilir. Bir servikal kazıyıcının içbükey ucu servikse karşı yerleştirilir ve servikal açıklığı veya servikal os'u örneklemek için döndürülür. Daha sonra, sito fırçası Endoservikal OS'ye yerleştirilir ve 360 derece döndürülür.Hafif basınç kullanılması, numunenin kanla kirlenmemesini sağlamaya yardımcı olacaktır. Sıyırıcıdaki cyto fırçası, beş mil PBS içeren bir tüpe toplanır. Buz üzerinde taşındıktan sonra, numune, hücreleri sito fırçasından ayırmak için hızla girdaplanır.Numuneleri ortamla yıkadıktan sonra, yüz mikronluk naylon filtreden süzülürler. Bu, numune

collection-isolation-flow-cytometric-analysis-human-endocervical

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Burada, intraepitelyal gama delta T hücrelerinin analizi için insan endoservikal intraepitelyal lenfositlerini elde etmek için bir izolasyon yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol, endoservikal gama delta T hücrelerinin manyetik boncuklar veya hücre sınıflandırması ile saflaştırılması için genişletilebilir.

İnsan Endoservikal Gamma Delta T Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Biz burada yalıtmak ve phenotypical ve fonksiyonel özellikleri değerlendirilmesi için insan kadın üreme sistemi içinde farklı anatomik bölmeleri dendritik hücrelerden arındırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem diğer bağışıklık hücreleri veya diğer Mukozal doku dendritik hücrelerden yalıtmak için adapte edilebilir.

İnsan dişi üreme yolu dendritik hücreler yalıtım Phenotypical ve fonksiyonel çalışmaları için

Tümör endotel hücrelerinin tümör microenvironment önemli belirleyicileri ve hastalığın seyrini vardır. Burada, saf ve uygun endotel hücre insan kolorektal karsinom ve uyuşturucu testi ve Patogenez araştırmalarda kullanılmak üzere normal kolon yalıtımı için bir protokol açıklanmıştır.

Yalıtım Normal kolon ve kolorektal Karsinom - gelişmiş bir iletişim kuralı üzerinden insan endotel hücrelerinin

Bu iletişim kuralı bir yöntem için birincil insan decidual hücreleri çeşitli uygulamalar (Yani immunocytochemistry, Akış Sitometresi, vb) için kullanılan terim placentae fetal membranlar toplanan yalıtım gösterir hedefleyen farklı hücre popülasyonlarının gebelik komplikasyonları olarak rol çalışmak için.

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

Burada monosit alt kümeleri tam kan akış sitometresi tarafından karakterize için bir iletişim kuralı mevcut. Bu nasıl alt kümeleri kapı ve onların ifade yüzey işaretlerinin değerlendirmek özetleyen ve M1 (iltihabi) ve M2 işaretleri (anti-inflamatuar) ifadesi değerlendirme bir örnek vererek içerir.

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Hydatidiform benler, morfolojik özelliklerine ve molar genomlara ebeveyn katkısına göre sınıflandırılabilen heterojen etiyolojileri olan anormal insan gebelikleridir. Burada formalin-sabit parafin gömülü azı laksamalarının multipleks mikrouydu DNA genotipleme ve akış sitometrisi protokolleri, sonuçların yorumlanması ve entegrasyonu ile birlikte ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Formalin-sabit Parafin gömülü Hydatidiform Molar Dokuların Mikrouydu DNA Genotipleme ve Akış Sitometri Ploidy Analizleri

Bu, uterus lenfoid hücrelerini hem hamile hem de hamile olmayan farelerden izole etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, FACS fenotipleme, hücre sıralama, işlevsel tahliller, RNA-seq ve proteomik gibi birden çok aşağı akış uygulaması için kullanılabilir. Buradaki protokol, akış sitometrisi ile kandine doğuştan gelen lenfoid hücrelerin fenotip grup 1 rahiminin nasıl olduğunu göstermektedir.

Akış Sitometrisi ile Analiz için Uterus Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin İzolasyonu

Mevcut protokol, insan sperminde apoptozis, mitokondriyal membran potansiyeli ve DNA hasarının tek bir sitometre ile ölçülmesine olanak sağlayan pratik bir çözüm sunmaktadır.

İnsan Sperm Fonksiyonel Kusurlarını Tespit Etmek için Biyobelirteçlerin Akış Sitometrik Analizi

Bu makalede, hücresiz DNA ve dolaşımdaki tümör hücreleri gibi maddeleri tam kandan kolayca ve verimli bir şekilde ayırmak ve toplamak için otomatik ekipmanın uygulanması açıklanmaktadır.

Kanserle İlgili Maddelerin Klinik Örneklerden Otomatik Olarak Ayrılması ve Toplanması

Bu protokol, insan fallop tüpü epitel hücrelerinin izolasyonu için bir günlük bir yöntemi tanımlar. İzole epitel hücreleri, 2 boyutlu (2D) kültürde kaplanabilir veya tek hücreli süspansiyonlara ayrılabilir ve akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilimi dahil olmak üzere aşağı akış deneylerinde kullanılabilir.

Tek Hücreli Analizler için İnsan Fallop Tüpü Epitelinin Çıkarılması İçin Etkili Bir Yöntem

Öğrenin, sitobrush örnekleme ile endoservikal hücre izolasyonu ve akış sitometri analizi yöntemlerini. Bu protokol, kadın üreme sağlığı bağışıklık araştırmaları için invaziv olmayan bir teknik sunar.

Toplama, İzolasyon, ve İnsan endoservikal Akışı Sitometrik Analizi

Daha fazla video keşfet