Toplama, İzolasyon, ve İnsan endoservikal Akışı Sitometrik Analizi

Bu prosedürün genel amacı, servikal mononükleer hücreleri bir sito fırça kullanarak endoservikal kazımadan izole etmektir. İzole edildikten sonra, bu hücreler, kadın genital sistemindeki bağışıklık hücrelerinin fenotipini ve işlevini belirleyebileceğiniz akış sitometrisi de dahil olmak üzere birçok testte kullanılabilir. Sito fırça ve servikal lavaj örneklerinin toplanması, bir jinekolog veya eğitimli bir doktor tarafından yapılması gereken, invaziv olmayan bir prosedürdür.

Servikal vajinal lavaj ilk olarak endoserviksin iki değirmen PBS ile yıkandığı ve daha sonra lavajı takiben posterior forniksten toplandığı yerde gerçekleştirilir. Bir servikal kazıyıcının içbükey ucu servikse karşı yerleştirilir ve servikal açıklığı veya servikal os'u örneklemek için döndürülür. Daha sonra, sito fırçası Endoservikal OS'ye yerleştirilir ve 360 derece döndürülür.

Hafif basınç kullanılması, numunenin kanla kirlenmemesini sağlamaya yardımcı olacaktır. Sıyırıcıdaki cyto fırçası, beş mil PBS içeren bir tüpe toplanır. Buz üzerinde taşındıktan sonra, numune, hücreleri sito fırçasından ayırmak için hızla girdaplanır.

Numuneleri ortamla yıkadıktan sonra, yüz mikronluk naylon filtreden süzülürler. Bu, numuneden lenfositlerin, monositlerin ve epitel hücrelerinin toplanmasına izin verir. Hücreler artık yüzey proteinlerine karşı antikorlarla boyanmaya hazırdır ve bir kez sabitlendikten sonra akış sitometresinde çalıştırılabilirler.

Servikste bulunan hem CD dört hem de CD sekiz T hücresi popülasyonlarının fenotipini değerlendirmek için elde edilen verileri nasıl analiz ettiğimizi size göstereceğiz. Merhaba, ben Dr.Keith halk laboratuvarında doktora öğrencisiyim. Araştırmamız, bağışıklık aktivasyonu ile HIV duyarlılığı ile hastalığın ilerlemesi arasındaki bağlantıya odaklanmaktadır.

HIV enfeksiyonlarının çoğu artık heteroseksüel ilişki yoluyla meydana geldiğinden, kadın genital sistemine HIV bulaşmasıyla korunma ilişkilerini belirlemekle de ilgileniyoruz. Ne yazık ki, genital sistemden örneklerin toplanması, çalışma katılımcıları için oldukça invaziv olduğu kadar çok zor da olabilir. CMC'leri veya servikal mononükleer hücreleri toplamak için sito fırçaların kullanılması, biyopsi gibi diğer protokollere kıyasla daha hızlı ve daha kolay bir yöntemdir.

Bu videoda, akış sitometrisi veya diğer aşağı akış uygulamalarında kullanılmak üzere CMC'leri nasıl izole edeceğinizi ve hazırlayacağınızı göstereceğiz. Toplandıktan sonra, cyto fırça ve sıyırıcı beş mil soğuk PBS'de taşınır. Numunelerin, numune alındıktan sonra en fazla iki saat olması gereken işleme zamanına kadar buz üzerinde taşınması önemlidir.

Bu noktada kan izleri ile kontamine olmuş herhangi bir numune, hücreleri cyto fırçasından ayırmak için daha fazla analizden çıkarılmalıdır. Tüpü 45 saniye boyunca yüksekte vorteksleyin, çünkü hücreler hala cyto fırçası ve sıyırıcı üzerinde kalacaktır. El ile kaldırılmaları gerekir.

Yeni bir çift eldiven giyin ve sıyırıcıdan kalan malzemeleri kazımak için cyto fırçasını kullanın. Bir ağartıcı solüsyona attıktan sonra, şahin tüpünün üzerinde yukarı ve aşağı sıkarak cyto fırçasından kalan tüm hücreleri çıkarmak için baş parmağınızı ve işaret parmağınızı kullanın. Sito fırçasını attıktan sonra, başka bir numune hazırlamadan önce eldivenlerinizi değiştirin, tüpün kenarlarını PBS ile yıkamak için bir transfer pipeti kullanın ve tüm numunenin toplandığından emin olun.

Yüz mikron naylon sığdırın. Yeni bir Falcon tüpü üzerinde filtreleyin ve PBS çözeltisinin tüm hacmini filtrelemek için pipeti kullanın. Orijinal tüpe FBS'den yoksun beş mil RPMI ortamı ekleyin.

Yapışan mukus veya kalıntıları gidermek için tüpün kenarlarını iyice yıkamak için pipeti kullanın. Ardından ortamı filtreden geçirin. Çamaşır suyuna atmadan önce filtrenin altını yıkamak için filtrelenmiş ortamın bir kısmını kullanın.

İzole edilmiş hücreleri peletlemek için. Peletin yerinden çıkmasını önlemek için numuneleri 1500 r pm'de 10 dakika santrifüjleyin. Hücreler akış sitometrisi için kullanılacaksa santrifüj frenini kapatmayı unutmayın.

Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için gerekli bloke edici çözeltiyi hazırlayın. Santrifüjleme adımı sırasında, numune başına 100 mikrolitre bloke edici çözelti kullanın. Engelleme çözeltisi 93,2 mikrolitre faks, yıkama veya PBS artı %2 FBS, beş mikrolitre FBS ve 1,8 mikrolitre fare IgG içerir.

Döndürmeden sonra, canlı hücrelere sahip çoğu numune, görünür bir topağa sahip olacaktır. Bazı durumlarda, pelet oldukça büyük olacaktır. Diğer örneklerde ise zar zor görülebilir.

Pelet boyutu her zaman hücre verimi ile ilişkili değildir. Hücreleri rahatsız etmediğinizden emin olmak için süpernatanı dikkatlice kandırın, hafif çalkalama ile peleti yeniden süspanse edin. Hücreleri beş mil PBS ile yıkayın ve santrifüjlemeyi 1500'de 10 dakika boyunca tekrarlayın.

Kopma ile RRP M, bir kez daha, süpernatanı boşaltın ve peleti daha önce olduğu gibi yeniden askıya alın. Bu noktada, hücreler boyamadan önce kriyoprezerve edilmeye veya yüzey boyanmaya hazırdır Floresan antikorlarla, hücreleri daha önceki bir santrifüjleme sırasında hazırlanan bir bloke edici solüsyon ile inkübe ederek spesifik olmayan bağlanmayı bloke etmek faydalıdır. Hücre peleti yeniden süspanse edildikten sonra, numuneye yüz mikrolitre bloke edici çözelti ekleyin ve iyice karıştırın.

Kalan protokol adımları, 96 oyuklu bir plaka veya faks tüpünde gerçekleştirilebilir. CMC peletinin boyutuna bağlı olarak. Blokaj solüsyonunu ve hücre karışımını bir faks tüpüne aktarın.

Numuneyi dört santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. 10 dakikalık inkübasyon sırasında, canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için kullanılacak canlılık boyasını hazırlayın. Veri analizi sırasında, canlılık boyasını üreticiye göre hazırlayın ve gerektiği gibi ön titre edin.

Boya karışımını kullanıma hazır olana kadar ışıktan kapalı tuttuğunuzdan emin olun. 10 dakikalık inkübasyondan sonra, hücreleri 500 mikrolitre faks, yıkama veya PBS ile% 2 FBS ile yıkayın ve ardından 1600 RPM'de 10 dakika santrifüjleyin. Döndürdükten sonra, süpernatanı faks tüpünden boşaltın.

Hücreleri çalkalayarak yeniden askıya alın. Şimdi daha önce hazırlanmış olan canlılık boyasının uygun hacmini ekleyin. Hücreleri dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin, teneke içine sararak numunelerin ışıktan kapalı kalmasını sağlayın.

Bu inkübasyon sırasında, hücreleri etiketlemek için kullanılacak olan floresan antikorların ana karışımını hazırlayabilirsiniz. Antikorlarınızı CMC'lerde kullanmadan önce periferik kan kontrol örneklerinde önceden titre ettiğinizden ve doğruladığınızdan emin olun. Titre edilmiş antikorları karıştırın ve numune başına yüz mikrolitrelik bir nihai hacme getirin.

Faks ile yıkayın, bu adımlar sırasında tüm antikorları ışıktan koruyun. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, bir kez daha, numuneyi 500 mikrolitre faks, yıkama, santrifüj, boşaltıcı ile yıkayın ve hücreleri daha önce olduğu gibi yeniden süspanse edin. Şimdi, önceki inkübasyon sırasında hazırlanan 100 mikrolitre antikor kokteyli ile hücreleri inkübe etme zamanı.

Bir kez daha, numuneleri dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin ve ışıktan korunduklarından emin olun. Kuluçka CMC'leri artık son kez 500 mikrolitre PBS ile yıkanmaya hazırdır. Numuneyi 1600 RPM'de 10 dakika santrifüjleyin.

Peletin boşaltılmasından ve tekrar süspanse edilmesinden sonra, hücreleri %1'lik bir paraldehit çözeltisi içinde 750 mikrolitrelik son hacimde seyreltin. Bunları düzeltmek için, akış sitometresinin tıkanmasını önlemek için bu büyük hacimdeki hücreleri yeniden askıya almak önemlidir. Bu hacimde bile, numune tüpü oldukça bulanık görünebilir.

Hücreleri, akış sitometresinde elde edilene kadar karanlıkta dört santigrat derecede tutun. Sito fırça örneğine ek olarak, serviks ve vajinadan rutin olarak iki mil PBS lavajı topluyoruz. Bu numune, lavajdaki hücresel kalıntıları gidermek için yedi dakika boyunca 1400 RPM'de santrifüjlenir.

Kalan süpernatan daha sonra çözünür protein konsantrasyonunun gelecekteki analizi için eksi 80 santigrat derecede tahsis edilebilir ve dondurulabilir. Bu veriler, akış sitometrisi ile elde edilen hücresel fenotip verileriyle kombinasyon halinde özellikle yararlı olabilir. CMC örneğinizi çalıştırmadan önce.

Spektral örtüşmeyi ayarlamak için boncuklar veya tek leke hücreleri kullanarak, çalışma kompanzasyon tüplerinin kapılanmasına yardımcı olmak için PBMC kontrollerinin hazırlanması yararlıdır. PBMC örneklerine kıyasla tüm olayları toplamak için tüm CMC tüpünü edinin. CMC'ler, bir FSC alanında yükseklik grafiğine karşı daha fazla çift sergileyecektir ve pbmc kadar belirgin bir lenfosit popülasyonu sergileyemeyebilir.

Örneklerinizi aldıktan sonra, dosyaları analiz için FlowJo gibi bir programda dışa aktarın. Burada, CMC'den türetilmiş CD dört pozitif ve CD sekiz pozitif T hücreleri için tipik bir geçit stratejisinin ana bileşenlerini göstereceğiz. Numunenizdeki tekiller üzerinde G için bir FSC alanına karşı yükseklik grafiği kullanın.

Bu eşleşen karşılaştırmada, p BMC'lere kıyasla bir CMC örneğindeki artan çift sayısını açıkça görebilirsiniz. Daha sonra, zamana karşı bir floresan işaretleyici veya FSC çizmek bir kalite kontrol adımı olarak hizmet eder. Akış hızındaki herhangi bir değişiklik verilere yapıtlar eklediyse, bunlar bu adımda kaldırılabilir.

Üst kısımda, yüksek kaliteli bir numunenin göstergesi olan zaman içinde tutarlı bir floresan profili görebilirsiniz. Aşağıda, daha fazla analizden hariç tutulabilecek çoklu kesintilere ve akış hızına sahip bir örnek görebilirsiniz. CMC örneklerinde lenfosit popülasyonunun tanımlanması zor olabilir.

A-P-B-M-C kontrolünü kullanmak yürüyüş yerleştirmeye yardımcı olacaktır. Gördüğünüz gibi, bazı örnekler büyük berrak popülasyonlar sergilerken, diğer örnekler lenfosit popülasyonlarından yoksundur. Toplamda, bu örnekler hariç tutulmalıdır.

Her ne kadar lenfosit popülasyonlarına odaklanacağız. Soy belirteçlerinin ekspresyonundan yoksun hücreler üzerinde geçit oluşturarak monositler üzerinde g yapmak da mümkündür. Dendritik hücre ve CD 16 ve CD 11 C gibi monosit belirteçlerinin kombinasyonlarını eksprese eden hücreleri tanımlamak mümkündür.

Gördüğünüz gibi, CMC lenfositlerinin çoğu yaşayabilir, ancak bazı numuneler analizden çıkarılması gereken yüksek frekanslarda ölü hücreler içerir. Ölü hücreler, lenfosit yürüyüşü içinde spesifik olmayan bir şekilde antikor alabilir ve veri analizini karıştırabilir. CD üç boyaması sağlam olmalıdır.

CD üç pozitif T hücrelerinin oranı, PBMC örneklerinden daha düşük ve daha değişkendir, bu nedenle tüm CMC örneğini elde etmek ve toplanan olay sayısını en üst düzeye çıkarmak çok önemlidir. CD dört pozitif ve CD sekiz pozitif T hücresi popülasyonları, TBMC örneklerinde olduğu gibi tanımlanabilir. Bazı CMC örneklerinde.

CD dört ila CD sekiz oranı periferik kanda gözlenenden daha düşüktür ve bazı bireyler büyük bir çift negatif T hücresi popülasyonu sergiler. CD dört pozitif ve CD sekiz pozitif T hücre popülasyonlarını tanımladıktan sonra, çok sayıda fenotipik markörün ekspresyonunu ölçmek mümkündür. CMC'lerde CD 1 61 ekspresyonu saptanabilmesine rağmen, kanda belirgin olan CD 1 61 parlak popülasyonu genital sistemde yoktur.

Benzer şekilde, CD 69 ve H-L-A-D-R gibi aktivasyon belirteçlerinin yanı sıra CCR beş ve PD bir gibi belirteçlerin ekspresyonu CMC numuneleri arasında güvenilir bir şekilde ölçülebilir ve miktar tayin edilebilir. Sito fırça örneklerinin kullanılması, özellikle bulaşıcı hastalıklar bağlamında, mukozal bağışıklık hücrelerinin hem fenotipini hem de işlevini karakterize etmemizi sağlar. Bu bize sadece mukozal ve üreme immünolojisini düzenleyen mekanizmalar hakkında daha fazla bilgi vermekle kalmaz, aynı zamanda mukozal aşı etkinliğinin yeni ölçümlerinin geliştirilmesi için temel sağlar.